一种艾滋病毒P24的单克隆抗体杂交瘤细胞及应用

摘要

本发明公开了一种表达艾滋病毒P24的单克隆抗体杂交瘤细胞及应用，通过分离HIV阳性感染者体内的HIV病毒，扩增所分离病毒的P24蛋白基因，并通过载体体外表达和纯化获得P24蛋白，用纯化的P24蛋白免疫小鼠后，分离被免疫的小鼠脾脏B细胞并采用杂交瘤技术获得高效表达P24单克隆抗体的杂交瘤细胞，whiov－P24C－MoAb，CCTCC NO：C200818，该P24单抗可与P24蛋白特异性结合，用于探测P24抗原的表达。该P24单抗可以与艾滋病毒的P24蛋白特异性结合，在用于特异性检测P24蛋白时可以减少其他较差反应的干扰。

说明书

技术领域

本发明涉及艾滋病毒(HIV)的检测技术领域，更具体涉及一种表达艾滋病毒P24蛋白单克隆抗体(简称单抗)的杂交瘤细胞，同时还涉及一种HIV-1 P24的单克隆抗体在检测P24蛋白的ELISA检测方法中的应用(用于检测P24蛋白抗原的酶联免疫吸附检测(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELIS A)的方法)

背景技术

获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病(A IDS)，是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。自1985年中国发现首例A IDS病人以来，呈加速流行的趋势，疫情正在从高危人群向一般人群传播。由于目前尚无有效的预防疫苗和根治艾滋病的药物，所以早期检测、早期治疗才能最大限度减少对社会的危害。HIV抗体检测是HIV感染病原学检测最常用的方法，但血清抗体的出现一般发生于病毒急性感染后的第2周到12周，在抗体未产生之前或者没有检测到抗体出现的这个时期称为感染后的“窗口期”。此期间用一般的检测方法不能作出诊断，但在这段时间，感染了HIV的人可将HIV传染给他人而自己没有任何病征，而成为HIV的传染源。窗口期包含两个方面的意义：一是在此期机体自身是否真正针对HIV产生特异性的体液免疫而产生HIV抗体，微生物感染机体后1周左右最先产生IgM抗体，随后出现IgG；二是如果有抗体产生，但是所使用的抗体检测试剂敏感度不够，仍检测不出抗体，也被归为处于窗口期。可见提高检测HIV抗体试剂的敏感性对尽早关闭窗口期仍有重要意义。纵观HIV抗体酶联免疫诊断试剂的发展，20世纪80年代初第一代诊断试剂的窗口期大约是3个月；到80年代中期，由于使用重组合成多肽抗原，敏感性比第一代试剂有所提高，窗口期平均比第一代试剂缩短20天；为进一步提高试剂的敏感性，1994年发展了第三代HIV抗体初筛试剂，反应模式由第一代和第二代的间接法改变为双抗原夹心法，酶标记物由抗人IgG改变为特异性HIV抗原，可以检测HIV不同的抗体亚类，包括IgG、IgM、IgA等，第三代试剂比第二代试剂检出HIV抗体的时间提前4～9天；90年代末有了第四代试剂，同时检测HIV1/2/O抗体和p24抗原，称为HIV抗原/抗体试剂，抗体部分检测的敏感性和特异性与第三代试剂持平，由于加入抗原的检测可将窗口期缩短到感染后的14天。

第四代检测试剂的出现，其最主要的特征在于原有的抗体检测基础上增加了对于抗原的检测手段。在窗口期，病毒抗体不能被检出，但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。抗原能够在个体感染后先于血清转化2～18天被检测到，因此通过检测p24抗原可以作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法。HIV p24抗原检测主要有酶联免疫分析(EIA)、放射免疫分析(R IA)、免疫荧光分析技术(IFA)、免疫吸附电镜法(ISEM)等技术。其中以EIA为基础的测定p24抗原技术是检测HIV感染的常规方法。随着技术的进展，检测灵敏度不断提高，目前，p24抗原检测在以下几方面都有重要应用：HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断；HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断；监测病程进展和抗病毒治疗效果。窗口期的各种检测技术有助于HIV感染者的早发现、早诊断、早治疗，以遏制艾滋病的流行，减少艾滋病对个人、家庭及社会的危害。

