防除连作棉花黄萎病的拮抗菌及用其微生物有机肥料

摘要

本发明涉及用于防除棉花黄萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了对棉花黄萎病病原细菌有显著拮抗作用的两种拮抗菌(枯草芽孢杆菌NJHJ－5和枯草芽孢杆菌NJDF－14)，利用该拮抗菌与有机堆肥制成微生物有机肥料，肥料中分别含有1×109个/g以上的NJHJ－5和NJDF－14、全氮含量为4～5％(90％以上为有机氮)，总氮磷钾养分为6～10％、有机质含量为30～35％。试验表明，这种微生物有机肥料施入土壤后能够使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成优势群，连续3季施用微生物有机肥使原本发病率高达60％以上的土壤中棉花黄萎病防治率达到100％。

说明书

一、技术领域

本发明涉及能防除连作棉花黄萎病的拮抗菌及用其制成的微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术领域，专用于克服和消除连作棉花黄萎病问题。

二、背景技术

棉花(Gossypium spp.)是一种重要的经济作物，是纺织工业的天然原料。目前，棉花黄萎病(Coton Verticillium Wilt)是棉花病害中对棉花产量威胁最大的病害之一，它是一种经土壤传播的维管束病害病害。1914年Carpenter首次报道在美国弗吉尼亚发现棉花黄萎病，随后在密西西比、阿肯色、得克萨斯、新墨西哥和加利福尼亚等州陆续报道了黄萎病的发生和危害情况，目前，这一种病害已经遍布全世界主要产棉区。在我国，上世纪80年代该病只在小范围内爆发，20世纪90年代以来，棉花黄萎病逐年加重，并造成严重的经济损失，尤其在1993、1995、1996、2003年大面积发生，发病面积约占全国植棉面积的一半。

另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥的原料；大量的养分资源(C、N、P、K、S及微量元素)流失于土壤-植物系统之外，明显地削弱了我国农业可持续发展的能力。如何将从土壤中因收获作物取走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥，再施入土壤。如果将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用于功能菌的载体，所制成的微生物有机肥料功能明确，将会有很好的应用前景。

三、发明内容

1.技术问题

本发明的目的在于研制一种能防除棉花黄萎病的拮抗微生物有机肥料，防治效率达到80％以上，使大量的连作障碍土壤得到生物修复，确保集约化农业的顺利发展。

2.技术方案

用于防除连作棉花黄萎病的拮抗菌，包括菌株NJHJ-5和菌株NJDF-14，其中，

菌株NJHJ-5属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，2009年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.3301，主要生物学特性为：革兰氏染色阳性G⁺，细胞形状为杆状，芽孢中生或近中生，椭圆形，孢囊不膨大，没有伴孢晶体；接触酶阳性，氧化酶阳性，甲基红试验阳性，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性，能够利用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇等多种碳源生长，最适生长温度37℃，最适pH为7.2；在LB培养基上的菌落为圆形，边缘不规则，白色，不产生色素，菌落中间褶皱突起(菌体形态具体见图1)。

菌株NJDF-14属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，2009年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.3302，主要生物学特性为：革兰氏染色阳性G⁺，细胞形状为杆状，芽孢中生或近中生，椭圆形，孢囊不膨大，没有伴孢晶体；接触酶阳性，氧化酶阳性，甲基红试验阳性，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性，能够利用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇等多种碳源生长，最适生长温度37℃，最适pH为7.2；在LB培养基上的菌落为圆形，边缘不规则，白色，不产生色素，菌落中间平滑无褶皱突起(菌体形态具体见图1)。

用上述拮抗菌所生产的防除连作棉花黄萎病的微生物有机肥料，其特征在于：该肥料中分别含有1×10⁹个/g以上的拮抗菌NJHJ-5和NJDF-14、全氮质量比含量为4～5％，全氮中质量比90％以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6～10％、有机质质量比含量为30～35％。

所述防除连作烟草青枯病的微生物有机肥料的生产方法，包括：

1)将菌株NJHJ-5和菌株NJDF-14分别接种到改良的PDA培养液中，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0-7.2，培养温度30-38℃，搅拌速度为170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵的拮抗菌液含菌或芽孢量≥5×10⁹个/ml；

