木通皂苷D及其组合物在制备防治老年痴呆药中的应用

摘要

不同纯度的木通皂苷D用于制备预防或治疗老年痴呆的组合物，可与药学上可接受载体混合。

说明书

技术领域

本发明的涉及不同纯度的木通皂苷D在制备预防和治疗老年痴呆症的组合物中用途。

背景技术

老年痴呆症分为阿尔茨海默病(简称AD，全文同)、血管性痴呆(简称VD，全文同)和混合型痴呆(简称MD，全文同)等。

AD患者大脑的改变以脑普遍萎缩，神经元和神经突触丢失，神经斑块(老年斑SP)沉积和含有tau蛋白的神经纤维缠结(NFT)为特征。因此，能使神经元再生(如海马区神经元再生)、阻止神经递质(如乙酰胆碱)降低以及对抗β-淀粉样蛋白造成的损伤(如以β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积为核心的老年斑及β-淀粉样蛋白在脑软膜小血管壁上沉积)均有可能对AD的治疗有一定的作用。AD患者大脑的神经化学改变主要为胆碱能功能减退，皮质和海马广泛区域乙酰胆碱活性降低，胆碱能神经元及纤维变性、坏死和缺失。脑内ChAT活性及Ach含量降低被公认是AD的一个重要特征。胆碱的缺失是AD的特征，临床曾尝试采用多种药物提高病人脑内乙酰胆碱的水平以补偿其胆碱能功能的缺失，来达到治疗AD的目的。目前最为成熟和成功的治疗AD的方法就是是采用AchE抑制剂，迄今为止，AchE抑制剂是唯一类通过美国FDA批准用于治疗AD的药物。

胆碱酯酶抑制剂通过减少突触间隙处胆碱酯酶对突触前神经元释放的乙酰胆碱的水解，增加了此处乙酰胆碱的含量，因此对AD有一定疗效。但是胆碱酯酶抑制剂只能延缓患者症状(日常生活能力、冷漠、焦虑、抑郁和幻觉等精神症状)出现的时间，而不能逆转疾病过程。胆碱酯酶抑制剂的主要副反应是胃肠道反应(恶心、呕吐、腹泻、食欲不振)，它与剂量有关，在大多数情况下缓慢增加剂量可缓解这一副反应。对体重过轻的患者，胃肠道反应可能会限制该类药物的使用。心血管副反应(心动过缓、晕厥)不常见，但有窦性心动过缓或其他室上性传导阻滞的患者应慎用；应注意所有用胆碱酯酶抑制剂的患者都有可能发生晕厥，包括没有心脏病史或心电图异常的患者。胆碱能药物都有刺激神经肌肉接头的作用，可导致肢体末端肌肉痉挛，这种痉挛通常与剂量有关，而且是一过性的。其它少见的副作用是失眠和抑郁加重，采用早上服药可减轻失眠的副作用，用胆碱酯酶抑制剂前先治疗抑郁可减轻抑郁加重的副作用。

血管性痴呆是由于脑血管因素导致脑循环障碍、脑组织受损引起的一种记忆力衰退以及至少1项认知功能(即语言、视空间、定向力或抽象思维)减退的疾病。VD多发生于高血压、动脉硬化、糖尿病基础之上。

VD患者90％有脑内多发、双侧分布的梗塞灶，以大脑皮质下基底节区最易受累，梗塞灶小造成的神经症状可轻微，但多发梗塞可使皮质下白质传导纤维多处断裂，部分神经通路中断。额叶皮质血流显著降低，可能就是由于深部白质病变引起投射纤维功能联络中断所致。有研究证明：微小梗塞灶除引起实际病灶区血流降低、功能低下外，还可以通过中断神经联络导致远隔部位的血流降低、功能低下。由此可见VD是在广泛动脉粥样硬化基础上，全脑血流下降、脑实质多发小灶性缺血改变和特定皮质神经传导功能缺失的结果。此外，VD组颞叶皮质血流降低，与其临床上表现严重记忆力减退一致，其原因可能是颞叶内侧部如海马也存在梗塞病变。临床上采取可以治疗动脉粥样硬化，改善血液循环的药物进行治疗VD。但该类西药副作用明显，会产生鼻塞、恶心和胃肠不适，且有心脏疾病的患者不能服用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是研究不同纯度的木通皂苷D在制备预防和治疗老年痴呆症的组合物中用途。