特异性结合HIV-1 P24抗原的单克隆抗体还被广泛应用于科研领域，科学研究中经常需要用P24的抗原检测技术来鉴定抗病毒药物或者抗HIV的分子机理，无论是定性的检测还是定量的检测都需要以P24单克隆抗体作为技术基础。但有关P24的抗原检测试剂盒基本上被国外公司所垄断，在中国被使用的第四代艾滋病检测试剂盒就有美国Bio2Rad Laboratory产品(Gene2 Screen Plus HIV Ag2Ab)以及法国生物梅里埃公司的产品(Vironostika HIV Uni-Form II Ag/Ab)，近期国内厂商北京万泰公司也推出了第四代艾滋病检测试剂盒。在科研领域，单纯检测HIV P24抗原的检测试剂全是国外公司的产品，其中有法国梅里埃公司的Virono stika HIV Uni2Form II Plus O，美国贝克曼公司的Beckman Coulter′s HIV-1 p24 Antigen EIA kit，Advanced BioSciencesLaboratories公司的HIV-1 p24 Capture ELISA Kit，BioChain公司的HIV-1 p24 ELISAKit(HRP Detection)，Biotech Trading Partners公司的HIV-1 p24 ELISA Kit(QnE)，ImmunoDiagnostics公司的HIV-1 P24 Capture ELISA Kit。由于进口试剂过于昂贵，限制了更多国内实验室的广泛使用，不利于中国相关科研工作的开展。另外国外厂商制备的P24单克隆抗体均以欧美流行毒株的P24抗原为结合标的，在科研中有可能难以满足国内有关艾滋病研究的需要。研制基于中国流行毒株的P24单克隆抗体以及相关检测方法，不仅能满足国内科研人员的需求，有效降低使用成本，也有可能在以后的研究中为国内科研人员提供更加特异的检测需求。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种艾滋病毒P24的单克隆抗体杂交瘤细胞，其所表达P24单抗可与P24蛋白特异性结合，可用于探测P24抗原的表达。该P24单抗可以与艾滋病毒的P24蛋白特异性结合，在用于特异性检测P24蛋白时可以减少其他较差反应的干扰。该杂交瘤细胞是通过融合经抗原免疫的小鼠脾淋巴细胞及小鼠骨髓瘤细胞，不仅保留了脾淋巴细胞抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长的特征，而且具有小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖的特性。

本发明的另一个目的是在于提供了一种HIV-1 P24的单克隆抗体杂交瘤细胞所表达P24的单克隆抗体在检测P24蛋白的ELISA检测方法中的应用。以此单克隆抗体建立的ELISA检测方法能够特异性的检测P24抗原的存在。因此P24蛋白基因来源于国内流行HIV毒株，因此以其为基础所建立的快速检测抗原的方法对中国国内HIV感染具有更好的针对性。

为了达到上述的目的，本发明以中国流行的毒株为对象，通过分离HIV阳性感染者体内的HIV病毒，扩增所分离病毒的P24蛋白基因，并通过载体体外表达和纯化获得P24蛋白，用纯化的P24蛋白免疫小鼠后，分离被免疫的小鼠脾脏B细胞并采用杂交瘤技术获得高效表达P24单克隆抗体的杂交瘤细胞，利用该单克隆抗体开发新型的P24抗原ELISA检测试剂盒用于科学研究和医学中的应用。本发明采用以下技术措施：A、中国流行HIV毒株P24蛋白单克隆抗体的建立。

1、构建国内流行HIV毒株P24蛋白的表达质粒pET32a-p24：

分别从正常人和HIV-1感染者血液中分离外周血单核淋巴细胞(PBMCs)，将HIV阳性PBMCs和健康人PBMCs共培养以分离和扩增病毒，提取共培养细胞基因组DNA(整合有病毒基因组)。用上游引物P24-F1：gcccatggaccctatagtgcaa/gaac/t-3′和下游引物P24-R1：ggctcgagttacaaaactcttgc-3′扩增P24基因697bp长度，用核酸内切酶Nco I和Xho I分别酶切P24扩增产物和载体pET32a(购自北京捷瑞生物)，用连接酶将扩增的P24基因克隆进载体pET32a，经转化感受态大肠杆菌BL21(购自天根生化科技有限公司)，获得表达国内流行HIV毒株P24蛋白的质粒pET32a-P24。

2、P24蛋白的表达纯化和小鼠免疫：

将含有pET32a-p24表达质粒的大肠杆菌(BL21)接种至含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃培养过夜。取50μl过夜培养物接入5ml含氨苄青霉素的LB培养液，37℃振荡培养2h以上，至对数生长期，加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃继续培养5h。取1ml菌液离心收集细菌进行SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳检测。

4℃ 8000rpm/min离心10min收集表达菌体，用预冷的PBS洗涤菌体一次，4℃，8000rpm/min离心10min，用15ml的蛋白重悬缓冲液重悬菌体。菌体充分重悬后，加入溶菌酶(购自beyotime公司)至终浓度1mg/ml，用超声波裂解菌体(冰浴)，4℃，12000g离心20min去除不溶物，收集上清。上清用2ml镍螯合His-蛋白亲和层析树脂纯化，获得纯化的P24蛋白。

