基于聚电解质和活性成分的改性释放颗粒以及含有这些颗粒的药物制剂

摘要

本发明涉及新型的含有聚电解质聚合物的颗粒，其为活性成分(AP)的转运体，所述活性成分特别是蛋白和肽，本发明还涉及新型改性释放的含有所述AP微颗粒的药物制剂。这些装载有AP的新型颗粒在几天，甚至是几个星期的时间内持续释放活性成分。一方面，本发明涉及颗粒，含有：带电荷的第一聚电解质聚合物(PE1)，其带有侧链疏水基团(GH)，所述第一聚电解质聚合物(PE1)在pH 3－8之间的至少一个pHm值下，在水中自发形成颗粒的胶体溶液；与第一聚电解质聚合物(PE1)极性相反的第二聚电解质聚合物(PE2)，所述第二聚电解质聚合物(PE1)在所述pH的至少一个所述pHm值下，在水中形成溶液或胶体溶液；至少一种活性成分，与所述第一聚电解质聚合物(PE1)的胶体溶液颗粒非共价结合；所述颗粒通过在pH等于pHm下，将与活性成分(AP)结合的颗粒胶体溶液形式的第一聚电解质聚合物(PE1)和溶液或胶体溶液形式的第二聚电解质聚合物(PE2)混合而得到。本发明还涉及制备这些颗粒的方法，也涉及含有这些颗粒的药物制剂，以及制备药物的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及新型的活性成分(AP)转运体，特别是蛋白以及肽活性成分 的转运体，同时涉及含有所述AP转运体的改性释放药物制剂。本发明还涉及 这些药物制剂的应用，特别是在治疗方面的应用。这些活性药物制剂同时涉 及人和兽的治疗。

本发明使用的术语“AP”是指至少一种活性成分。

背景技术

在药物AP，尤其是治疗性的肽/蛋白质的持续释放领域，其目的经常在于 尽可能地在病人体内再现接近于健康个体中所观察的肽或蛋白质的血浆浓 度。

这一目标与血浆中蛋白寿命较短相矛盾，因而导致重复注射治疗用的蛋 白。结果造成治疗性蛋白质的“锯齿形”血浆浓度曲线，其以高浓度的峰值 和极低浓度的最小值为特征。这些浓度峰值远高于健康个体中所发现的基础 浓度，由于治疗性蛋白质(例如特定的细胞因子类)的高毒性，这些浓度峰值会 有显著的有害效应。此外，由于浓度最小值低于产生治疗效果所需的浓度， 将导致病人的治疗有效性较差，并且带来严重的长期副作用。

因此，为了在病人体内再现接近与理想治疗浓度的药用蛋白浓度，重要 的是，药物制剂能够在较长的时间内持续释放药用蛋白，从而控制血浆浓度 随着时间的变化。

而且，这种活性制剂应当优选满足本领域技术人员已经知晓的以下要求：

1-活性并且非变性的治疗性蛋白质(例如人或合成蛋白质)的持续释放，从 而使血浆浓度维持在治疗水平；

2-注射时的粘度足够低，以便于容易地注射；

3-表现出优异的毒性和耐受性特征的生物相容性和生物可降解性形式。

为了实现这些目的，现有技术中所提供的最佳方法之一是开发治疗性蛋 白质的持续释放剂型，其由加载有治疗性蛋白质的纳米颗粒的相对无粘性的 液体悬浮液构成。这些悬浮液能够使天然的治疗性蛋白质容易地给药。

因此，弗拉梅技术已经提供了一种途径，其中治疗性蛋白质和含有疏水 基团和亲水基团的共聚氨基酸的纳米颗粒相结合。

专利申请US 2006/0099264公开了一种两性分子聚氨基酸，其含有天冬氨 酸残基和/或谷氨酸残基，其中这些残基的至少一部分带有含有至少一种α-生 育酚残基的接枝(例如接枝了合成或天然来源的α-生育酚的聚谷氨酸酯或聚 天冬氨酸酯)。这些“疏水改性的”均聚氨基酸在水中自发形成一种纳米颗粒的 胶体悬浮液，这些纳米颗粒在pH 7.4的水性悬浮液中能够容易地和至少一种 活性蛋白质(胰岛素)相结合。

使用描述于PCT申请WO-A-05/051416的药物剂型可以部分实现释放持续 时间的延长。本申请公开了一种疏水改性的聚(L-谷氨酸钠)的纳米颗粒 (0.001-0.5μm)的胶体悬浮液，其在一浓度下注射，从而使皮下注射后，和内 源性的白蛋白接触以在病人体内就地形成凝胶。然后这种蛋白质缓慢释放， 通常持续一周的时间。然而，当待给药的治疗性蛋白质的浓度相对较高时， 在这种情形下，例如对人生长激素而言，其释放的持续时间仅限于几天。

这些剂型的释放持续时间会因为延长更多而获得受益。

发明内容

本发明的一个目的在于提供装载有活性成分(AP)的新型颗粒，其能在 几天或甚至几个星期的时间内持续释放AP。

本发明的另一个目的在于提供在水性溶液中形成稳定悬浮液的新型颗 粒。

本发明的另一个目的在于提供装载有AP的新型颗粒，其冻干形式是稳定 的。

本发明的另一个目的在于提供能够以冻干形式储存的新型颗粒。

本发明的另一个目的在于提供冻干后易于再分散的新型颗粒。

本发明的另一个目的在于提供新型颗粒，该颗粒能释放蛋白同时保持其 生物活性。

本发明的另一个目的在于提供制备这些微颗粒的新方法。

本发明的另一个目的在于提供用于持续释放AP的固体药物制剂，该固体 药物制剂尤其是用于吸入和肺部给药的干燥粉末形式。

为实现上述目的，在长期深入的研究之后，申请人发现，完全是令人惊 讶和出乎意料地，在特定条件下混合两种极性相反的聚电解质聚合物(如共 聚氨基酸聚合物)，其中，至少一种聚合物带有疏水基团并与至少一种AP结 合，能够形成1-100微米尺寸的颗粒，该颗粒能够使得蛋白或肽在较长时间内 在体内或体外释放。

因此，本发明首先涉及用于持续释放至少一种活性成分(AP)的颗粒， 其中，所述颗粒包括：

a)第一聚电解质聚合物(PE1)，优选为线性α-聚氨基酸，带电荷，带 有侧链疏水基团(GH)，所述第一聚电解质聚合物(PE1)在pH 3-8之间的 至少一个pHm值下，在水中自发形成颗粒的胶体溶液；

b)第二聚电解质聚合物(PE2)，优选为线性α-聚氨基酸，与第一聚电 解质聚合物(PE1)的极性相反，所述第二聚电解质聚合物(PE2)在所述pH 的至少一个所述pHm值下，在水中形成溶液或胶体溶液；若第一电解质聚合 物(PE1)为聚氨基酸，则第二聚电解质聚合物(PE2)既不是聚赖氨酸也不 是聚乙烯亚胺；以及

c)至少一种活性成分，与第一聚电解质聚合物(PE1)的胶体溶液颗粒 非共价结合；

其中，所述用于持续释放至少一种活性成分(AP)的颗粒通过在等于pHm 的pH下，将与活性成分(AP)结合的颗粒的胶体溶液形式的第一聚电解质聚 合物与溶液或胶体溶液形式的第二聚电解质聚合物混合得到。

本发明还涉及制备用于持续释放至少一种活性成分(AP)的颗粒的方法， 这些颗粒特别为上述颗粒，其中，所述方法包括下列步骤：

1)在pH 3-8之间的pHm下，制备带电荷并带有侧链疏水基团的第一聚电 解质聚合物(PE1)的水性胶体溶液，其中，所述第一聚电解质聚合物(PE1) 能够在水中在pH为3-8的至少一个pHm值下自发形成颗粒的胶体溶液；

2)在步骤1所得的第一聚电解质聚合物(PE1)中添加至少一种活性成分 (AP)，其中所述活性成分与所述第一聚电解质聚合物(PE1)的胶体溶液 颗粒非共价结合；

3)制备与第一聚电解质聚合物(PE1)极性相反的第二聚电解质聚合物 (PE2)，其中所述第二聚电解质聚合物(PE2)在水中，在所述pH的至少一 个所述pHm值下，形成溶液或胶体溶液；若第一电解质聚合物(PE1)为聚氨 基酸，则第二聚电解质聚合物(PE2)既不是聚赖氨酸也不是聚乙烯亚胺；

4)在pH等于pHm下，将步骤2得到的与活性成分(AP)结合的颗粒的胶 体溶液形式的第一聚电解质聚合物(PE1)与步骤3中得到的溶液或胶体溶液 形式的第二聚电解质聚合物(PE2)混合。

本发明还涉及用于持续释放至少一种活性成分(AP)的颗粒，其中，所 述颗粒包括：

a)第一聚电解质聚合物(PE1)，优选为线性α-聚氨基酸，带电荷，带 有侧链疏水基团(GH)，所述第一聚电解质聚合物(PE1)在pH 3-8之间的 至少一个pHm值下，在水中自发形成颗粒的胶体溶液；

b)第二聚电解质聚合物(PE2)，优选为线性α-聚氨基酸，与第一聚电 解质聚合物(PE1)极性相反，其带有侧链疏水基团(GH)，所述第二聚电 解质聚合物(PE2)在所述pH的至少一个所述pHm值下，在水中形成溶液或 胶体溶液；以及

c)至少一种活性成分(AP)，与第一聚电解质聚合物(PE1)的胶体溶 液颗粒非共价结合；

其中，所述用于持续释放至少一种活性成分的颗粒通过在pH等于pHm 下，混合与活性成分(AP)结合的颗粒的胶体溶液形式的第一聚电解质聚合 物(PE1)和溶液或胶体溶液形式的第二聚电解质聚合物(PE2)得到。