2)有机肥的制备：以腐熟的猪粪堆肥和菜粕的微生物酶解混合物以体积比1∶1混合制成。所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2％，含水量25-30％。

3)将NJHJ-5和NJDF-14液体菌剂按50L/吨的量分别接种到有机肥中进行固体发酵，发酵温度为30-50℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵5-7天后结束，使拮抗菌含量达到1×10⁹个/g以上，分别获得拮抗菌NJHJ-5和NJDF-14的固体菌剂；

4)分别将拮抗菌NJHJ-5固体菌剂和NJDF-14固体菌剂以体积比1∶1混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为防除连作棉花黄萎病的微生物有机肥料。

所述微生物有机肥料可专用于防除连作棉花黄萎病。

3.有益效果

本发明一种能克服或消除连作棉花黄萎病的微生物有机肥料及其生产方法，利用猪粪堆肥和菜粕的微生物酶解氨基酸混合物，再与拮抗菌液混合后制成微生物有机肥料，其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点：

1)该肥料产品中含有两种抑制棉花黄萎病病原细菌生长的专一性高效菌株(枯草芽孢杆菌NJHJ-5和枯草芽孢杆菌NJDF-14)，其抑制效果非常显著。试验结果表明，在连作棉花黄萎病的土壤上施用本产品后，烟草青枯病的生物防治率达80％以上，连续三年施用本肥料的土壤，黄萎病的生物防治率更高。

2)该肥料为有机肥，含有丰富的有机质(含量30-35％)，有机氮含量为4％，而且大部分为氨基酸和小分子多肽。本产品总磷含量为4％，而且生物有效性特别高，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤后生物有效性较差。有机肥料中含有的丰富营养也为其中的拮抗菌提供了生长繁殖的条件，使在土壤中存活下来并形成优势群，从而发挥防病作用。

3)由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于棉花的无公害生产，农民可以不用或减少防治黄萎病的化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于农产品的出口。同时，该微生物肥料还有增产功能，可为农民增加收入。

四、附图说明

图1：拮抗菌NJHJ-5和NJDF-14的透射电镜图片

A：NJHJ-5的透射电镜图片    B：NJDF-14的透射电镜图片

图2：拮抗菌NJHJ-5和NJDF-14的抑菌圈

A：NJHJ-5的抑菌圈    B：NJDF-14的抑菌圈

五、具体实施方式

(一)菌株的分离和鉴定

棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)由中国微生物菌种保藏中心获得(CGMCC No.3.3757)，然后以大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)为指示菌从来自于棉花黄萎病发病田块中的健康棉花植株根际土壤中分离拮抗菌。再通过盆栽试验最终筛选出高效拮抗菌株NJHJ-5和NJDF-14，鉴定到属种，菌种于30％甘油中-70℃保存。拮抗菌NJHJ-5菌株对病原菌菌落的抑制率为76.2％，NJDF-14菌株对病原菌菌落的抑制率为64.3％(图1、图2)。

菌株NJHJ-5属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，主要生物学特性为：革兰氏染色阳性G⁺，细胞形状为杆状，芽孢中生或近中生，椭圆形，孢囊不膨大，没有伴孢晶体；接触酶阳性，氧化酶阳性，甲基红试验阳性，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性，能够利用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇等多种碳源生长，最适生长温度37℃，最适pH为7.2；在LB培养基上的菌落为圆形，边缘不规则，白色，不产生色素，菌落中间褶皱突起。

菌株NJDF-14属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，主要生物学特性为：革兰氏染色阳性G⁺，细胞形状为杆状，芽孢中生或近中生，椭圆形，孢囊不膨大，没有伴孢晶体；接触酶阳性，氧化酶阳性，甲基红试验阳性，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性，能够利用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇等多种碳源生长，最适生长温度37℃，最适pH为7.2；在LB培养基上菌落为圆形，边缘不规则，白色，不产生色素，菌落中间平滑无褶皱突起。