小鼠免疫：抗原加福氏完全佐剂皮下多点注射(脾下、腹股沟、脚掌)免疫多只BALB/C小鼠，分别在二周和四周后用抗原加福氏不完全佐剂进行两次加强免疫。7天后，毛细管眼眶采血，分离血清，用ELISA间接法测其效价，取效价高者做融合用。

3、杂交瘤及单抗制备：

杂交瘤制备：取脾前三天加强免疫，三天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏并研碎过无菌不锈钢筛网。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶5的数量比例混合，用45％PEG 4000(质量体积比，下同)介导融合，逐步加入不完全培养液稀释PEG，消除PEG的作用来终止融合。将融合细胞加到已有饲养细胞层的培养板培养，细胞培养至覆盖10～20％孔底面积时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆。

杂交瘤克隆化采用有限稀释法，选取阳性杂交瘤克隆转接于24孔板扩大培养，并做再次克隆化筛选，连续两次克隆率达到100％后，将克隆化细胞转入培养瓶扩大培养。

单抗制备：选用BALB/c小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将获得的杂交瘤克隆腹腔注射(1×10⁶个杂交瘤细胞)接种到小鼠体内，制备腹水或血清，7～10天后可产生腹水，待腹水尽可能多时，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。

4、单抗纯化和鉴定：

单抗纯化：采用SPA-Sepharose CL-4B(购自pharmacia-sigma公司)亲合层析纯化，葡萄球菌A蛋白(SPA)是存在于葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白，具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力。上柱前用1mol/LpH9.0Tris液调整样本液pH值至8.1或对平衡液透析过夜，样品上柱后用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，用不同pH(0.1mol/l pH＝4.0～6.0)的枸橼酸洗脱液洗脱，收集洗脱液测OD值，透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。

单抗的Ig类与亚类的鉴定：最经常得到的单抗是IgM和IgG，采用免疫扩散法鉴定单抗Ig类和亚类，检测标准采用小鼠IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM、IgA的抗血清。本发明所得单抗被鉴定为IgG1亚类。

B、双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法的建立：

多抗酶结合物的制备：纯化的P24蛋白抗原做免疫原，免疫家兔5支，取效价最高的兔血清，用DEAE52离子交换柱纯化，而后用过碘酸盐氧化法用HRP标记兔的P24多克隆抗体，获得酶结合的抗P24兔多抗。

ELISA方法建立：采用碳酸盐法将P24单抗包被到96孔酶标板上并用含30％(体积比，下同)小牛血清的PBST溶液封闭；加入待检测样本(设阴、阳对照)，37℃30分钟后用PBST冲洗5次；将不同稀释度HRP标记的P24多抗加入酶标板，37℃30分钟后用PBST冲洗5次；加入底物液和TMB 37℃10分钟，终止反应后于450nm测吸光度(A值)。以P/N值判定结果，大于2倍P/N为阳性，反之为阴性。

本发明与现有技术相比，本发明的P24蛋白基因扩增于国内流行毒株，获得单克隆抗体为针对该P24抗原的抗体，可适用于国内毒株的相关抗原检测。在窗口期，病毒抗体不能被检出，但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。抗原能够在个体感染后先于血清转化2～18d被检测到。因此，在血清转化期通过检测p24抗原有着很大的优势，且双抗原夹心法具有很好的灵敏性和特异性，且操作简单、快速，适合对大量样品的检测，是目前临床通用的初筛检测方法。(单抗在检测P24抗原中的具体应用方法的建立及其可靠性见实例2)。表1是不同稀释度的P24样本ELISA检测结果。

表1

  concentration-P24(pg/ml)  negative  Positive  80  40  20  5  OD450  0.029  2.022  0.774  0.383  0.208  0.104  OD450-Modified  0.034  1.998  0.726  0.335  0.160  0.056

附图说明

图1一种能够表达HIV病毒的P24蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞的流程图。

图2是表达质粒pET32a-P24表达的融合蛋白P24的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图。

[泳道1：含空载体pET32a的大肠杆菌BL21未经IPTG诱导培养5h；泳道2：含阳性重组质粒pET32a-p24的大肠杆菌BL21未经IPTG诱导培养5h；泳道3：含阳性重组质粒pET32a-p24经IPTG诱导5h；泳道4：蛋白质分子量标准(低)]。