本发明还涉及制备用于持续释放至少一种活性成分(AP)的颗粒的方法， 特别地，这些颗粒为上述颗粒，其中，所述方法包括下列步骤：

1)在pH 3-8之间的pHm值下，制备带电荷并带有侧链疏水基团的第一聚 电解质聚合物(PE1)的水性胶体溶液，其中，所述第一聚电解质聚合物(PE1) 能够在水中在pH为3-8的至少一个pHm值下自发形成颗粒的胶体溶液；

2)在步骤1所得的第一聚电解质聚合物(PE1)中添加至少一种活性成分 (AP)，其中所述活性成分与所述第一聚电解质聚合物(PE1)的胶体溶液 颗粒非共价结合；

3)制备与第一聚电解质聚合物(PE1)极性相反的第二聚电解质聚合物 (PE2)，其带有侧链疏水基团(GH)，其中所述第二聚电解质聚合物(PE2) 在水中，在所述pH的至少一个所述pHm值下，形成溶液或胶体溶液；以及

4)在pH等于pHm下，将步骤2得到的与活性成分(AP)结合的颗粒的胶 体溶液形式的第一聚电解质聚合物(PE1)与步骤3中得到的溶液或胶体溶液 形式的第二聚电解质聚合物(PE2)混合。

本发明还涉及用于持续释放至少一种活性成分(AP)的药物制剂，所述 制剂含有上述颗粒。

本发明还涉及制备药物的方法，所述药物特别是经非肠道、粘膜、皮下、 肌肉、皮内、腹膜内、脑内给药，或施用于肿瘤，甚至经口、鼻、肺、透皮 或眼途径给药，该方法主要在于使用至少一种上述制剂。

发明详述

本说明书中，术语“溶液”理解为表示溶剂和单个链形式的聚合物的均 匀混合物。

本说明书中，术语“胶体溶液”理解为表示颗粒的悬浮液，通过T’试验 测得的平均直径小于或等于0.5μm。

本说明书中，术语“半中性pH”理解为表示一半可电离基团电离时的pH。

本说明书中，术语“pHm”理解为表示与活性成分(AP)结合的第一聚 电解质聚合物(PE1)和第二聚电解质聚合物(PE2)进行混合时的pH。

本说明书中，生理pH定义为例如等于7.2±0.4。

本说明书中，术语“聚电解质”理解为表示一种聚合物，其带有能够在 水中离子化的基团，从而在聚合物上生成电荷。

本说明书中，术语“聚两性电解质”理解为表示带有至少两种类型基团 的聚电解质，所述基团分别分离得到阴离子和阳离子基团。

本说明书中，术语“带有”表示携带的基团为垂挂的，也就是说，所述 基团相对于聚合物主链为侧基。特别的，当聚合物为含有“氨基酸”残基的 聚氨基酸时，所述垂挂基团相对于“氨基酸”残基为侧基，且为携带它的“氨 基酸”残基的γ位的羰基功能基的取代基。

本说明书中，术语“聚电解质的极性”理解为该聚电解质在所述pH的pHm 值下携带的总电荷的极性。

本说明书中，术语“容积密度”表示1g颗粒占有的体积。容积密度通过 任何本领域常用的方法测得，例如采用密度梯度法。

本说明书中，术语“小分子”表示分子量低于1kDa的分子。

可以采用T试验测量由第一电解质聚合物(PE1)和第二聚电解质聚合物 (PE2)结合得到的本发明颗粒的尺寸。T’试验优选用于评价第一聚电解质聚 合物(PE1)胶体溶液的颗粒尺寸。

T试验的结果为中值直径D50，使得样品中50％的颗粒的尺寸小于或等于 该值(D50)。

T’试验的结果为平均水动力学直径。

通过激光衍射测量微颗粒尺寸的T试验

该试验提供如上所述的D50，所述D50即50％的分析物小于D50时的直径。 根据本发明的颗粒直径通过下述步骤测量：

通过在5ml测试管中用600μl软化水稀释400μl待分析样品，并离心制品10 秒(10±5)来制备颗粒溶液。该溶液之后逐滴滴入测量格，直到模糊度达到 5-20％，使用Malvern Mastersizer 2000型仪器通过光衍射分析，采用两种波长 446和632nm。颗粒的D50通过Mie理论由下列折射指数以及ISO 13320标准中 的Fraunhofer近似法计算：

n_液体＝1.33+i.0，

n_聚合物＝1.59+i.0。

通过准弹性光散射检测纳米颗粒粒径的T’试验：

根据本发明的聚合物颗粒的平均水动力学直径根据下面定义的方法Md 检测：

制备0.15M NaCl介质中的浓度为1或2mg/ml的聚合物溶液并且搅拌24 h。这些溶液然后通过用0.8-0.2μm的滤器过滤，然后用Malvern Compact Goniometer System型的仪器分析其动力学光散射，用波长为632.8nm的垂直 极化的He-Ne激光束操作。聚合物纳米颗粒的水动力学直径通过累积量方法计 算电场的自相关函数获得，该方法描述在著作″Surfactant Science Series″， volume 22，Surfactant Solutions，编者是R.Zana，Chap.3，M.Dekker，1984。

检测活性成分释放的L试验：

50μl制剂注射到边长为1.5cm的聚氨酯/聚醚(PU-PE)泡沫立方体中，用流 速为2.83ml/h的水性介质水浴，所述水性介质含有30mg/g的牛白蛋白组分V (Aldrich)、0.01M磷酸盐缓冲液、0.0027M氯化钾、0.137M氯化钠(Aldrich的 PBS Aldrich)。样品周期性地从连续相中取出，通过ELISA(Immunotech IM3193kit)分析这些样品的蛋白质含量。

可以通过相加每个取出的样品中的量来描绘所释放的蛋白质的总重量， 其与总注射量相关。

在本发明的含义中，术语“蛋白”指蛋白或肽，无论其为寡肽或多肽。该 蛋白或肽可以是改性的或未经改性，所述改性例如通过接枝一个或多个聚乙 二醇基团。

第一和第二聚电解质聚合物(PE1)和(PE2)为生物相容的以及可生物 降解的线性聚合物，带有可电离阴离子和/或阳离子基团，例如胺或羧酸官能 团。优选地，聚合物PE1或PE2带有给定极性(阴离子或阳离子)的可电离基 团。

例如，这些聚合物为：聚氨基酸、阴离子聚糖，例如右旋糖酐硫酸酯、 羧甲基纤维素、阿拉伯胶、透明质酸以及它们的衍生物，聚半乳糖醛或聚糖 醛、或阳离子聚糖，例如壳聚糖、或胶原质以及明胶形式的衍生物。

还有可能是，带有给定极性的可电离基团的聚合物同时还带有一小部分 如1-30mol％的极性相反的可电离基团。除了可电离阴离子或阳离子基团以及 疏水基团，第一或第二聚电解质聚合物PE1或PE2能够选择性地还带有不可电 离的基团，例如选自羟基乙基胺-基、烷烃乙二醇或聚烷烃乙二醇的基团。

聚合物的净电荷依赖于聚合物半中和pH值。因此，对于带有羧基阴离子 官能基的聚电解质，聚合物的净电荷在低于半中性pH值两个单位的pH值时为 0。事实上，所有阴离子官能团在高于半中性pH两个单位的pH值下会离子化。 另一方面，对于带有阳离子官能团的聚合物，当pH超过半中性pH约2个单位 时，净电荷降低至0。

在本发明中，在pH的pHm值混合条件下，第一或第二聚电解质聚合物 (PE1，PE2)带有的电荷数通过传统的酸/碱滴定法得到：

含有0.15M氯化钠的浓度为2mg/ml的聚电解质溶液通过加入1M醋酸或 1M氢氧化钠溶液使其pH达到3。该溶液继续用0.05M氢氧化钠溶液滴定，pH 的改变记录为加入的氢氧化钠体积的函数。例如采用双切线法测量平衡点(体 积和pH)使得能够测到所有可电离基团电离的pH，也就是说，电离度为1时 的pH。由此出发，也可以得到任何pH值下聚电解质的电离度。可以定义半中 性pH，即电离度等于0.5时的pH。还可以定义pH的pHm值下聚电解质的电离 度。当平衡点为3-9pH范围以外的特定情况时，所有可电离基团视为在该pH 范围内电离，也就是说，在pH 3-9时，电离度为1。

有利的，第一和第二聚电解质聚合物(PE1，PE2)可以是线性聚(α-氨基 酸)(条件是若PE1为线性聚氨基酸，则PE2不是聚赖氨酸也不是聚乙烯亚胺)。

在本发明的含义中以及在本申请中，术语“聚氨基酸”包括天然氨基酸 以及合成氨基酸，也包括含有2-20个“氨基酸”残基的寡聚氨基酸以及含有 20个以上“氨基酸”残基的聚氨基酸。

优选地，本发明使用的聚氨基酸为寡聚物或均聚物，其含有谷氨酸或天 冬氨酸重复单元，或者是含有这两个类型的“氨基酸”残基混合物的共聚物。 这些聚合物中的残基为含有D或L或D/L构型的氨基酸，谷氨酸酯或谷氨酸残 基通过它们的α或γ位结合，天冬氨酸或天冬氨酸酯残基通过它们的α或β位结 合。

聚氨基酸主链的优选的“氨基酸”残基为具有L构型和α型键的那些残基。

根据本发明一个更优选的实施方式，第一和第二聚电解质聚合物(PE1， PE2)可以为聚氨基酸，或它们药用接受的盐，其中，其主链通过以下残基形 成：天冬氨酸残基、谷氨酸残基以及它们的混合，对于至少第一电解质聚合 物(PE1)，至少一部分这些单元通过接枝至少一种疏水基团(GH)而改性。