为解决上述问题，提供技术方案如下。

不同纯度的木通皂苷D在制备预防或治疗老年痴呆组合物中的应用。

所述不同纯度的木通皂苷D含量5-100％；优选纯度的木通皂苷D含量80～100％。

所述老年痴呆包括阿尔茨海默病、血管性痴呆和混合型痴呆。

所述组合物包括不同纯度的木通皂苷D与药学上可接受的载体或者常规食用辅料。

本发明还包括不同纯度的木通皂苷D与其它具有活血化瘀或改善记忆或提高免疫力的药物混合在制备预防或治疗老年痴呆组合物中的应用。

所述具有活血化瘀或改善记忆或提高免疫力的药物选自以下物质中的一种或多种：丹参酮、葛根素、槲皮素、华中五味子酮、灵芝多糖、三七总皂苷、石杉碱甲、白藜芦醇、红景天素、蛇床子素、川芎嗪。

所述具有活血化瘀或改善记忆或提高免疫力的药物选自以下物质中的一种或多种：银杏叶、楮实、远志、紫河车、红花、桃仁、石苍蒲及它们提取物。

本发明用对神经元的再生、乙酰胆碱酯酶的抑制以及对Aβ25-35所致的细胞损伤的保护作用等方法，筛选出不同纯度的木通皂苷D用于制备预防或治疗AD组合物，该组合物对血管性痴呆(VD)和混合型痴呆(MD)也有一定预防和治疗作用。本发明包括用不同纯度的木通皂苷D与药学上可接受载体混合。

药学上可接受的载体包括口服制剂辅料或胃肠外途径给药的辅料。给药途径可以是口服、注射、局部给药等。根据本发明的技术方案，该组合物可以是口服制剂或注射用制剂，其中口服制剂包括胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、口服液、片剂、滴丸等。所用辅料包括：淀粉、蔗糖、乳糖、糖粉、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇、微晶纤维素钠、糊精、环糊精、氯化钠、维生素C、半胱氨酸、柠檬酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、硬脂酸盐和明胶等常规辅料，制剂的后期制备工艺及设备均属制药领域的常规技术，本发明对此不作限定，故在此不予详述。

本发明组合物口服给药的剂量为2-3次/天，0.15～0.45g/次。

本发明还包括不同纯度的木通皂苷D与其它具有活血化瘀或改善记忆或提高免疫力的药物混合，制备预防或治疗老年痴呆的药物。例如：将不同纯度的木通皂苷D与选自银杏叶、楮实、远志或紫河车及它们提取物中的一种或多种进行组配，用本领域常规方法，制备预防或治疗老年痴呆的组合物，可以加入常规载体，制成各种制剂。再如：将不同纯度的木通皂苷D与选自丹参酮、葛根素、槲皮素、华中五味子酮、灵芝多糖、三七总皂苷三七总皂苷、石杉碱甲、白藜芦醇、红景天素、.蛇床子素中的一种或多种进行组配，用本领域常规方法，制备预防或治疗老年痴呆的组合物，可以加入常规载体，制成各种制剂。

本发明不同纯度的木通皂苷D提取物是从天然的中药续断中提取得到的，续断是常用的中草药，具有补肝肾的作用，有长期的中医用药经验，该药使用安全性高，上无毒性作用记载。

不同纯度的木通皂苷D有抗老年痴呆活性，都有促进神经元的再生、抑制乙酰胆碱酯酶以及对Aβ_25-35所致的细胞损伤的保护作用，这些药理作用协调产生显著的预防或治疗抗老年痴呆药效。

实施例一

不同纯度的木通皂苷D的制备

不同纯度的木通皂苷D的提取、分离

取1kg续断药材，粉碎成米粒大小，用95％的乙醇水浴回流提取3次，每次分别为2、1.5、1小时，每次加入乙醇的量分别为10、9、8倍量(药材∶乙醇＝W∶V)。取第2次提取液1000ml，水浴减压回收乙醇至小体积，直接干燥，得第6份含木通皂苷D的样品，其木通皂苷D纯度为5％(含量测定方法见下)。