图3是P24单抗的亚型鉴定的免疫琼扩结果示意图。

所获的P24单抗可与抗小鼠IgG1的抗体发生反应，而与其他小鼠抗体亚类无结合反应，显示该单克隆抗体为IgG1亚类。

图4是不同稀释度的P24的ELISA检测结果示意图。

显示出不同稀释度的检测样本具有良好的线性关系。

表1是不同稀释度的P24样本ELISA检测结果。

具体实施方式

实施例1：中国流行HIV毒株P24蛋白单克隆抗体的建立。

一、构建国内流行HIV毒株P24蛋白的表达质粒pET32a-p24：

1、材料获取和PBMCs分离：

通过湖北省武汉市疾病预防控制中心采集HIV-1感染者血液，湖北省武汉市中心血站提供HIV-1(-)健康人血液。按以下步骤分离PBMCs：

1)抗凝全血倒入尖底离心管中，室温(20-25℃，下同)下2,000rpm/min离心30min。

2)取中间白细胞富集层，置入离心管中，并加入其4倍体积含1％牛血清(体积比，下同)的PBS缓冲液。

3)另取一尖底离心管，预先在其中加入淋巴细胞分离液，其上缓缓加入细胞-PBS混合液，室温下2,000rpm/min，离心30min。

4)步骤三离心后液体分上下两层，取两层液体中间界面的淋巴细胞层转移至另一离心管中，加入含1％牛血清的PBS重悬，常温下2,000转/分钟离心10min。

5)弃上清，加入含1％牛血清的PBS重悬，2,000rpm/min离心10min。

6)弃上清，用含有10％牛血清1640培养液重悬细胞，37℃ 5％ CO₂(质量比，下同)培养。

2、共培养感染者PBMCs和健康人PBMCs，分离扩增HIV-1病毒。

将感染者PBMCs与用PHA刺激生长3天的健康人PBMCs混合，用含有20U/ml的IL-2、10％胎牛血清的1640培养液，37℃ 5％CO₂培养。

3、PCR扩增HIV-1p24基因

用细胞基因组DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit，购自QIAGEN公司)提取细胞基因组DNA。利用引物P24-F1：5’-gcccatggaccctatagtgcaa/gaac/t-3’和引物P24-R1：5’-ggctcgagttacaaaactcttgct/ctta3’，扩增上述提取的总DNA中HIV-1 p24 697bp的片断。在无菌PCR管中加入：10μl 10×Ex Taq PCR缓冲液，2μl 10mM dNTPs，20μM上游及下游引物各2μl，2μl模板DNA，0.5μl Ex Taq聚合酶(购自大连宝生物公司)，加水至100μl总体积。反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min；4℃∞。

4、琼脂糖凝胶电泳和回收PCR产物。

用1％琼脂糖凝胶(含10ng/ml EB)电泳分离PCR产物，电泳结束，将凝胶置于紫外分析仪内，切取含PCR产物的胶块，用DNA凝胶回收试剂盒(QIAquick GelExtraction Kit，购自QIAGEN公司)回收，PCR产物最后溶于30μl的Elution Buffer中。

5、限制性内切酶分别酶切载体pET32a和p24PCR扩增产物

分别将质粒pET32a和p24PCR扩增产物用Nco I和Xho I(内切酶购自大连宝生物公司，下同)进行双酶切，酶切反应参照限制性内切酶说明书操作，反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物。

6、DNA连接、转化大肠杆菌：

在无菌Eppendorf管中加入2μl p24的酶切产物，2.5μl质粒pET32a的酶切产物，0.5μl T4连接酶，1μl T4连接酶缓冲液，加水至10μl，混匀，16℃连接12h，将2μl连接产物加入到100μl感受态大肠杆菌TG-1(购自广州市十环医药科技有限公司)，混匀，42℃热激转化，加入800μl LB培养液，37℃振荡培养1h，将菌液涂布在氨苄青霉素抗性的LB培养基上，37℃培养过夜。

7、阳性克隆的鉴定

从步骤4转化的pET32a-p24/TG1平板上挑取6个菌落接种至5ml含氨苄的LB，37℃振荡培养过夜。用Omega公司质粒提取试剂盒提取质粒，参照试剂盒说明书进行操作，获得质粒pET32a-p24。用Nco I和Xho I双酶切质粒，并以质粒为模板，利用步骤3中的HIV-1p24的PCR扩增引物进行PCR扩增。

8、DNA序列测定：

将质粒pET32a-p24送Invitrogen上海英俊测序服务公司，采用ABI3730型测序仪测定DNA序列。

9、阳性克隆转化表达用大肠杆菌BL21：

在100μl大肠杆菌BL21电击感受态中加入步骤7筛选到的pET32a-p24质粒1μl，混匀，2500V电击转化，加入800μl LB培养液，37℃振荡培养1h，将菌液涂布在氨苄青霉素抗性的LB培养基上，37℃培养过夜，挑取1个单菌落保存，该单菌落为含有表达质粒pET32a-p24的BL21大肠杆菌，可用于体外大量表达生产P24融合蛋白。该菌种用于表达P24融合蛋白和免疫小鼠描述如后。