聚合物PE2也可以带有侧链疏水基团。

根据第一个实施方式，这些聚氨基酸为如PCT申请WO-A-00/30618记载的 那些类型，其中疏水基团(GH)各自相同或不同，选自下组：

a)直链或支链的，优选为直链C₁-C₂₀，更优选地为C₂-C₁₈的烷基、酰基或 烯烃基；

b)含有一个或多个杂原子的烃基，优选为含有氧和/或硫的烃基，更优 选为具有下式的烃基：

其中，

-R₆₀为直链或支链的，优选为直链C₁-C₂₀，更优选地为C₂-C₁₈的烷基、酰 基或烯烃基；

-R₆₁和R₆₂各自相同或不同，对应为氢或直链或支链的，优选为直链 C₁-C₂₀，更优选地为C₂-C₁₈的烷基、酰基或烯烃基；

-q＝1-100；

c)芳基、芳烷基或烷基芳基，优选为芳基；以及

d)疏水衍生物，优选为磷脂酰丝氨酸乙醇胺基，或者选自下组的基团：

辛氧基、十二烷氧基、十四烷氧基、十六烷氧基、十八烷氧基、9-十 八烯氧基、生育酚氧基和胆固醇氧基。

术语“烃基”在本发明中表示，特别是含有氢和碳原子的基团。

优选地，在该实施方式中，疏水基团选自下组基团：甲基、乙基、丙基、 十二烷基、十六烷基和十八烷基。

特别优选地，疏水基团(GH)选自：

-直链或支链的C₈-C₃₀的烷基，其可选地含有至少一个不饱和度和/或至少 一个杂原子；

-C₈-C₃₀的烷基芳基或芳基烷基，其可选地含有至少一个不饱和度和/或至 少一个杂原子；以及

-C₈-C₃₀的(聚)环化合物，其可选地含有至少一个不饱和度和/或至少一 个杂原子。

更具体地，至少一个疏水基团(GH)通过首先接合选自下组的前体得到： 辛醇、十二烷醇、十四烷醇、十六烷醇、十八烷醇、油醇、生育酚和胆固醇。

根据本发明的一个实施方式，聚电解质聚合物(PE1，PE2)之一或其药 用接受的盐之一，具有式(I)结构：

其中：

-R¹为H、直链C₂-C₁₀或支链C₃-C₁₀的烷基、苄基、-R⁴-[GH]，或者R¹与NH 形成末端氨基酸残基；

-R²为H、直链C₂-C₁₀或支链的C₃-C₁₀的酰基、焦谷氨酸酯或-R⁴-[GH]；

-R⁴为直键或基于1-4个氨基酸残基的间隔子；

-A¹和A²独立地为-CH₂-(天冬氨酸残基)或-CH₂-CH₂-(谷氨酸残基)；

-n/(n+m)定义为摩尔接枝率，对于pH 7、25℃下溶于水的聚合物而言，该值 足够低，以形成聚合物颗粒的胶体悬浮液；

-n+m为10-1000，优选为50-300；

-GH代表含有6-30个碳原子的疏水基团，或者选自上述a)-d)定义的基团。

关于制备和合成式(I)的聚氨基酸的详细内容参见专利申请FR0207008 和FR0350190。

根据另一种可能性，聚电解质聚合物PE2，或者其药用接受盐之一，具有 式(II)、(III)和(IV)的结构：

其中：

-GH代表含有6-30个碳原子的疏水基团；

-R³⁰为直链C₂-C₆的烷基；

-R⁵⁰为C₂-C₆的二氨基、二烷氧基或烷基；

-R⁴为直键或基于1-4个氨基酸残基的“间隔子”；

-A¹和A²独立地为-CH₂-(天冬氨酸残基)或-CH₂-CH₂-(谷氨酸残基)；

-n’+m′或n″为聚合度，为10-1000，优选为50-300。

关于制备和合成式(II)、(III)、(IV)的聚氨基酸的详细内容参见 专利申请FR0350641。

根据另一种可能性，聚电解质聚合物(PE1，PE2)之一或其药用接受的 盐之一，具备式(V)：

其中：

-E独立地代表：

→-NHR基团，其中R为H、直链C₂-C₁₀或支链的C₃-C₁₀的烷基或 苄基；

→末端氨基酸残基或末端氨基酸残基衍生物，具有下式：

其中：

R⁷为OH、OR⁹或NHR¹⁰

以及R⁸，R⁹和R¹⁰独立地为H、直链C₂-C₁₀或支链的C₃-C₁₀的烷基或苄 基；

-B为直键或二价、三价或四价结合基团，优选自下列基团：-O-，-NH-， -N(C₁-C₅烷基)-、氨基酸(优选为天然氨基酸)残基、二醇残基、三醇 残基、二胺残基、三胺残基、含有1-6个碳原子的氨基醇或羟基酸的残 基；

-D为H、直链C₂-C₁₀或支链的C₃-C₁₀的酰基或焦谷氨酸酯；

-GH代表含有6-30个碳原子的疏水基团；

-R₇₀是选自下组的基团：

→-NH-(CH₂)_w-NH₃⁺，其中w为2-6，优选w为4；

→-NH-(CH₂)₄-NH-C(＝NH)-NH₃⁺；

→-O-(CH₂)₂-NH₃⁺；

→-O-(CH₂)₂-N⁺(CH₃)₃；

→

其中，-R¹¹为-H、-CO₂H、烷基酯(优选为-COOMe和-COOEt)、-CH₂OH、 -C(＝O)-NH₂、-C(＝O)-NH-CH₃或-C(＝O)-N(CH₃)₂；以及

→具有下式结构的氨基酸残基或氨基酸衍生物：

其中：

X为O或-NH-，

-R¹²为H、直链C₂-C₁₀或支链的C₃-C₁₀的烷基或苄基，

-R¹³为-(CH₂)₄NH₃⁺、-(CH₂)₃-NH-C(＝NH)-NH₃⁺、-(CH₂)₃NH₃⁺；

其中，R₇₀的反离子为氯化物、硫酸盐、磷酸盐或醋酸盐，优选为氯 化物；

-R₉₀为羟基乙基氨基-、烯烃基乙二醇残基或聚氧烷烃残基；

-p、q、r和s为正整数；

-(p)/(p+q+r+s)定义为疏水基团GH的摩尔接枝率，若每个共聚物链平均含 有至少3个疏水接枝，则所述摩尔接枝率为2-99mol％，优选为5-50mol ％；

-(q)/(p+q+r+s)定义为阳离子基团的摩尔接枝率，为1-99mol％；

-(p+q+r+s)为10-1000，优选为30-500；

-(r)/(p+q+r+s)为0-98mol％；以及

-(s)/(p+q+r+s)为0-98mol％。

例如，赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸衍生物可以为乙基或甲基酯、酰胺和甲 基化酰胺。

优选地，根据该可选形式，疏水基团GH和阳离子基团随机地定位为垂挂 基团。

进一步，若每个共聚物链平均含有至少3个疏水接枝，则具有疏水单元的 聚谷氨酸酯的摩尔接枝率优选为2-99％，更优选为5-50％。

聚谷氨酸酯的(q)/(p+q+r+s)比表示它们可以含有约1-97mol％含有阳离子 电荷的基团。

聚谷氨酸酯的(s)/(p+q+r+s)比表示它们在中性pH下可以为阴离子、中性或 阳离子。

关于制备和合成式(V)的组氨酸衍生的聚氨基酸的详细内容参见专利 申请FR0553302。

关于制备和合成式(V)的非组氨酸衍生的聚氨基酸的详细内容参见专 利申请FR0703185。

根据一个优选的实施方式，以上通式中的R⁴或B基团代表直键。

根据另一种可能性，聚电解质聚合物(PE1，PE2)之一含有羟基烷基(优 选为乙基)谷氨酸盐残基，以及多个垂挂疏水基团(GH)，它们各自相同或 不同。羟基烷基谷氨酸盐单元也可以带有羟基烷基氨基。这些羟基烷基氨基 优选为通过酰胺键与共聚物连接。能够用于官能化这些羟基烷基谷氨酸盐残 基的谷氨酸残基的羟基烷基氨基可以各自相同或不同，例如，选自以下基团： 2-羟基乙基氨基、3-羟基丙基氨基、2，3-二羟基丙基氨基、三(羟基甲基)甲基 氨基和6-羟基己基氨基。

优选地，用于本发明的至少一个疏水基团GH包括在疏水接枝中，所述接 枝含有至少一个间隔节(或单元)(间隔子)，使得疏水基团(GH)与共聚 谷氨酸酯链(如共聚谷氨酸酯骨架主链)结合。例如，该间隔节可以含有至 少一个直接共价键和/或至少一个酰胺键和/或至少一个酯键。例如，该间隔节 可以属于：除共聚谷氨酸酯组成部分的单节单元外的“氨基酸”残基、氨基 醇衍生物、聚胺(如二胺)衍生物、多元醇(如二醇)衍生物以及羟基酸衍 生物。GH与共聚谷氨酸酯或聚烷基谷氨酸盐链的接枝涉及采用GH前体，该 前体能与共聚谷氨酸酯链或羟基烷基谷氨酸盐残基相连。实践中，GH的前体 可以是但不限于，选自醇和胺，对本领域技术人员而言，这些化合物易于官 能化。关于这些羟基烷基(优选为乙基)谷氨酸盐残基的详细内容参见 FR-A-2881140。