(二)菌剂生产

1)菌株NJHJ-5和菌株NJDF-14分别接种到改良的PDA培养液中，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0-7.2，培养温度30-38℃，搅拌速度为170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵的拮抗菌液含菌或芽孢量≥5×10⁹个/ml；

所用改良PDA培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g淀粉，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。

2)有机肥的制备：以腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物以体积比1∶1混合制成。

所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2％，含水量25-30％。

其中菜粕的微生物酶解混合物制备方法为(公知公用，见发明专利ZL200610086126.0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品)，将嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55-65％和pH6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50℃共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55-65％和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物分解混合物(含氨基酸的混合材料)。

3)将NJHJ-5和NJDF-14液体菌剂按50L/吨的量分别接种到上述有机肥中进行固体发酵，发酵温度为30-50℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵5-7天后结束，使拮抗菌含量达到1×10⁹个/g以上，分别获得拮抗菌NJHJ-5和NJDF-14的固体菌剂；

4)分别将拮抗菌NJHJ-5固体菌剂和NJDF-14固体菌剂以体积比1∶1混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，获得防除连作棉花黄萎病的微生物有机肥料。

用上述拮抗菌所生产的微生物有机肥(防除连作棉花黄萎病的专用微生物有机肥料)，该肥料中含有1×10⁹个/g以上的拮抗菌NJHJ-5和NJDF-14、全氮质量比含量为4～5％，全氮中质量比90％以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6～10％、有机质质量比含量为30～35％。

(三)温室盆栽试验

营养钵育苗，苗生长到3-4片真叶(20天)转移到盆钵中去。营养钵育苗土壤采用的是未种植过棉花的健康土壤，盆钵土壤采自江苏省大丰市的棉花田土壤，该土壤已经连续5年发生严重棉花黄萎病，发病率高达60％以上。供试品种为新陆早8号，2007年8月至12月为第一季在南京农业大学牌楼温室进行，2008年4月至8月初为第二季在宜兴江苏省新天地肥料工程中心的温室进行，2008年8月至12月为第三季在江苏省宜兴江苏省新天地肥料工程中心的温室进行。营养钵施用量为土壤重量的1％，盆钵施用量为土壤重量的0.5％。

苗期设置3个处理：1)未施用任何肥料；2)施用有机肥；3)施用微生物有机肥。每个营养钵装300克土，每个处理20个重复。

盆钵设置5个处理：

1)对照C(C)，营养钵和盆钵都未施用任何肥料；

2)有机肥C(O)，营养钵施用有机肥，盆钵未施用任何肥料；

3)微生物有机肥C(BO)，营养钵施用微生物有机肥，盆钵未施用任何肥料；

4)微生物有机肥1/2BO(C)，营养钵未施用任何肥料，盆钵施用微生物有机肥；

5)微生物有机肥1/2BO(BO)，营养钵和盆钵都施用微生物有机肥。

每个盆钵装10公斤土壤，每个处理10个重复。

自移栽后一个月发现第一株发病植株后，每天记录病情状况，直至棉花吐絮期(100天左右)，计算发病率和防治率(防治率＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100％)。通过连续3季的种植可以发现(表1)，与对照相比，不管是苗期营养钵单独施用微生物有机肥还是移栽后盆钵单独施用微生物有机肥都能够有效地降低棉花黄萎病的发病率，尤其是苗期营养钵施用和移栽后盆钵施用相结合能够达到更好的效果，连续种植3季后发病率为0％，基本不发病。

施用微生物有机肥不但可以起到防治棉花黄萎病，大大减少土壤中黄萎病原菌大力丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)数量的作用(表2)，还促进棉花根际微生物群落的变化，有益细菌群落显著增加，有害真菌及病原菌群落显著减少(表3)。同时可以发现通过营养钵单次施用微生物有机肥能够使黄萎病的防治率提高40％左右，在低发病率的棉区可以采用营养钵施用微生物有机肥而大田不施用，在降低成本的同时有效防治棉花黄萎病。

表1连续3季施用微生物有机肥对棉花黄萎病防治的影响

表2连续3季施用微生物有机肥对棉花根际土壤中病原菌的影响

表3连续3季施用微生物有机肥对棉花根际土壤中微生物区系的影响