二、P24蛋白的表达纯化和小鼠免疫

1、p24的诱导表达

将上述含有pET32-P24质粒的菌种接种至含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃培养过夜。取50μl过夜培养物接入5ml含氨苄青霉素的LB培养液，37℃振荡培养2h以上，至对数生长期，加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃继续培养5h。取1ml菌液离心收集细菌进行SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳。

2、P24融合蛋白的纯化

4℃8000rpm/min离心10min收集表达菌体，用预冷的PBS洗涤菌体一次，4℃，8000rpm/min离心10min，用15ml的蛋白重悬缓冲液重悬菌体。菌体充分重悬后，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，用超声波裂解菌体(冰浴)，4℃，12000g离心20min去除不溶物，收集上清。上清用2ml镍螯合His-蛋白亲和层析树脂(His-bond Ni AffinityResin购自Invitrogen公司)纯化：

(1)75％乙醇预洗层析柱；

(2)彻底悬浮His-bond Ni Affinity Resin，吸取2ml至层析柱；

(3)用2倍柱体积的去离子水洗涤；

(4)用3倍柱体积的蛋白重悬液平衡树脂；

(5)加入含目的蛋白的溶液，将流速控制在2-10倍柱体积/h；

(6)加入30ml洗涤液(蛋白重悬缓冲液)洗涤树脂，将流速控制于10～20柱体积/h；

(7)加入洗涤液(蛋白重悬缓冲液中加入20mM咪唑)洗涤树脂，当流出液的OD₂₈₀值接近洗涤液的值时，洗涤完成；

(8)加入蛋白洗脱液(蛋白重悬缓冲液中含400mM咪唑)洗脱目的蛋白，将流速控制在2～10倍柱体积/h。分管收集洗脱液并测定每管OD₂₈₀值；

(9)合并含目的蛋白量较高的几管洗脱液，4℃透析24h。准备进行蛋白浓度测定。

3、蛋白浓度测定：用TIANGEN公司的Bradford蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度。

(1)将0μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、14μl、18μl BSA标准溶液(1mg/ml)分别加入到试管中，加入PBS补足到100μl；

(2)将适当体积的样品加入到试管中，并用PBS补足到100μl；

(3)向各试管中加入500μl考马斯亮蓝染液(G-250)，混匀，室温放置5-10min；

(4)用eppendorf公司Biophotometer选中Bradford，测定BSA标准蛋白稀释品的595nm的吸光值(A₅₉₅)，得到标准曲线，然后测定样品的A₅₉₅，直接获得样品中蛋白浓度。

4、小鼠免疫：抗原免疫BALB/C小鼠，免疫程序如下：

(1)初次免疫，纯化蛋白100μg/支鼠，加福氏完全佐剂皮下多点注射(脾下、腹股沟、脚掌)，0.15ml/只鼠。

(2)二周后，第二次免疫，剂量50ug/只鼠，加福氏不完全佐剂皮下多点注射(脾下、腹股沟、脚掌)。

(3)四周后，第三次免疫，剂量50ug/只鼠，加福氏不完全佐剂皮下多点注射(脾下、腹股沟、脚掌)。

(4)7天后，毛细管眼眶采血，分离血清，用ELISA间接法测其效价，即用基因抗原P24包板，加入小鼠血清稀释品37℃孵育，洗板加入羊抗鼠辣根酶结合物37℃孵育，洗板加入TMB底物显色，取效价高者做融合用。

经P24融合蛋白免疫的小鼠将被用于分离脾细胞以构建单克隆抗体杂交瘤，具体方法描述如后。

三、杂交瘤构建和单抗制备

1、杂交瘤融合：采用PEG介导融合

1.细胞融合材料：

(1)骨髓瘤细胞系的准备：本研究选择SP2/0骨髓瘤细胞系。骨髓瘤细胞的培养用RPMI1640培养基、小牛血清浓度10％，细胞浓度以10⁴～5×10⁵/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1∶3的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

(2)饲养细胞：小鼠腹腔巨噬细胞，饲养细胞的量为一般为2×10⁴或10⁵细胞/孔。

2.细胞融合的步骤

(1)制备饲养细胞层：用小鼠腹腔巨噬细胞。

BALB/C小鼠，6～10周龄，拉颈处死，浸泡在75％(体积比，下同)酒精内，3～5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管)，反复冲洗，吸出冲洗液，冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min，用20％(体积比，下同)新生牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的DMEM培养液混悬，调整细胞数至1×10⁵/ml，加入96孔板，100μl/孔，放入37℃ CO2孵箱培养。