根据一个优选的实施方式，特别是根据至少一个上述的可能方式，本发 明使用的所有或部分的疏水基团(GH)独立地选自下组基团：

-直链或支链的烷氧基，其含有6-30个碳原子，可以含有至少一个杂原子 (优选为O和/或N和/或S)和/或至少一个不饱和度；

-烷氧基，其含有6-30个碳原子，含有一个或多个环形碳环，可选的含有 至少一个不饱和度和/或至少一个杂原子(优选为O和/或N和/或S)；以 及

-7-30个碳原子的烷氧芳基或芳基氧基烷基，可以含有至少一个不饱和度 和/或至少一个杂原子(优选为O和/或N和/或S)。

根据另一个优选的实施方式，特别是根据至少一个上述可能的方式，疏 水基团(GH)来自于醇的前体，选自：辛醇、十二烷醇、十四烷醇、十六烷醇、 十八烷醇、油醇、生育酚和胆固醇，以及R⁴为直键。

根据另一个优选的实施方式，特别是根据至少一个上述可能的方式，疏 水基团(GH)各自独立地代表单价基团，具有下式：

其中，

-R⁵为甲基(丙氨酸)、异丙基(缬氨酸)、异丁基(亮氨酸)、仲丁基 (异亮氨酸)或苄基(苯基丙氨酸)；

-R⁶为含有6-30个碳原子的疏水集团；以及

-I为0-6。

根据本发明一个值得注意的特征，疏水基团(GH)的所有或部分疏水基 R⁶独立地选自下组基团：

-直链或支链的烷氧基，其含有6-30个碳原子，且其可以含有至少一个杂 原子(优选为O和/或N和/或S)和/或至少一个不饱和度；

-含有6-30个碳原子的烷氧基，其含有一个或多个成环的碳环，并选择性 地含有至少一个不饱和度和/或至少一个杂原子(优选为O和/或N和/或 S)；以及

-7-30个碳原子的烷氧芳基或芳氧烷基，其可以含有至少一个不饱和度和 /或至少一个杂原子(优选为O和/或N和/或S)。

实践中，但不限于，所述疏水基团R⁶从醇的前体得到，所述前体选自： 辛醇、十二烷醇、十四烷醇、十六烷醇、十八烷醇、油醇、生育酚和胆固醇。

优选地，本发明使用的聚电解质聚氨基酸(PE1，PE2)的主链选自下组： α-L-谷氨酸酯均聚物、α-L-谷氨酸均聚物、α-L-天冬氨酸酯均聚物、α-L-天冬 氨酸均聚物、α-L-天冬氨酸酯/α-L-谷氨酸酯共聚物以及α-L-天冬氨酸/α-L-谷 氨酸共聚物。

在一个值得注意的方面，聚电解质聚合物PE1或PE2的主聚氨基酸链的天 冬氨酸和/或谷氨酸残基使得形成的聚合物为无规或嵌段或多嵌段型聚合物。

根据另一种表征方法，聚电解质聚合物PE1或PE2的摩尔质量为 2000-100000g/mol，优选为5000-40000g/mol。

第一和第二聚电解质聚合物(PE1，PE2)的聚合度为50-500，优选为 70-300。

被疏水基团取代的主链的聚合物单元的摩尔比例为1-40mol％，优选为 3-30mol％。

本发明使用的聚合物选自上述各种，在pH值等于pHm时整体为阳离子或 阴离子。

带有侧链疏水基团的第一聚电解质聚合物(PE1)的一个重要的特征在于 它能够自发在水中形成胶体溶液。

不限于任何理论，可以假设疏水基团的超分子结合形成疏水区域，从而 形成纳米颗粒。每个纳米颗粒由或多或少在其疏水区域周围浓缩的一个或多 个PE1聚合物链组成。应该理解的是，本发明使用的聚合物含有可电离的官能 团，根据pH和组成，其为中性(如-COOH、-NH₂)或电离的(如-COO^-，-NH₃⁺)。 因此，在水相中的溶解度直接依赖于官能团的电离程度以及pH。在水溶液中， 对于羧基官能基，反离子可以为金属阳离子，如钠、钙或镁，或者有机阳离 子，如三乙醇胺、三(羟基甲基)氨基甲烷或聚胺，如聚乙烯亚胺。阳离子基团 的反离子优选为氯化物、硫酸盐、磷酸盐和醋酸盐。

知道了半中性pH，本领域的技术人员能够调节pH从而使聚合物的离子化 程度足够高，并保证胶体溶液的稳定性。

适合用于本发明的聚氨基酸型的聚电解质可以例如通过本领域常用方法 得到。无规聚氨基酸可以通过传统的结合反应使疏水接枝直接与聚合物接枝 得到，所述接枝预先通过“间隔子”官能化。嵌段或多嵌段聚氨基酸聚电解 质可以通过依次聚合相应的N-羧基氨基酸酐(NCA)得到。

聚氨基酸、均聚谷氨酸酯、均聚天冬氨酸酯或嵌段、多嵌段或无规谷氨 酸酯/天冬氨酸酯共聚物，可以通过传统方法得到。

得到α型聚氨基酸的最常用方法是基于N-羧基氨基酸酐(NCA)的聚合， 例如，在″Biopolymers，1976，15，1869″以及H.R.Kricheldorf的著作alpha-Amino acid N-carboxy Anhydrides and related Heterocycles″，Springer Verlag(1987)中 有记载。NCA衍生物优选为NCA-O-Me、NCA-O-Et或NCA-O-Bz衍生物(Me＝ 甲基、Et＝乙基、Bz＝苄基)。之后，聚合物在合适的条件下水解得到其酸性 形式的聚合物。这些方法在发明人的专利FR-A-2801226有记载。根据本发明 可使用的一些聚合物例如为不同质量的聚(α-L天冬氨酸)、聚(α-L谷氨酸)、聚 (α-D-谷氨酸)以及聚(γ-L-谷氨酸)型，均有商品出售。α，β型的聚天冬氨酸可以 通过缩合天冬氨酸、然后通过碱水解得到(得到聚琥珀酰亚胺)(cf.Tomida et al.，Polymer，1997，38，4733-36)。

疏水接枝GH与聚合物的酸性基团的结合通过聚氨基酸在碳二亚胺作为 结合剂以及可选的催化剂存在下的反应容易地进行。所述催化剂如4-二甲基 氨基吡啶。所述反应在合适的溶剂中进行，如二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲 基吡咯啉(NMP)或二甲基亚砜(DMSO)。所述碳二亚胺例如二环己基碳 二亚胺或二异丙基碳二亚胺。接枝率通过成分和反应物的化学剂量比或反应 时间化学控制。通过“间隔子”官能化的疏水接枝通过传统的肽结合或直接 的酸催化缩合得到。

阳离子以及选择性的中性基团与聚合物酸性官能团的结合在氯甲酸酯作 为结合剂存在下的第二阶段同时进行，所述反应在合适的溶剂中进行，如二 甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或者二甲基亚砜(DMSO)。

当阳离子基团含有两个氨基官能基团且化学上无法区分时(如线性二胺)， 可以以两个官能团中的之一受保护的形式引入该阳离子基团。在上述过程中 则还应增加除去保护基团的最终步骤。

结合基团的聚合化学以及反应为传统的和本领域熟知的(例如参见发明 人前述的专利和专利申请)。

之前与疏水接枝合成的NCA衍生物用于合成嵌段或多嵌段共聚物。例如， NCA-疏水衍生物与NCA-O-苄基共聚，之后苄基选择性地通过水解除去。

根据本发明的特别优选的聚电解质聚合物(PE1和PE2)结合的例子如下 述实施方式所示。

本发明使用的聚合物一个重要的特征是，在pH 3-8之间的至少一个值 pHm下，第一聚电解质聚合物(PE1)为胶体溶液形式，第二聚电解质聚合物 (PE2)为溶液或胶体溶液形式。

为了满足条件，阳离子聚合物的半中性pH要足够高，例如，高于5.5，优 选高于6或更优选高于8；阴离子聚合物的半中性pH要足够低，例如低于6.5， 优选低于6.0或甚至低于5.5。

更特别地，根据另一个可选的变形，第一聚电解质聚合物(PE1)为阴离 子，选择该阴离子使得其半中性pH为3-6.5，优选为4.5-6.5。根据该可选变形， 第一聚电解质聚合物(PE1)在pH 6-8之间的pHm值下形成胶体溶液。

这样的聚合物PE1具体在实施例1a)中详述。

在这一情况下，根据第一种可能性，第二电解质聚合物(PE2)为阳离子， 在pH低于8时形成胶体溶液。优选地，选择该第二聚电解质聚合物(PE2)， 使得其半中性pH大于8。这样的聚合物PE2具体在实施例1d)中详述。

因此，根据第一种可能性，在pH 6-8的pHm值时，第一聚电解质聚合物 (PE1)形成胶体溶液，第二聚电解质聚合物(PE2)形成溶液或胶体溶液。

此时，根据本发明一个重要的特征，选择第一聚电解质聚合物(PE1)的 质量与第二聚电解质聚合物(PE2)的质量比，使得对于电荷比Z，也就是阳 离子离子化基团的摩尔数与阴离子离子化基团的摩尔数，在pHm时测量为 0.25-3，优选为0.25-1.5。

根据第二种可能性，第二聚电解质聚合物(PE2)为阳离子，在pH低于 6时形成胶体溶液，在pH大于6.5时沉淀。优选地，选择第二聚电解质聚合物 (PE2)使得其半中性pH为5.5-7。这样的聚合物PE2在实施例1c)中有记载。 这时，根据本发明一个重要特征，在pH 3-6之间的pHm下，第一聚电解质聚 合物(PE1)形成胶体溶液，第二聚电解质聚合物(PE2)形成溶液或胶体溶 液。选择第一聚电解质聚合物(PE1)与第二电解质聚合物(PE2)的质量比 使得在pHm下测得的电荷比Z为3.5-30，优选为5-15，更优选为8-12。