提取液过滤，合并，水浴减压回收乙醇至小体积(每1公斤药材约得浓缩液750ml)，得浓缩液。浓缩液取出50ml，直接干燥，得第5份含木通皂苷D的样品，即纯度为22％的木通皂苷D(含量测定方法见下)。

浓缩液用石油醚萃取脱脂，直至石油醚无色。脱脂后的浓缩液取出50ml，直接干燥，得第4份含木通皂苷D的样品，即纯度为44％的木通皂苷D(含量测定方法见下)。

脱脂后的浓缩液用稀盐酸(1N)调pH3-4，每1公斤药材的酸化浓缩液用10L氯仿分次萃取，合并萃取液，用稀氢氧化钠液(1N)中和氯仿萃取液至pH7。水浴减压回收氯仿近干，得第3份含木通皂苷D的样品，即纯度为62％的木通皂苷D(含量测定方法见下)。

将第3份含木通皂苷D的样品约5g，拌入1.5g硅胶，上样到200g的100-200目的硅胶柱上，用不同比例的氯仿-甲醇系统洗脱，约在氯仿-甲醇＝8∶2处，得第2份含木通皂苷D的样品，即纯度为81％木通皂苷D(含量测定方法见下)。

将第2份含木通皂苷D的样品，经ODS柱分离，用甲醇-水系统洗脱，约在甲醇-水＝6∶4处，得第1份样品，即纯度为90％的木通皂苷D。含量测定方法见下。

纯度为100％的木通皂苷D的样品，为中检所提供的标准品。

附：不同纯度的木通皂苷D的含量测定

仪器型号：采用Anglient1100S高效液相色谱仪。按照《中国药典》九五年版一部VI D项下规定进行高效液相色谱法测定。色谱条件与系统适应性试验：色谱柱为AichromBond-1C18；流动相为0.1％TFA H₂O∶0.1％TFA CH₃CN＝71∶29；流速为0.8ml/min；柱温30℃，测定波长为215nm；理论板数按木通皂甙D计算不低于3000。对照品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的木通皂甙D对照品适量，加甲醇溶液制成每1ml中含200μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品内容物20mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇溶液30ml，置80℃水浴中加热30分钟，趁热超声20分钟，取出，冷却至室温，用甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，经0.45um滤膜滤过，即得。

测定：分别精密量取25μl的对照品(木通皂苷D标准品购于北京药品生物制品检定所)和样品液，分别注入液相色谱柱，测定峰面积，计算含量，即得。

精密度实验、重现性实验、加样回收率实验结果均符合要求。

含量测定结果：第1份样品木通皂苷D含量为100％；第2份样品木通皂苷D含量为81％；第3份样品木通皂苷D含量为62％；第4份样品木通皂苷D含量为44％；第5份样品木通皂苷D含量为22％；第6份样品木通皂苷D含量为5％。

实施例二

不同纯度的木通皂苷D对胆碱酯酶抑制作用

胆碱(ChE)的缺失是AD的特征之一。抑制胆碱酯酶的活性可以减少胆碱的缺失，从而减轻或者缓解AD的症状。乙酰胆碱酯酶(AchE)分布于神经细胞、红细胞和血清等组织中；乙酰胆碱酯酶(BuChE)主要分布于神经组织、血浆等中。因此采用人血来筛选胆碱酯酶抑制剂，可以为临床提供更有效的制剂。

1、仪器与材料：CP225D型天平(德国Sartorius公司)，HP8453紫外-可见分光光度计(美国惠普公司)，LG 10-2.4A离心机(北京医用离心机厂)，恒温水浴(上海精宏实验设备有限公司)。磷酸二氢钾(广州化学试剂二厂)，磷酸氢二钠，(广州化学试剂二厂)，0.9％Sodium chloride injection(广东利泰药业有限公司)，Acelythiocholine iodide(＞98％)(SIGMA公司)，S-Butyrlthiocholine iodide(＞98％)(SIGMA公司)，DTNB[5，5-Dithiobis(2-nitrobenzoicacid)即5，5’-二硫代双2-硝基苯甲酸](SIGMA公司)，全血、血清(自身采血)。

胆碱酯酶DTNB比色法测定。胆碱酯酶水解乙酰硫代胆碱生成硫代胆碱和乙酸。硫代胆碱和巯基显色剂5，5’-二硫代双2-硝基苯甲酸反应，生成黄色化合物5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNBA)，在412nm波长下比色定量。