(2)制备免疫脾细胞

最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，培养液洗一次，脾脏研碎，过不锈钢筛网。离心，细胞用培养液洗2次，计数取10⁸脾淋巴细胞悬液备用。

3.细胞融合程序：

(1)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm，8min；弃上清，用吸管吸净残留液体。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

(2)90秒内加入37℃预温的1ml 45％(体积比，下同)PEG(分子量4000)溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90秒。

(3)加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

(4)离心，800rpm，6min。

(5)充上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬。

(6)将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。

(7)将培养板置37℃、5％CO₂培养箱中培养，每空可得到一到多个表达P24抗体的阳性杂交瘤细胞系。

2、抗体的检测：

采用捕获法：

1)即羊抗鼠IgG在PH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至5ug/ml，每孔100ul包被96孔板。

2)洗板封闭，加入待测得细胞培养上清，捕获其中的IgG.37度孵育洗板。

3)加入裂解HIV病毒抗原，37度孵育洗板。

4)再加入兔抗P24-HRP结合物，37度孵育洗板

5)洗板加TMB显色选阳性显色高的孔做再克隆。

3、杂交瘤的克隆化：

杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化；即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

采用有限稀释法克隆

(1)克隆前1天制备饲养细胞层(同细胞融合)。

(2)将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。

(3)调整细胞为3～10个细胞/ml。

(4)取前一天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5％CO2孵箱中。

(5)在第7天换液，以后每2～3天换液1次。

(6)8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。

(7)将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。

(8)将细胞从24孔转到培养瓶中，每个克隆应尽快冻存。

(9)连续两次克隆率得到100％表达P24蛋白阳性杂交瘤细胞。(2008年4月28日已在武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏该细胞，保藏号CCTCC NO.200818，分类命名：杂交瘤细胞whiov-P24C-MoAb)

4、杂交瘤细胞的冻存与复苏：

1、杂交瘤细胞的冻存

(2008/4/28已在武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏该细胞，保藏号CCTCCNO.C200818)

及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×10⁶以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变。

细胞冻存液(体积比)：50％小牛血清；40％不完全培养液；10％DMSO(二甲基亚砜)。

冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

2、细胞复苏方法

将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入前一天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5％CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。

5、单克隆抗体的扩大制备：

体内接种杂交瘤细胞，制备腹水。

腹水的制备：先腹腔注射0.5ml Pristane(降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。

典型杂交瘤细胞的制作，培养及其形态特征如下：

杂交瘤细胞是在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和效应B细胞融合而成的细胞。杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠细胞作小鼠骨髓瘤细胞。脾淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有b细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆，这种杂种细胞叫做杂交瘤细胞。

瘤细胞培养(无特殊要求)

骨髓瘤细胞呈悬浮或轻微附着形式生长，如附着性生长的细胞多时，用吸管轻轻吹打或轻轻叩击培养容器即可分离下来。通常要维持细胞于指数生长期(细胞培养时间为15~20小时)，每3~5天取细胞0.2~1ml移入到10ml新培养液中，其最大细胞密度不能超过5×10⁵~10⁶/ml。一般使用含有高糖的DMEM培养液，并补加有pH的稳定剂HEPES。

2)免疫小鼠和脾细胞的制备

免疫：取6~8周龄Balb/C雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，3~5天后用于融合。

脾细胞制备：

1.引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。

2.无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次。

3.把脾脏置于已消毒的90~100目不锈钢网或尼龙纱网中。

4.在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可。

5.把细胞悬液注入50ml离心管中，加10~20ml培养液，轻轻吹打数次，室温中置5分钟。

6.离心(800~1000转/分)计数，备用。

3)饲细胞的制备：常用小鼠胸腺细胞或小鼠的腹腔细胞

小鼠腹腔细胞制备方法：

1.引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。

2.切开腹部皮肤剥向两侧，暴露出腹壁。

3.用无菌7号针头注射器，吸取3ml无血清培养液。

4.用小镊夹起腹壁，注入3ml无血清培养液，用手反复轻轻揉腹壁，再反复抽吸3~5次。

5.收集末次吸得的细胞，注入50ml的离心管中，再加20ml无血清培养液，用吸管漂洗一次。

6.离心，去上清，用含血清培养基调节细胞浓度为2×10₅/ml，接种入培养板中，24孔板每孔加0.1ml。</P＜p>

4)细胞融合

HAT培养基的制备

[贮备液成分]100×

次黄嘌呤(Hypoxanthine：H)        1.0×10^-2M

胸腺嘧啶核苷(Thymi dine：T)      1.6×10^-3M

氨基喋呤(Amiropterin：A)         4.0×10^-5M

[HT贮备液制备]