在另一个可选的形式中，第一聚电解质聚合物(PE1)为阳离子，选择该 阳离子使得其半中性pH大于5。这时，第二聚电解质聚合物(PE2)为阴离子， 选择该阴离子使得其半中性pH为3-6.5，优选4.5-6.5。

在生理pH下，通过T试验测得的本发明颗粒尺寸为1-100微米。

在本发明一个特定的实施例中，在生理pH下，颗粒显示较高的聚合物容 积密度，为0.5-1.1，优选为0.3-1.0，更优选为0.5-1.0。较高的聚合物密度显示 了在颗粒内部存在密集的聚合物链网络。不希望限于任何理论，可以假设该 密集网络减缓了根据本发明颗粒中存在的活性成分(AP)的扩散，因而减缓 了它的释放。根据本发明的密集颗粒一个惊人的方面为，聚合物链组成的聚 合物链网络减缓了活性成分(AP)的释放，然而，并不会将这种活性成分(AP) 截留在颗粒的内部。因此，根据本发明的转运物能够既延长活性成分(AP) 的释放，又具有良好的生物利用度。

在一些情况下，特别是当肽或蛋白与本发明微颗粒具有强结合力时，有 利地，可以调节AP的释放速率，从而加速释放，和/或改善其生物利用度。在 多次试验之后，申请人证明，当给定极性的PE1或PE2聚合物也带有相反极性 的可电离基团和/或非可电离基团如羟基乙基氨基取代的基团时，蛋白或肽的 释放可以加速。

因此，在本发明一个特定的实施例中，两个聚合物PE1或PE2之一，同时 含有：

-15-50mol％的谷氨酸酯单体；

-20-55mol％的非可离子化单体，如羟基乙基氨基-取代的基团；

-10-40mol％的带有阳离子基团的单体，其半中性pH大于8；以及

-3-15mol％的非可离子化单体，被疏水基团取代。

在另一个本发明特定的实施例中，聚合物PE1或PE2为阳离子，同时含有：

-0-5mol％的谷氨酸酯单体；

-50-85mol％的非可离子化的单体，如羟基乙基氨基取代的基团；

-10-40mol％的带有阳离子基团的单体，其半中性pH大于8；以及

-3-15mol％的非可离子化的单体，被疏水基团取代。

在本发明一个特定的实施方式中，制剂中聚合物(PE1+PE2)的总浓度 为4-15mg/ml，特别是当活性成分(AP)为治疗用蛋白时。在该浓度范围内， 制剂可以易于通过小直径针头注射，例如27、甚至是29和31规格的针头。实 施例3和4详细记载了这样的制剂。

优选地，活性成分(AP)选自下组：蛋白、糖蛋白、与一个或多个聚亚烷 基二醇链结合的蛋白(优选聚乙二醇(PEG)：″PEG化蛋白″)、肽、聚糖、脂糖、 寡聚核苷酸、多聚核苷酸及其混合物，以及，更优选地，选自以下亚组：红 细胞生成素，例如促红细胞生成素(epoetin)α、促红细胞生成素(epoetin)β、达 贝泊汀(darbepoetin)、交聚血红蛋(hemoglobin raffimer)、它们的类似物或衍生 物；催产素、后叶加压素、促肾上腺皮质激素、表皮生长因子、血小板衍生 生长因子(PDGF)、促进造血作用(hematopoiesis)的因子及其混合物、血液因子， 如链激酶、奈替普酶(tenecteplase)、因子VII(a)或因子VII；血色素、细胞色素、 白蛋白、泌乳刺激素、促黄体素释放素、促黄体生成激素释放激素(LHRH) 及类似物，如亮丙瑞林、戈舍瑞林(goserelin)、曲普瑞林、布舍瑞林或那法瑞 林；LHRH拮抗剂、LHRH竞争药(competitors)、人体、猪或牛生长激素(GH)、 生长素释放因子、胰岛素、生长激素抑制素、胰高血糖素、白细胞介素或它 们的混合物(IL-2，IL-11，IL-12)、干扰素如干扰素α、α-2b、β、β-1a或γ；胃泌 激素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素(urogastrone)、分泌素、降血钙素、 脑啡肽、内吗啡肽(endomorphins)、血管紧缩素、促甲状腺素释放荷尔蒙(TRH)、 肿瘤坏死因子(TNF)、神经生长因子(NGF)、生长因子如贝卡普勒明 (beclapermin)、曲弗明(trafermin)、安西司亭(ancestim)或角化细胞生长因子、 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、 巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肝素酶(heparinase)、骨形态发生蛋白 (BMP)、hANP、胰高血糖素样肽(GLP-1)、VEG-F、重组乙肝表面抗原 (rHBsAg)、肾素、细胞因子、缓激肽、杆菌肽、多粘菌素、黏菌素(colistins)、 短杆菌酪肽、短杆菌肽、依那西普(etanercept)、伊米苷酶(imiglucerase)、屈曲 可净(drotrecogin)α、环孢菌素(cyclosporins)以及合成类似物、酶、细胞因子、 抗体、抗原、疫苗的药用活性改性物及片段，以及抗体如利妥昔单抗 (rituximab)、英利昔单抗(infliximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、阿达木单抗 (adalimumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、依法珠 单抗(efalizumab)和西妥昔单抗(cetuximab)。

其他合适的活性成分为聚糖(如肝素)和寡聚或多聚核苷酸、DNA、RNA、 iRNA、抗生素和活细胞。另一类合适的活性成分包括作用于中枢神经系统的 药用物质，例如利培酮(risperidone)、珠氯噻醇(zuclopenthixol)、氟非那嗪 (fluphenazine)、羟哌氯丙嗪(perphenazine)、氟哌噻吨(flupentixol)、氟哌丁苯 (haloperidol)、氟斯必灵(fluspirilene)、喹硫平(quetiapine)、氯氮平、阿米舒必 利(amisulprid)、舒必利(sulpiride)、齐拉西酮(ziprasidone)等。

根据一个可选的形式，活性成分为疏水、亲水或两性的小的有机分子， 其属于蒽环类、紫杉烷类或喜树碱类，或者属于肽类，例如亮丙瑞林或环孢 素，以及其混合物。

在本发明的含义中，小分子特别是指小的非蛋白分子，例如非氨基酸。

根据另一个实施方式，活性成分优选自至少一种下列活性物质：治疗滥 用酒精的药剂、治疗老年痴呆症的药剂、麻醉剂、治疗肢端肥大症的药剂、 止痛剂、平喘药、治疗过敏的药剂、抗癌剂、抗炎剂、抗凝血剂和抗血栓形 成剂、抗惊厥药物、抗癫痫药物、抗糖尿病药物、止吐剂、抗青光眼剂、抗 组胺剂、抗感染药、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、抗帕金森药剂、抗胆碱 剂、止咳药、碳酸酐酶抑制剂、心血管药剂、降血脂药、抗心律失常药、血 管扩张剂、防心绞痛药剂、抗高血压药物、血管保护剂(vasoprotectants)、胆 碱脂酶抑制剂、治疗中枢神经系统紊乱药物、中枢神经系统刺激剂、避孕药、 生育促进剂(fertility promoters)、生产促进剂或抑制剂、治疗变性的药物、多 巴胺受体激动剂、治疗子宫内膜异位的药剂、治疗勃起功能障碍的药剂、治 疗不孕症的药剂、治疗肠胃紊乱的药剂、免疫调节剂和免疫抑制剂、治疗记 忆紊乱的药剂、治疗偏头痛的药剂、肌肉松驰剂、核苷类似物、治疗骨质疏 松的药剂、拟副交感神经剂、前列腺素、心理治疗药剂、镇静剂、催眠剂和 镇定剂、安定药、抗焦虑药、精神兴奋剂、抗抑郁药、皮肤治疗药剂、类固 醇和激素、安非他明、食欲抑制剂、非镇痛止痛剂(nonanalgesic painkillers)、 巴比要酸盐、苯并二氮杂卓类、泻药、精神药物以及它们的任意组合。

本发明的另一个目的为制备用于持续释放至少一种活性成分(AP)的颗 粒的方法，这些颗粒特别是指上述颗粒，该方法包括下列步骤：

1)在pH 3-8之间的pHm下，制备带电荷并带有侧链疏水基团(GH)的 第一聚电解质聚合物(PE1)的水性胶体溶液，所述第一聚电解质聚合物(PE1) 能够在水中在pH 3-8之间的至少一个pHm值下自发形成颗粒的胶体溶液；

2)在步骤1得到的第一聚电解质聚合物(PE1)中加入至少一种活性成分 (AP)，所述活性成分与所述第一聚电解质聚合物(PE1)的胶体溶液颗粒 非共价结合；

3)制备与第一聚电解质聚合物(PE1)极性相反的第二聚电解质聚合物 (PE2)，所述第二聚电解质聚合物(PE2)在所述pH的至少一个所述pHm值 下在水中形成溶液或胶体溶液，前提是，如果所述第一电解质聚合物(PE1) 为聚氨基酸，则第二聚电解质聚合物(PE2)既不是聚赖氨酸，也不是聚乙烯 亚胺；

4)在pH＝pHm下，将步骤2得到的与活性成分(AP)结合的颗粒胶体溶液 形式的第一聚电解质聚合物(PE1)，与步骤3得到的溶液或胶体溶液形式的 第二聚电解质聚合物(PE2)混合。

本发明的另一个目的是，制备用于持续释放至少一种活性成分(AP)的 颗粒的方法，所述颗粒特别地是指上述颗粒，该方法包括下列步骤：

1)在pH 3-8之间的pHm值下，制备带电荷并带有侧链疏水基团(GH) 的第一聚电解质聚合物(PE1)的水性胶体溶液，所述第一聚电解质聚合物 (PE1)能够在水中在pH 3-8之间的至少一个pHm值下自发形成颗粒的胶体溶 液；