2、试剂配制：67mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS PH7.40)配制：称取无水磷酸二氢钾(KH₂PO₄)9.07g，用去离子水溶解并稀释至1L(甲液)；称取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)23.87g，用去离子水溶解并稀释至1L(乙液)。取甲液19.2ml与乙液80.8ml混和即得。

25mol/L碘化乙酰胆碱(ASch)溶液配制：称取ASch(生物试剂)72.3mg，置于10ml容量瓶中，加入145mol/L氯化钠溶液溶解并稀释至刻度。3％SDS溶液的配制：取3.0g十二烷基硫酸钠，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度。5mmol/LDTNB溶液培植：称取5，5’-二硫代双2-硝基苯甲酸1 9.8g，加67mmol/L(PH7.40)PBS约2ml使完全溶解，再用145mol/L氯化钠溶液稀释至10ml，置冰箱中保存。临用时，用145mol/L氯化钠溶液稀释10倍。

供试药物样品液的配制：称取不同纯度的木通皂苷D(纯度分别为100％、81％、62％、44％、22％和5％)，以及阳性对照银杏叶提取物(纯度55％)，分别置于容量瓶中，用含0.1％二甲基亚砜双蒸水溶解并定容至刻度，得1×10⁰mg/ml、1×10^-1mg/ml、1×10^-2mg/ml的供试药物样品液，0.2μm滤膜过滤除菌，并于4℃保存，备用。使用时预先除菌的无血清MEM培养液稀释至所需浓度。

本发明发现不同纯度的木通皂苷D都有促进神经元再生、抑制乙酰胆碱酯酶生成以及对Aβ_25-35所致的细胞损伤的保护作用，具有较强抗AD活性，本发明并不仅限于上述六份样品。本发明实施例二、三、四中，仅列出从六个纯度的木通皂苷D样品，是为了说明不同纯度的木通皂苷D都有抗AD活性，只要木通皂苷D的纯度在5％以上，都有促进神经元的再生、抑制乙酰胆碱酯酶以及对Aβ_25-35所致的细胞损伤的保护作用，都可用于制备抗AD药物，但最优纯度为100％。

红细胞的制备：取血5ml置于含有EDTA的抗凝管中，在2000r/min下离心20min后吸取出血浆和淡黄色层，红细胞沉淀加10倍体积的生理盐水充分洗涤后以3000r/min离心20min，弃上清液，重复洗涤3次后，红细胞沉淀加等量的生理盐水混匀，使成约50％混悬液，备用。

血浆的制备同上法制备。

各种实验样品液对乙酰胆碱酯酶抑制率的测定：  分别取备用的红细胞混悬液或血浆0.2ml，加入67mmol/LPBS150ml制成每1.5ml中含有2μl红细胞PBS溶液备用。取1.5ml上述红细胞或血浆PBS溶液，加入适量供试药物样品液，使之含药浓度为10^-1、10^-2和10^-3mg/ml，混匀，置于37℃水浴上孵育5min后，依次加入预温的DTNB溶液和ASch溶液各0.5ml，对照管中以等量的生理盐水代替ASch。立即涡旋混匀后，置于37℃水浴中准确孵育6min，立即放入冰浴中终止反应。放入4000rpm的离心机中离心15分钟，以蒸馏水为空白，取上清液在412nm处测定OD值。各药物对乙酰胆碱酯酶抑制率计算公式：

以酶抑制率为指标评价各组分对酶的抑制情况，酶的抑制率可用下列公式计算：(其中OD_H2O为不加药的吸光度，OD_Y为加药后的吸光度，OD_B为空白对照的吸光度。

3.乙酰胆碱酯酶抑制实验

3.1不同纯度的木通皂苷D红细胞膜上乙酰胆碱酯酶的抑制作用详见表1。

表1、不同纯度的木通皂苷D对红细胞膜上AChE抑制率

(X±SD，n＝3)

由表1可知，不同纯度的木通皂苷D样品给药浓度在1×10^-1～1×10^-3时，对红细胞膜上乙酰胆碱酯酶均有抑制作用。但是样品液对乙酰胆碱酯酶抑制的最佳浓度为1×10^-2。