1.称取136.1mg H，38.8mg T。

2.依次溶解在100ml双蒸水中，H难溶，可加温50~80℃促溶。

3.用0.22微米滤膜滤过除菌，每瓶分装2~5ml，-20℃冰箱贮存。

[A贮备液制备]

1.称取17.6mg A到90ml双蒸水中。

2.滴加1M NaOH溶液并不断摇动，直至完全溶解，再滴加等量1M HCl溶液，恢复pH在7.0左右。

3.补足双蒸水至最终体积100ml。

4.0.22微米滤膜滤过除菌，分装，-20℃冰箱贮存。使用时，每100ml培养液(含血清)加1ml HT贮备液和1ml A贮备液。

PEG(诱导剂)的制备(30％~50％)

1.取分子量1000的PEG高压蒸气灭菌(6.8公斤，15分钟)

2.56℃水浴中融化后，37℃水浴中温浴。</P＜p>

3.取无血清培养液37℃水浴中温浴(单独)

4.配40％浓度时，用刻度吸管吸0.4ml PEG和0.6ml无血清培养液混合、37℃水中温育备用。

细胞准备：

1.收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，计数活力细胞(不少于90％)。

2.收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，并计细胞数和测定活力细胞。

3.按1∶5或1∶10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。

融合：

方法一：

1.将1ml 40％的PEG液一滴滴加入到细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微转动离心管或用手指轻弹离心管。

2.在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完。

3.于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养基。此时细胞对机械损伤非常敏感。

4.离心(800转/分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀。

5.取96孔板，每孔加50微升。

6.取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50微升。

7.送入5％CO₂温箱中37℃培养，24小时后更换成HAT选择性培养液。

方法二：

1.加0.2ml 43％的PEG于离心管中。

2.用预先消毒的细玻璃针伸入管中轻轻搅动细胞团。</P＜p>

3.室温中置2分钟。

4.加入10ml完全培养液。

5.800转/分离心5分钟。

6.用2倍HAT培养液培养悬浮细胞，取24孔板，每孔中加0.5ml，另96孔板每孔中加0.1ml。

7.5％CO₂温箱，37℃，一周后第一次更换培养液，培养板中预先接种有饲养细胞，加2×HAT选择培养液与原等量培养液混合后，即成为1×的HAT培养基。

融合后细胞培养

1.融合后7~10天用HAT培养液变量换液，以后每隔2~3天半量换液一次。

2.两周后可改用HT培养液半量换液，或仍用HAT培养液。

3.2~3周后出现杂交细胞集落，细胞个大，圆且透明。

4.待集落增殖生长至1/3孔时，应进行抗体检测。

克隆化培养

[软琼脂培养]

1.称1g琼脂粉，加入到100ml双蒸水中，高压蒸气灭菌，4℃冰箱保存。

2.使用前，1％的琼脂和2×的DMEM培养液在45℃水浴中分别温浴。

3.二者等体积混合后，立即加入1.5×10⁷小鼠脾细胞，混匀。

4.立即到入平皿中，每平皿(直径10cm)加10ml，室温中置15分钟。

5.另取杂交瘤细胞悬液和0.5％琼脂等体积混合(0.25％琼脂)，加2ml到预先铺有底层琼脂的瓶皿内。</P＜p>

6.CO₂温箱培养。

7.10~15天后，有细胞集落形成，适时移入24孔培养板中扩大培养。如用琼脂糖，底层浓度为0.6％，上层为0.3％琼脂。

[有限稀释法]

1.制备有饲养细胞底层的细胞培养板。

2.收集细胞、计数阳性培养细胞。

3.细胞悬液调至5~10个细胞/ml。

4.96孔板中每孔加0.1ml。

5.CO₂温箱培养一周后，半量换液，继续培养。

6.适时检测每孔培养上清，挑选呈阳性培养孔的细胞继续进行有限稀释，直至确信孔中细胞为单克隆为止。

7.进行扩大培养。

四、单抗纯化和鉴定：

1、单抗纯化：采用SPA-Sepharose CL-4B亲合层析纯化IgG及IgG亚类。

葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-SepharoseCL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。

1、材料

1)SPA-Sepharose L-4B(购自pharmacia)

2)磷酸缓冲液0.1mol/L pH8.0+0.02％NaN3

3)枸橼酸缓冲液0.1mol/LpH6.00.1mol/LpH4.0 +0.02％ NaN30.1mol/LpH3.0

4)1mol/L pH9.0Tris溶液

5)再生缓冲液：①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl调整pH至8.5+0.02％NaN3；②0.1mol/L醋酸钠含0.5mol/L NaCl调整pH至4.5+0.02％NaN3。