2)在步骤1得到的第一聚电解质聚合物(PE1)中加入至少一种活性成分 (AP)，所述活性成分与所述第一聚电解质聚合物(PE1)的胶体溶液颗粒 非共价结合；

3)制备与第一聚电解质聚合物(PE1)极性相反的第二聚电解质聚合物 (PE2)，其带有侧链疏水基团(GH)，所述第二聚电解质聚合物(PE2) 在所述pH的至少一个所述pHm值下在水中形成溶液或胶体溶液；

4)在pH＝pHm下，将步骤2得到的与活性成分(AP)结合的颗粒胶体溶 液形式的第一聚电解质聚合物(PE1)，与步骤3所得的溶液或胶体溶液形式 的第二聚电解质聚合物混合(PE2)。

本发明方法的一个重要的特征是，在pHm下，通过简单地混合装载有活 性成分(AP)的第一聚电解质聚合物(PE1)的颗粒胶体溶液以及相反极性 的第二聚电解质聚合物(PE2)的溶液或胶体溶液，自发形成颗粒。

活性成分，如蛋白、肽或小分子，能够与聚氨基酸型的第一聚合物(PE1) 自发结合。活性成分(AP)装载到第一聚电解质聚合物(PE1)的纳米颗粒 是通过简单地将活性成分(AP)的溶液与第一聚电解质聚合物(PE1)的胶 体溶液混合进行的。该结合是单纯的物理作用，不涉及在活性成分(AP)和 聚合物(PE1)之间形成共价键。为了不限制于任何理论，可以假设该非特异 性结合通过在聚合物(PE1)和活性成分(AP)间的疏水和/或静电相互作用 发生。应该注意的是，通常不需要，也不希望，通过特定的肽性质或抗原/抗 体或酶/基底型的受体来将活性成分AP与PE1纳米颗粒结合。

在根据本发明的方法的一个优选的实施方式中，该方法不包括所得颗粒 的化学交联步骤。因此，本发明颗粒不是化学交联的但可以持续释放活性成 分(AP)达一段时间。不使用化学交联是本发明颗粒的一个决定性的优点。这 是因为不使用化学交联能够避免活性成分(AP)在交联含有所述活性成分 (AP)的颗粒的步骤中化学降解。这是因为这种化学交联通常通过可聚合实体 的活化来进行，并且可能涉及变性试剂，例如UV照射或戊二醛。

优选地，本发明方法包括将得到的颗粒悬浮液脱水的步骤(如通过冻干 法或原子化)，从而得到其干燥粉末形式。

根据另一方面，本发明的目的还在于提供用于持续释放至少一种活性成 分(AP)的药物制剂，其含有如上所述或如上述方法得到的颗粒水性悬浮液。

本发明还涉及用于持续释放至少一种活性成分(AP)的固体药物制剂，其 含有干燥粉末形式的：

-基于含有至少一种活性成分(AP)的颗粒，这些颗粒如上所述或通过如 上所述方法得到；

-或通过含有如上所述的水溶液中的悬浮液的制剂得到。

优选地，这些固体药物制剂用于吸入或经肺给药。

根据另一方面，本发明的目的还在于提供制备药物的方法，所述药物特 别是经非肠道、粘膜、皮下、肌肉、皮内、腹膜内、脑内给药，或施用于肿 瘤，甚至经口、鼻、肺、透皮或眼途径给药，所述方法在于使用至少一种上 述制剂。

附图说明

图1：含有实施例2(白圈)、实施例3.1(黑三角)、实施例3.2(黑菱形)、 实施例3.3(黑方块)、实施例4(黑圈)、实施例5(直线)的颗粒的制剂中 IFN-α的体外释放。

具体实施方式

1.合成

a)合成带有疏水基团的阴离子聚电解质聚合物PE1-A(接枝了合成来源 的α-维生素E的聚谷氨酸酯)。

15g聚(α-L-谷氨酸)(通过NCA-GluOMe聚合，之后水解得到的，相对于 聚氧乙烯标准的分子量大约为16900Da，见专利申请FR-A-2801226)溶于 288ml的二甲基甲酰胺(DMF)，在80℃加热直到聚合物溶解。溶液冷却至15℃。 依次加入预先溶于8ml DMF的2.5g D，L-α-维生素E(＞98％，购于)、 预先溶于1ml DMF的280mg 4-二甲基氨基吡啶和预先溶于6ml DMF的1.6g二 异丙基碳二亚胺。搅拌3小时，将反应介质倒入1200ml含有15％氯化钠和盐酸 (pH 2)的水中。沉淀的聚合物通过过滤回收，用0.1N盐酸、水和二异丙醚 洗。聚合物在40℃炉中真空干燥。得到的产率约为90％。通过体积排除色谱 法测量得到的相对于聚氧乙烯标准的分子量为15500。质子NMR估算的维生 素E的接枝率为5.1mol％。

b)合成阴离子聚电解质聚合物PE1-B(聚谷氨酸钠)

如专利申请FR-A-2801226中记载的合成聚(α-L-聚谷氨酸)。

通过体积排除色谱法测量得到的相对于聚氧乙烯标准的分子量为16900。

c)合成阳离子聚电解质聚合物PE2-A(接枝了合成来源的α-维生素E和 组氨酰胺的聚谷氨酸酯)

符号和基团：m＝11，p＝209，q＝0，T＝D，L-α-维生素E(T)

将3g任意接合了5％外消旋的α-维生素E的DP为220的聚(谷氨酸)在80℃ 加热溶于38ml NMP。溶液冷却至0℃，加入2.74g氯甲酸异丁酯和2.2ml N-甲 基吗啉。反应介质搅拌10分钟，保持温度在0℃。同时，将8.65g组胺酰胺二 盐酸盐悬浮于108ml NMP中。之后加入10.6ml三乙胺。得到的悬浮液在20℃ 搅拌几分钟，冷却至0℃。然后将活化的聚合物溶液加入组胺酰胺悬浮液。反 应介质在0℃搅拌2小时，然后在20℃搅拌过夜。加入0.62ml 35％的HCl和83ml 水。得到的溶液倒入pH 3-4的500ml水中。溶液分别用8倍体积的水盐溶液(0.9 ％NaCl)和4倍体积的水过滤。聚合物溶液浓缩至300ml(聚合物浓度为 18mg/g)。通过¹H NMR在D₂O测得的组胺酰胺的接枝率为95％。

d)合成阳离子聚电解质聚合物PE2-B(接枝了合成来源的α-维生素E和 精氨酸的聚谷氨酸酯)

符号和基团：T＝D，L-α-维生素E，p＝s＝11，q＝198，r＝0

将10g任意接合了5％外消旋的α-维生素E的DP为220的聚(谷氨酸)在80℃ 下溶于125ml NMP。溶液冷却至0℃，加入8.7ml氯甲酸异丁酯和7.35ml N-甲 基吗啉。反应混合物在0℃搅拌15分钟。同时，将24.67g精氨酰胺二盐酸盐悬 浮于308ml NMP。之后加入14.7ml三乙胺。得到的悬浮液在20℃搅拌几分钟， 冷却至0℃。活化的聚合物乳状悬浮液加入该悬浮液。反应混合物在0℃搅拌2 小时，在20℃搅拌过夜。加入2.1ml 35％的HCl溶液和100ml水后，反应混合 物逐滴加入pH 1.6L水中。得到的溶液分别用8倍体积的水盐溶液(0.9％)和4 倍体积的水过滤，并浓缩至约250ml体积。通过¹H NMR在D₂O测得的精胺酰 胺的接枝率为90％。

e)合成阳离子聚电解质聚合物PE2-C(接枝了合成来源的α-维生素E、精 氨酸和乙醇胺的聚谷氨酸酯)

符号和基团：T＝D，L-α-维生素E，p＝11，q＝88，r＝99，s＝22

将10g任意接合了5％外消旋的α-维生素E的DP为220的聚(谷氨酸)在80℃ 下溶于125ml NMP。溶液冷却至0℃，加入9.1ml氯甲酸异丁酯和7.71ml N-甲 基吗啉。反应混合物在0℃搅拌15分钟。同时，将8.2g精氨酰胺二盐酸盐悬浮 于108ml NMP。之后加入9.31ml三乙胺。再加入1.6ml乙醇胺。得到的悬浮液 在20℃搅拌几分钟，冷却至0℃。活化聚合物的乳状悬浮液加入该悬浮液。反 应混合物在0℃搅拌2小时，加入1.2ml乙醇胺，反应混合物在20℃搅拌过夜。 加入2.1ml 35％的HCl溶液和200ml水。反应混合物逐滴加入700ml水中，pH调 解至7.4。得到的溶液分别用8倍体积的水盐溶液(0.9％)和4倍体积的水过滤， 并浓缩至约250ml体积。通过质子NMR在D₂O测得的精胺酰胺和乙醇胺的接枝 率分别为40％和45％。

f)合成阳离子聚电解质聚合物PE2-D(接枝了合成来源的α-维生素E、精 氨酸和乙醇胺的聚谷氨酸酯)