3.2不同纯度的木通皂苷D对血浆中乙酰胆碱酯酶的抑制作用，详见表2。

表2、不同纯度的木通皂苷D对血浆中AchE的抑制率

(X±SD，n＝3)

由表2可知，不同纯度的木通皂苷D样品给药浓度在1×10^-1～1×10^-3时，对血浆中乙酰胆碱酯酶均有抑制作用。但是各组样品液对血浆中乙酰胆碱酯酶抑制的最佳浓度为1×10^-2。

不同纯度的木通皂苷D样品对红细胞膜上乙酰胆碱酯酶、对血浆中乙酰胆碱酯酶均有抑制作用，可以对脑痴呆(AD)产生治疗作用。

实施例三

不同纯度的木通皂苷D样品对Aβ_25-35诱导的PC₁₂细胞损伤的保护作用

β-淀粉样蛋白(Aβ)在脑组织及血管周围异常沉积形成老年斑是AD的一个重要的病理学特征，Aβ是各种原因诱发AD的共同通路，是AD形成和发展的关键因素。

PC₁₂细胞是肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系，具有神经元细胞的诸多特征，成为研究神经元细胞常用的细胞模型，是研究AD发病机制的较为理想的细胞模型，该模型也可以用来进行治疗VD药物的药效学考察。因此我们采用β-淀粉样蛋白对PC12细胞造模来考察各种药物对Aβ_25-35诱导的PC₁₂细胞损伤的保护作用。

MTT(3-dimethylthiazol-2，5-diphenyltetrazolium bromide，四甲基偶氮唑盐)比色微量分析是一种检测细胞生长和存活的灵敏方法，重复性好。活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶(LDH)可将黄色的MTT还原为蓝紫色结晶物，而死亡细胞则无此功能。通过测定光密度即可反映细胞活性。细胞膜通透性的改变是细胞损伤的一个共同的特征，神经细胞损伤程度与LDH释放量成正比，故测定培养液中LDH活性可作为反映细胞损伤的一种敏感且较为简便的指标。

仪器与材料：Aβ_25-35(Sigma-Aldrich公司，纯度大于99％)，PC₁₂细胞(武汉大学细胞库)，MTT(sigma公司)，DMEM培养基(高糖)(Hyclone产品)，20％小牛血清(杭州四季青公司)，青霉素、硫酸链霉素(石家庄石药集团产品)，20％牛血清白蛋白(BSA)(上海伯奥生物科技有限公司)。超净工作台(苏州净化设备厂)，NU2600E型二氧化碳培养箱(美国Precision公司)，TGL-166A型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)，LD5-2A型台式高速离心机(北京医用离心机厂)，匀浆器(上海实验仪器厂)，MODEL∑960型酶标仪(MetertechInc公司)，XDS-1B型倒置显微镜(重庆光学仪器厂)，酶标仪(Bio-Rad Model 550 MicroplateReader Japan)。

Aβ诱导PC₁₂细胞：大鼠嗜铬细胞瘤株PC₁₂细胞，用含5％牛血清及5％马血清的DMEM培养基(含青霉素钠200ku·L^-1，链霉素100mg·L^-1，PH7.4)调整细胞密度为2×10⁶，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，并分成空白组、模型组和药物组，每组6孔。放置于CO₂孵箱中，在37℃，5％CO₂条件下用DMEM完全培养液培养，待其长满后即可用于实验。吸去细胞液，然后向模型组和药物治疗组加入老化的Aβ_25-35造模，换上含有相应浓度0.1mmol·L^-1的无血清DMEM(正常组不含任何药物)。37℃，5％CO₂条件下培养48小时，吸去培养液，每孔加入含0.5g·L^-1MTT10μl的无血清DMEM，培养4小时后吸去培养液，每孔加入10％的二甲基亚砜(DMSO)约150μl，待蓝色颗粒完全溶解，用酶标仪检测。

供试药物的配制：称取不同纯度的木通皂苷D(纯度分别为90％、81％、62％、44％、22％和5％)，阳性对照银杏叶提取物(纯度55％)分别置于容量瓶中，用含0.1％二甲基亚砜双蒸水溶解并定容至刻度，得1×10⁰mg/ml、1×10^-1mg/ml、1×10^-2mg/ml的供试药物样品液，0.2μm滤膜过滤除菌，并于4℃保存，备用。使用时预先除菌的无血清MEM培养液稀释至所需浓度。