2、操作步骤

1)用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶，(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)。

2)装柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡。标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤，上样前用1mol/L pH9.0Tris液调整标本液pH值至8.1或对平衡液透析过夜。

3)加样，一般按25～30mg IgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为＜0.02。

4)用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0；纯IgG2a用pH4.0；纯化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/L pH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。

5)用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。

6)收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。

7)柱再生：先用10倍柱体积0.1mol/LpH8.5Tris含0.5mol/LNaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。

2、单克隆抗体的Ig类与亚类的鉴定

最经常得到的单抗是IgM和IgG，分泌IgE的杂交瘤细胞很少见。本研究鉴定单抗Ig类和亚类的方法是免疫扩散法。

这种方法简便、准确。被检的McAb样品通常为杂交瘤细胞培养上清液，由于其中单抗的浓度较低，应先将其浓缩10-20倍左右再检测。小鼠腹水中的单抗浓度虽很高，但也含有小鼠本身的各类Ig，它们也会与相应抗血清发生反应，因此一般不用腹水型单抗作为被检样品。

1、材料：

1)小鼠IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM、IgA的抗血清。

2)0.06mol/L巴比妥钠-盐酸缓冲液(PH8.6)。

3)1％(质量体积比，下同)琼脂糖凝胶：1g琼脂糖加入100ml 0.06ml/L PH8.6巴比妥钠-盐酸缓冲液中，隔水煮沸溶解，加0.02％NaN3防腐，4℃保存备用。

4)洁净载玻片，打孔器(直径3mm)，湿盒，酒精灯。

2、方法：

1)杂交瘤细胞培养上清液的浓缩：取该上清液10ml装入透析袋中，用线扎紧，放在小烧杯中，透析袋周围堆置PEG6000或蔗糖或PVP(聚乙烯吡咯烷酮polyvinylpyrrolidone)，放于4℃数小时，待透析袋内液体量浓缩至约0.5-1ml时，吸出，可于-20℃保存备用；也可采用吹风蒸发浓缩。

2)加热溶化1％琼脂糖凝胶，铺制琼脂糖板，每片约3ml。

3)待琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打出梅花形的小孔(中央1孔，周围6孔)，然后封底。

4)向中央孔加入抗小鼠IgG类或亚类抗血清，周围孔加入待检样品；加样后将琼脂板放入湿盒，置37℃水浴箱中12-24小时或4℃过夜，观察结果。

本单抗被鉴定为IgG类IgG1亚类。(见图3)

实施例2、双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法的建立

1、P24多抗酶结合物的制备：

用获得的纯化重组抗原做免疫原，免疫家兔5支，取效价最高的兔血清，用DEAE52离子交换纯化，而后用过碘酸盐氧化法将HRP标记兔的多克隆抗体。

1)将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中，加0.1ml 1％(体积比，下同)氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液，在室温中混合；

2)加入1ml 0.04Mol/L～0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO₄)，置室温(20-25℃以下相同)中轻搅30min，在溶液呈黄绿色时，加1ml 0.16Mol/L 乙二醇溶液，在室温中放置1h，使氧化反应中止；

3)然后在4℃中对0.10Mol/LpH 9.5重碳酸钠缓冲液透析，换液3次。

4)在3ml HRP-醛基溶液中，加入5mg氢化硼钠(NaBH4)，于4℃冰箱放置3h或过夜，然后用PBS液充分透析，离心去沉淀物。上清液即为得到的与HRP结合的抗P24蛋白多克隆抗体，纯化后使用。

2、双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测P24抗原

1)0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释包被单抗至包被浓度5μg/ml，加入酶标板100μl/孔，置4℃过夜，甩干；

2)含30％小牛血清的PBST(0.02mol/L pH7.4PBS含0.05％(体积比，下同)Tween-20)封闭200μl/孔，37℃1小时，甩干；

3)用PBST洗板1次，加入样品稀释液(含10％Trinton-100)5μl/孔，然后加入浓度分别为5，20，40，80pg/ml的待测样本各50μl/孔，并设阴、阳对照孔，37℃孵育30分钟；

4)以PBST冲洗5次，甩干；将HRP标记的多抗稀释后加入酶标板(50μl/孔)，37℃30分钟；

5)以PBST冲洗5次，甩干；加入底物液和TMB(各50μl/孔)，37℃10分钟；

6)加入2mol/L硫酸50μl/孔终止反应，于450nm测吸光度(A值)。以P/N值判定结果，，大于2倍P/N为阳性，反之为阴性。

酶标多抗的最终稀释浓度为1μg/ml。

该结果具有良好的线性趋势(见图4)，表明本ELISA检测方法具有良好的定量特点。