符号和基团：T＝D，L-α-维生素E，p＝11，q＝48，r＝150，s＝11

将10g任意接合了5％外消旋的α-维生素E的DP为220的聚(谷氨酸)在80℃ 下溶于125ml NMP。溶液冷却至0℃，加入8.7ml氯甲酸异丁酯和7.3ml N-甲基 吗啉。反应混合物在0℃搅拌15分钟。同时，将4.61g精氨酰胺二盐酸盐悬浮 于58ml NMP。之后加入2.9ml三乙胺。再加入2.8ml乙醇胺。得到的悬浮液在 20℃搅拌几分钟，冷却至0℃。活化聚合物的乳状悬浮液加入该悬浮液。反应 混合物在0℃搅拌4小时，加入1.2ml乙醇胺，反应混合物在20℃搅拌过夜。加 入2.1ml 35％的HCl溶液。反应混合物逐滴加入730ml水中，pH调解至7.4。得 到的溶液分别用8倍体积的水盐溶液(0.9％)和4倍体积的水过滤，并浓缩至 约300ml。通过质子NMR在D₂O测得的精胺酰胺和乙醇胺的接枝率分别为22 ％和68％。

2)实施例1(比较例)：制备不含疏水基团的聚电解质颗粒

1.制备聚合物PE1-B的胶体溶液

使用根据合成b)得到的聚合物PE1-B。该聚合物的半中性pH等于5.985。

通过溶于水得到聚合物PE1-B的胶体溶液，加入NaOH溶液调解pH到 7.63。通过加入所需量的NaCl水溶液调节溶液的渗透压至100mOsm。聚合物 PE1-B的浓度调节为8.38mg/g。

2.将蛋白与聚合物PE1-B结合：

2.4mg/g浓缩的蛋白IFN-α(PC GEN)加入上述聚合物PE1-B的胶体溶液 中，得到具有下述特征的结合：

  [PE1-B](mg/g)   [IFN-α](mg/g)   pH   4.55   1.1   7.17

通过在25℃搅拌过夜完成上述结合。

3.制备聚-L-精氨酸(Aldrich P7637)的胶体溶液

该聚合物的半中性pH大于9。

通过溶于水得到聚-L-精氨酸的胶体溶液，首先用HCl溶液调节pH到0.92， 再用NaOH溶液将pH升至6.91，在45℃加热溶液15分钟。聚-L-精氨酸的浓度 调节至5.13mg/g。

4.混合得到颗粒

在45℃下，将1.37g聚-L-精氨酸溶液逐滴搅拌加入1.06g IFN-α/PE1-B溶 液。在45℃搅拌15分钟。然后在4℃搅拌过夜。

得到的颗粒特征如表I所示：

阳离子化基团的摩尔数与阴离子化基团的摩尔数之比为电荷比Z，在pHm 等于6.95下测得。颗粒的尺寸通过T试验测得。

表I

  [聚合物](mg/g)   [IFN-α](mg/g)   Z   pHm   尺寸   (μm)   4.8   0.48   1.06   6.95   15.92

5.蛋白包封的量化

悬浮液在8000rpm下离心15分钟，悬浮液中的IFN-α通过在欧洲药典(通 过UV吸收的比色法)记载的方法测得。

  总量[IFN-α](mg/g)   游离[IFN-α](mg/g)   产率(％)   0.48   0.15   71

事实上，引入的第三个蛋白未包封入形成的微颗粒中。该部分无法得到 可控释放。

3)实施例2：制备带有疏水基团的单一聚电解质(PE1)的颗粒

1.制备聚合物PE1-A的胶体溶液

使用根据合成a)得到的聚合物PE1-A。该聚合物的半中性pH等于5.445。

通过溶于水得到聚合物PE1-A的胶体溶液，加入NaOH溶液调解pH到 7.53。通过加入所需量的NaCl水溶液调节溶液的渗透压至101mOsm。聚合物 PE1-B的浓度调节为8.41mg/g。

2.将蛋白与聚合物PE1-A结合：

2.4mg/g浓缩的蛋白IFN-α(PC GEN)加入上述聚合物PE1-A的胶体溶液 中，得到具有下述特征的结合：

  [PE1-A](mg/g)   [IFN-α](mg/g)   pH   4.58   1.1   7.17

通过在25℃搅拌过夜完成上述结合。

3.制备聚-L-精氨酸(Aldrich P7637)的胶体溶液

以与上述实施例1所述的相同方法制备溶液。

4.混合得到颗粒

在45℃下，将1.24g聚-L-精氨酸溶液逐滴搅拌加入1.07g IFN-α/PE1-B溶 液。在45℃搅拌溶液15分钟。然后在4℃搅拌过夜。

得到的颗粒特征如表II所示：

在pHm等于6.88下测得电荷比Z。颗粒的尺寸通过T试验测得。

表II

  [聚合物](mg/g)   [IFN-α](mg/g)   Z   pHm   尺寸   (μm)   4.7   0.505   1.00   6.88   18.24

5.蛋白包封的量化

悬浮液在8000rpm下离心15分钟，悬浮液中的IFN-α通过在欧洲药典(通 过UV吸收的比色法)记载的方法测得。

总量[IFN-α](mg/g)   游离[IFN-α](mg/g)   产率(％) 0.505   0.01   98

所有引入的蛋白均被包封入形成的微颗粒中。

4)实施例3：制备基于含有IFN-α的PE1-A和PE2-A的颗粒

4.1)实施例3.1：聚合物的最终浓度约为10mg/g，Z约等于1

1.制备聚合物PE1-A的胶体溶液

使用根据合成a)得到的聚合物PE1-A。该聚合物的半中性pH等于5.445。

通过溶于水得到聚合物PE1-A的胶体溶液，加入NaOH溶液调解pH到 7.45。通过加入所需量的NaCl水溶液调节溶液的渗透压至108mOsm。聚合物 PE1的浓度调节为23.88mg/g。

2.将蛋白与聚合物PE1-A结合：

2.4mg/g浓缩的蛋白IFN-α与89mOSM的NaCl加入上述聚合物PE1-A的胶 体溶液中，得到具有下述特征的结合：

  [PE1-A](mg/g)   [IFN-α](mg/g)   pH   渗透压(mOsm)   13.33   1.01   6.51   322

通过在25℃搅拌过夜完成上述结合。结合物调节pH到5.07。

3.制备聚合物PE2-A的胶体溶液

使用根据合成c)得到的聚合物PE2-A。该聚合物的半中性pH等于6.05。

通过溶于水得到聚合物PE2-A的胶体溶液，调解pH到5.17。调节溶液的渗 透压至289mOsm。聚合物PE2-A的浓度调节为5.70mg/g。

4.混合得到颗粒

将4.98gPE2-A溶液逐滴搅拌加入4.61g IFN-α/PE1-A溶液。在4℃搅拌过 夜。

得到的颗粒特征如表III所示：

电荷比Z在pHm等于5.17下测得。颗粒的尺寸通过T测试测得。

表III

[polymer] (mg/g)   [IFN-α]   (mg/g)   Z   pHm   渗透压(mOsm)   尺寸   (μm) 9.1   0.46   0.83   5.17   370   7.7

4.2)实施例3.2：聚合物的最终浓度约为5mg/g，Z约等于10

1.制备聚合物PE1-A的胶体溶液

使用根据合成a)得到的聚合物PE1-A。

通过溶于水得到聚合物PE1的胶体溶液，加入NaOH溶液调解pH到7.52。 通过加入所需量的NaCl水溶液调节溶液的渗透压至108mOsm。聚合物PE1的 浓度调节为20.21mg/g。

2.将蛋白与聚合物PE1-A结合：

2.4mg/g浓缩的蛋白IFN-α与89mOSM的NaCl加入上述聚合物PE1-A的胶 体溶液中，得到具有下述特征的结合：

  [PE1-A](mg/g)   [IFN-α](mg/g)   pH   渗透压(mOsm)   1.7   0.1   5.45   324

通过在25℃搅拌过夜完成上述结合。结合物调节pH到4.88。

3.制备聚合物PE2-A的胶体溶液

使用根据合成c)得到的聚合物PE2-A。

通过溶于水得到聚合物PE2-A的胶体溶液，调解pH到5.07。调节溶液的渗 透压至287mOsm。聚合物PE2-A的浓度调节为8.11mg/g。

4.混合得到颗粒

将5.19gPE2-A溶液逐滴搅拌加入5.02g IFN-α/PE1-A溶液。在4℃搅拌过 夜。

得到的颗粒特征如表IV所示：

电荷比Z在pHm等于4.81下测得。颗粒的尺寸通过T试验测得。

表IV

  [聚合物]   (mg/g)   [IFN-α]   (mg/g)   Z   pHm   渗透压(mOsm)   尺寸   (μm)   5.0   0.49   13.43   4.81   306   15.1

4.3)实施例3.3：聚合物的最终浓度约为10mg/g，Z约等于10

1.制备聚合物PE1-A的胶体溶液

使用根据合成a)得到的聚合物PE1-A。

通过溶于水得到聚合物PE1的胶体溶液，加入NaOH溶液调解pH到7.52。 通过加入所需量的NaCl水溶液调节溶液的渗透压至108mOsm。聚合物PE1-A 的浓度调节为20.21mg/g。

2.将蛋白与聚合物PE1-A结合：

2.4mg/g浓缩的蛋白IFN-α与89mOSM的NaCl加入上述聚合物PE1-A的胶 体溶液中，得到具有下述特征的结合：

  [PE1-A](mg/g)   [IFN-α](mg/g)   pH   渗透压(mOsm)   3.39   1.01   5.83   347

通过在25℃搅拌过夜完成上述结合。结合物调节pH到5.07。

3.制备聚合物PE2-A的胶体溶液

使用根据合成c)得到的聚合物PE2-A。

通过溶于水得到聚合物PE2-A的胶体溶液，调解pH到5.08。调节溶液的渗 透压至288mOsm。聚合物PE2-A的浓度调节为16.37mg/g。

4.混合得到颗粒

将5.25gPE2-A溶液逐滴搅拌加入5.19g IFN-α/PE1-A溶液。在4℃搅拌过 夜。

得到的颗粒特征如表V所示：

电荷比Z在pHm等于4.95下测得。颗粒的尺寸通过T试验测得。

表V

 [polymer]  (mg/g)   [IFN-α]   (mg/g)   Z   pHm   渗透压(mOsm)   尺寸   (μm)  9.9   0.5   8.20   4.95   314   10.3