统计分析：数据以x±sd表示，使用SPSS 13.0统计软件进行方差分析，组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P≤0.05认为有显著性差异。

3.实验结果

3.1不同浓度Aβ_25-35对PC₁₂细胞的毒性作用

表3、不同浓度Aβ25-35对PC₁₂细胞毒性作用(n＝6)

^*与正常组比较，P＜0.01

从表3可以看出，随着Aβ_25-35浓度增大，OD值减小，说明OD值与Aβ_25-35浓度呈依赖关系。并且通过统计学分析，当Aβ_25-35浓度大于20umol/L时，其OD值低于正常对照组，差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)，表明细胞受到损伤或部分细胞已死亡，说明在给予Aβ_25-35＞20umol/L时造模成功。结论：造模时采用Aβ_25-35的浓度应大于30umol/L。

3.2不同纯度的木通皂苷D样品对Aβ_25-35诱导的PC₁₂细胞损伤的保护作用

由表4可见，与正常组比较，模型组(P＜0.01)的OD值显著的降低，说明给予30umol/L的Aβ_25-35诱导的PC₁₂细胞AD模型建立成功。与模型组比较，纯度为100％、81％、62％和44％的木通皂苷D样品组(P＜0.01)均能极显著提高OD值，说明上述4组药物在浓度1×10^-1mg/ml时具有对抗Aβ_25-35对PC₁₂毒性的极显著性作用(P＜0.01)。纯度为22％和5％的木通皂苷D样品组(P＜0.05)均能显著提高OD值，说明上述2组药物在浓度1×10^-1mg/ml时具有对抗Aβ_25-35对PC₁₂毒性的显著性作用(P＜0.05)。

表4、不同纯度的木通皂苷D对Aβ_25-35诱导的PC₁₂细胞损伤的保护作用(n＝6)

注：与正常组比较，^△△表示P＜0.01：与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

实验结果表明，纯度为100％、81％、62％和44％的木通皂苷D样品组药物1×10^-2mg/ml浓度和纯度为22％和5％木通皂苷D样品组药物1×10^-1mg/ml浓度时能显著对抗Aβ_25-35对PC12的毒性作用。

实施例四

木通皂苷D与其他化合物的组合物样品对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的保护作用

实验原理、仪器与材料、Aβ诱导PC12细胞的方法、统计分析等同实施例三。

供试药物的配制：称取木通皂苷D(纯度90％)、分别与丹参酮、葛根素、槲皮素、五味子酮、灵芝多糖、三七总皂苷、石杉碱甲、白藜芦醇、红景天素、蛇床子素、川芎嗪(购买自植物提取物制造商)或银杏叶、楮实、远志、紫河车、红花、桃仁、石苍蒲提取物提取物(实验室自制)组成1∶1的混合物共18份，分别置于容量瓶中，用含0.1％二甲基亚砜双蒸水溶解并定容至刻度，得1×100 mg/ml、1×10-1mg/ml、1×10-2mg/ml的供试药物样品液，0.2μm滤膜过滤除菌，并于4℃保存，备用。使用时预先除菌的无血清MEM培养液稀释至所需浓度。

表5、木通皂苷D及其组合物对Aβ_25-35诱导的PC₁₂细胞损伤的保护作用(n＝6)

注：与正常组比较，^△△表示P＜0.01；与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

实施例五

不同纯度的木通皂苷D样品对Aβ_25-35诱导原代培养大鼠皮层神经元损伤的保护作用

仪器与材料：DMSO(Sigma-Aldrich公司)，MTT(Sigma-Aldrich公司)，β淀粉样肽_25-35[(βAmyloid peptide fragment _25-35，Aβ_25-35)Sigma-Aldrich公司]，小牛血清(杭州四季青生物工程公司，020615)，DMEM高糖培养基(GIBCO公司)，多聚赖氨酸(第一军医大学试剂中心)，青霉素(河南新乡华星药厂，020410C)，链霉素(大连美罗大药厂生产(20010324)，胰酶(上海生工进口分装，1299A77)，LDH试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)。

出生3日以内的SD大鼠(清洁级，合格证号：2000A020，由南通医科大学实验动物中心提供)。25cm²培养瓶(美国Corning公司)，96孔板(美国Corning公司)，5410水套式CO₂培养箱(美国NAPCO公司)，MODEL ∑960型酶标仪(Meterech Inc生产)，XDS-1B型倒置显微镜(重庆光学仪器厂)，电子分析天平(德国Denner Inc)。

原代大鼠皮层神经元的分离(采用差速贴壁法分离原代神经元)：取新生3天以内的SD大鼠，碘酒涂布皮肤消毒，再浸入75％的酒精中脱碘约1分钟，将消毒好的动物放入超净台，以剪刀剪掉头部，用无齿镊小心分离头皮、颅骨，取出大脑，剥离出皮层。将取出的皮层转移到平皿内，用吸管吸取一定的PBS液冲洗掉附着在皮层上的血迹，再将干净的皮层组织移至另一平皿中，加入少量PBS液，以眼科剪充分剪碎组织约20分钟。然后收集组织糜液至一青霉素药瓶中，加入适量胰酶，37℃消化组织约30分钟后，加入DMEM高糖培养液(内含10％小牛血清、青霉素及链霉素各100000U/L)以终止胰酶的消化作用，200目筛网过滤，滤液经800rpm×5min离心，弃上清液，加入DMEM培养液至5ml体积，移入到经多聚赖氨酸处理过的25cm²培养瓶里，37℃约30分钟，以使纤维细胞先行贴壁。30分钟后将液体转移，调节液体体积并进行细胞计数为8×10⁵个/ml，再将细胞接种于多聚赖氨酸处理过的96孔板内，定时换液。Aβ_25-35的“老化”处理：将一定量的无菌双蒸水注入到冻干Aβ_25-35中，配制成200μmmol/L的储备液，置于37℃下至少7天，临用前用DMEM稀释，加入培养孔中，终浓度为30μmmol/L。

供试药物的配制：不同纯度的木通皂苷D(纯度分别为100％、81％、62％、44％、22％和5％)，阳性对照为银杏叶提取物(纯度55％)，分别置于容量瓶中，用含0.1％二甲基亚砜双蒸水溶解并定容至刻度，得1×10⁰mg/ml、1×10^-1mg/ml、1×10^-2mg/ml的供试药物样品液，0.2μm滤膜过滤除菌，并于4℃保存，备用。使用时预先除菌的无血清MEM培养液稀释至所需浓度。

AD细胞模型的建立及药物处理：SD大鼠原代皮层神经元接种于96孔板，以含10％小牛血清的DMEM高糖培养液、5％CO₂培养箱、37℃培养7天，将细胞分成空白组、模型组和药物组，每组6孔。空白组和模型组以生理盐水换液，而药物组以药物溶液换液。然后向模型组及药物治疗组加入终浓度为20μmol/L的“老化”的Aβ_25-35造模，24小时后以药物溶液为药物组换液，继续加入Aβ_25-35，维持48小时后开始测试。该模型同样适用于治疗VD药物的筛选。

MTT比色：每孔加入0.5％的MTT10μl继续培养4小时，吸弃培养液，加入二甲亚砜(DMSO)200μl/孔，待颗粒溶解后置于酶标仪上，在570nm的波长下检测各孔的吸光度。

与正常组比较，模型组(P＜0.01)的OD值显著的降低，说明给予30umol/L的Aβ_25-35造成的原代大鼠皮层神经元的损伤(P＜0.01)AD模型建立成功。与模型组比较，纯度为100％、81％、62％和44％的木通皂苷D样品组药物(P＜0.01)均能极显著提高OD值，说明上述4组药物在浓度1×10^-2mg/ml时具有对抗Aβ_25-35造成的原代大鼠皮层神经元的损伤(P＜0.01)的极显著性作用(P＜0.01)。纯度为22％和5％的木通皂苷D样品组药物(P＜0.05)均能显著提高OD值，说明上述2组药物在浓度1×10^-1mg/ml时具有对抗Aβ_25-35造成的原代大鼠皮层神经元损伤的显著性作用(P＜0.05)。

表6、各药物组对A β 25-35诱导原代培养大鼠皮层神经元损伤的保护作用结果

(n＝6)