5)实施例4：制备基于PE1-A和PE2-B的颗粒，含有IFN-α，最终聚合物 浓度等于5mg/g，Z＝1

1.制备聚合物PE1-A的胶体溶液

使用根据合成a)得到的聚合物PE1-A。

通过溶于水得到聚合物PE1的胶体溶液，加入NaOH溶液调解pH到7.52。 通过加入所需量的NaCl水溶液调节溶液的渗透压至108mOsm。聚合物PE1-A 的浓度调节为20.21mg/g。

2.将蛋白与聚合物PE1-A结合：

2.4mg/g浓缩的蛋白IFN-α与89mOSM的NaCl加入上述聚合物PE1-A的胶 体溶液中，得到具有下述特征的结合：

  [PE1-A](mg/g)   [IFN-α](mg/g)   pH   渗透压(mOsm)   3.715   1.01   5.89   335

通过在25℃搅拌过夜完成上述结合。结合物调节pH到6.89。

3.制备聚合物PE2-B的胶体溶液

使用根据合成d)得到的聚合物PE2-B。该聚合物的半中性pH大于9。

通过溶于水得到聚合物PE2-B的胶体溶液，调解pH到6.98。调节溶液的渗 透压至288mOsm。聚合物PE2-B的浓度调节为6.33mg/g。

4.混合得到颗粒

将4.06gPE2-B溶液逐滴搅拌加入4.59g IFN-α/PE1-A溶液。在4℃搅拌过 夜。

得到的颗粒特征如表VI所示：

电荷比Z在pHm等于6.85下测得。颗粒的尺寸通过T试验测得。

表VI

  [聚合物]   (mg/g)   [IFN-α]   (mg/g)   Z   pHm   渗透压(mOsm)   尺寸   (μm)   5   0.46   1.01   6.85   360   17.1

6)实施例5(比较例)：制备仅基于PE1-A的颗粒，含有IFN-α。

使用根据合成a)得到的聚合物PE1-A。

通过溶于水得到聚合物PE1的胶体溶液，加入NaOH溶液调解pH到7.52。 通过加入所需量的NaCl水溶液调节溶液的渗透压至108mOsm。聚合物PE1-A 的浓度调节为29.05mg/g。

2.4mg/g浓缩的蛋白IFN-α加入上述聚合物PE1的胶体溶液中。通过在25℃ 搅拌过夜完成结合。

得到的颗粒特征如表VII所示：

颗粒的尺寸通过T’试验测得。

表VII

  [PE1-A](mg/g)   [IFN-α](mg/g)   pH   渗透压(mOsm)   尺寸(nm)   23   0.5   7.20   300   40

7)实施例2、3、4、5的体外结果

根据本发明的颗粒的活性成分释放通过L试验测得。

L试验中的释放如图1所示，以相对于时间的蛋白释放率表示。

比较例2的制剂中，只有一种聚合物带有疏水基团，显示出非常弱的释放 曲线，23后释放1.6％的蛋白。

比较例5的制剂，含有23mg/g的PE1颗粒，显示出与实施例3.1颗粒 (PE1/PE2-A，Z＝1-10mg/g)相似的曲线(分别为10小时内释放93％和48小 时内释放72％)。

对于实施例3.2中的颗粒(PE1/PE2-A，Z＝10和5mg/g)以及实施例3.3中 的颗粒(PE1/PE2-A，Z＝10和10mg/g)，观察到恒定的释放流，在实验结束 时不为0：所注射蛋白分别在48小时内释放65％和19％。

对于实施例4颗粒(PE1/PE2-B，Z＝1和5mg/g)中，观察到恒定的释放流， 在实验结束时不为0：所注射蛋白在48小时内释放7％。

8)实施例3、4、5的体内结果

44个小鼠分为5组，8或12个一组，平行给药立即释放的IR制剂或根据比 较例5的持续释放制剂，又或者本发明实施例3或4的制剂，剂量为300μg/kg。

药物代谢动力学结果如表VIII所示：

表VIII

  实施例   N   C_max  (ng/ml)   T_max中   值(间   隔)(小   时)   AUC   (ng×   h/ml)   T50％_AUC  (h)   RBA(％)   IFN IR   (0.5)   12   100.6   05   (0.25-1)   255.9   1.5   100   实施例4   8   1.8   3(3-6)   13.6   9.0   5   实施例   3.1   8   7.6   3(3-6)   126.4   11.4   49   实施例   3.2   8   6.1   3(3-6)   128.4   18.6   50   实施例   3.3   8   1.7   3(3-12)   74.2   30.7   ＞29   实施例5   8   3.5   12(6-24)   95.7   18.4   62

C_max代表所有动物的平均最大血浆蛋白质浓度。

T_max平均值代表血浆浓度达到最大值时的平均时间。

AUC代表作为时间函数的血浆浓度曲线下的平均面积。

T50％_AUC代表曲线下面积到达其总数值50％的平均时间。

RBA代表制剂的曲线下面积和IFN IR制剂的曲线下面积比值。

和IR相比，所有制剂的持续释放曲线伴随着C_max的下降。

实施例3.1的制剂(PE1/PE2-A，Z＝1-10mg/g)的释放曲线与比较例5的制 剂相近，除此以外，末端斜率较低，显示出延长的残留吸收。

对于实施例3.3的制剂(PE1/PE2-A，Z＝10和10mg/g)，注意到释放达到 超过一星期。

9)实施例6：制备基于PE1-A和PE2-C的颗粒，含有IFN-α。聚合物最终 浓度等于5mg/g，Z＝1

1.制备聚合物PE1-A的胶体溶液

使用根据合成a)得到的聚合物PE1-A。

通过溶于水得到聚合物PE1-A的胶体溶液，加入NaOH溶液调解pH到 7.15。通过加入所需量的NaCl水溶液调节溶液的渗透压至145mOsm。聚合物 PE1-A的浓度调节为3.10mg/g。

2.将治疗用蛋白与聚合物PE1-A结合：

2.7mg/g浓缩的蛋白IFN-α与89mOSM的NaCl加入上述聚合物PE1-A的胶 体溶液中，得到具有下述特征的结合：

  [PE1-A](mg/g)   [IFN-α](mg/g)   pH   渗透压(mOsm)   1.94   1.01   5.6   253

通过在25℃搅拌过夜完成上述结合。结合物调节pH到7.0。

3.制备PE2-C的胶体溶液

使用根据合成e)得到的聚合物PE2-C。聚合物的半中性pH大于9。

通过溶于水得到聚合物PE2-C的胶体溶液，调解pH到7.04。调节溶液的渗 透压至288mOsm。在140mOsm的PBS中的浓度为7.96mg/g。

4.混合得到颗粒

将15.147gPE2-C溶液逐滴搅拌加入16.374g IFN-α/PE1-A溶液。在4℃搅拌 过夜。

电荷比Z在pHm等于7下测得。颗粒的尺寸通过T试验测得。

得到的颗粒的性质如下表所示：

  [聚合物]   (mg/g)   [IFN-α]   (mg/g)   Z   pHm   渗透压(mOsm)   尺寸   (μm)   4.9   0.49   1.0   7.02   277   50.8

10)实施例7：制备基于PE1-A和PE2-D的颗粒，含有IFN-α。聚合物最终 浓度等于5mg/g，Z＝1

1.制备聚合物PE1-A的胶体溶液

使用根据合成a)得到的聚合物PE1-A。

通过溶于水得到聚合物PE1-A的胶体溶液，加入NaOH溶液调解pH到 7.02。通过加入所需量的NaCl水溶液调节溶液的渗透压至101mOsm。聚合物 PE1-A的浓度调节为2.0mg/g。

2.将蛋白与聚合物PE1-A结合：

2.7mg/g浓缩的蛋白IFN-α与89mOSM的NaCl加入上述聚合物PE1-A的胶 体溶液中，得到具有下述特征的结合：

  [PE1-A](mg/g)   [IFN-α](mg/g)   pH   渗透压(mOsm)   1.26   1.0   5.5   234

通过在25℃搅拌过夜完成上述结合。结合物调节pH到7.0。

3.制备聚合物PE2-D的胶体溶液

使用根据合成f)得到的聚合物PE2-D。聚合物的半中性pH大于9。

通过溶于水得到聚合物PE2-D的胶体溶液，用0.1N的HCl或0.1N的NaOH 调解pH到7。PE2-D聚合物的浓度调节为8.82mg/g。

4.混合得到颗粒

将1.2gPE2-C溶液逐滴搅拌加入1.2g IFN-α/PE1-A溶液。在4℃搅拌过夜。

电荷比Z在pHm等于7下测得。颗粒的尺寸通过T试验测得。

得到的颗粒的性质如下表所示：

  [聚合物]   (mg/g) [IFN-α] (mg/g)   Z   pHm   渗透压(mOsm)   尺寸   (μm)   5.0 0.48   1.0   7.1   286   13.6

11)实施例8：(比较例)含有IFN-α的基于PE1-A/PE2-D以及PE1-A/PE2-C 的颗粒的释放速率

根据上述实施例6和7所述的制备得到的颗粒通过L试验进行比较，L试验 为上述续流细胞释放测试。下表为所得结果：

综上所述，该实施例显示，能够特定地选择含有或多或少的中性和/或阴 离子基团的阳离子聚合物以调节AP的释放速率。因此，12小时之后，由PE2-C 得到的微颗粒的释放率为9.5％，由PE2-D得到的微颗粒的释放率为31％。