注：与正常组比较，^△△表示P＜0.01；与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

实验结果表明，纯度为100％、81％、62％和44％的木通皂苷D样品组药物在1×10^-2mg/ml的浓度时、纯度为22％和5％木通皂苷D样品组药物在1×10^-1mg/ml的浓度时，对Aβ25-35诱导原代培养大鼠皮层神经元损伤的保护作用具有显著性(分别为P＜0.01，P＜0.05)。

实施例六

木通皂苷D对血管性痴呆大鼠血液流变学的影响

1.1材料

1.1.1动物SD健康大白鼠50只，雌雄兼半，体质量200～250g，实验条件下自然饮食，适应环境1周后进行实验。

1.1.2药物木通皂苷D(纯度为90％)样品按照实施例1进行制备；阳性对照喜德镇(天津华津制药厂与北京诺华制药有限公司合作生产，批号070371)。

1.1.3试剂水合氯醛、肝素。

1.1.4仪器手术剪(直、弯)、微动脉夹、显微手术镊、尼龙线、手术缝线、缝合针、静脉采血针、孔巾、手术固定板、肝素钠抗凝管、采血针、美国LBY-N6A旋转式黏度剂。

1.2方法

1.2.1 VD动物模型的建立根据改良线栓法制成MCAO模型，大鼠10％水合氯醛腹腔注射(0.35 mL/100g)麻醉后，将其仰卧固定，以络合碘消毒颈部皮肤，行颈部右侧切口，于胸骨舌骨肌与胸骨甲状肌分离出右颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)并挂线备用，结扎ECA与CCA，用微动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于ECA与ICA分叉处作一切口，从切口处插入一端加热成光滑球形尼龙线(直径为0.25mm，距球端2cm处作标记)。线插入ICA后，于入口处稍稍结扎尼龙线与入口处ICA段，然后松开夹闭ICA的动脉夹，继续插入尼龙线至稍有阻力后略回撤，至线插入深度为18～22mm左右，造成大脑中动脉阻塞导致脑缺血。再次结扎入口处尼龙线外留约3cm，缝合皮肤。2h后轻轻提拉所留线头至有阻力，实现大脑中动脉再灌，则造模完成。正常组大鼠不作任何处理。

1.2.2动物分组取造模成功的大鼠随机分为模型组、木通皂苷D组和喜德镇组各10只，假手术组只结扎ECA与ICA，另设正常组。木通皂苷D组给药按40mg/(kg·d)灌胃；喜德镇组给予喜德镇灌胃0.625mg/(kg·d)；正常组、假手术组、模型组均给予蒸馏水1mL/d体重灌胃；术后第1天即用药，每日灌胃1次。连续给药28d后，进行心脏采血测定相应指标。

1.2.3血液流变学指标水合氯醛(0.35mL/100g)麻醉，将大鼠固定于手术板上，触及心脏搏动最强处，于一次性静脉采血针插入心脏，接肝素抗凝管，送入实验室，4h内实验完毕，所用仪器为LBY-N6A自清洗旋转式黏度计，将数据输入计算机记录。

2.结果

木通皂苷D组、喜德镇组全血黏度高切、中切、低切及血浆黏度均较模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。木通皂苷D组全血黏度高切、中切、低切及血浆黏度均比喜德镇组低，且中切黏度、低切黏度及血浆黏度与喜德镇组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见表7。

表7、木通皂苷D对大鼠全血黏度及血浆黏度的影响(mPa·s，n＝10，X±SD)

组别                                   全血粘度                         血浆粘度

                     高切              中切            低切

正常组               4.80±0.57        5.59±0.53      9.72±0.68       1.13±0.09

假手术组             5.53±0.62^★▲    5.97±0.56^★▲  13.11±1.30^★▲  1.25±0.16^★▲

模型组               8.86±0.64^▲      10.60±0.83     16.65±0.99^▲    1.64±0.92^▲

喜得镇组             5.87±0.68^★▲    6.97±0.43^★▲  12.86±0.94^★▲  1.26±0.11^★▲

木通皂苷D组(90％)    5.61±0.49^★▲    5.71±0.48^★    11.63±0.71^★▲  1.12±0.11^★

注：与模型组比较★P＜0.01；与正常组比较▲P＜0.05

由表7可知，木通皂苷D可以降低VD模型大鼠的全血和血浆黏度，对血管性痴呆有一定的治疗作用。