检测牛病毒性腹泻病毒的方法逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备及其使用方法

摘要

检测牛病毒性腹泻病毒的方法逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备及其使用方法，它涉及反应试剂盒的制备及其使用方法。它解决了现有检测牛病毒性腹泻病毒的方法存在成本昂贵，需要专业设备及专业人员参与检测且不适于现阶段中国畜牧业发展状况的问题。方法：首先设计引物，然后配制逆转录环介导等温扩增反应液，即完成。使用方法：取含牛病毒性腹泻病毒样品的RNA提取物，加入反应液，混合后进行逆转录环介导等温扩增反应，再离心检测；或加入10000×SYBR GREEN I，然后置于紫外灯下检测；或进行电泳检测；或采用Real-time PCR仪进行保温反应检测。本发明反应试剂盒的检测方便，无需昂贵仪器，降低成本。

说明书

技术领域

本发明涉及反应试剂盒的制备及其使用方法。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)又称牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVD-MDV)，为单股正链RNA病毒；牛接触性传染，症状主要表现为腹泻，急、慢性粘膜病，持续性感染与免疫耐受，免疫抑制，母畜流产、死胎和畸胎等；该病主要发生于牛，还可感染猪、羊、鹿、骆驼及其它野生反刍动物。BVDV具有特征性的临床症状较少，在实际生产中常常不易被诊断，加之本病的病死率不高，未能引起人们的足够重视而忽视本病的存在，因此各牛场牛群缺乏系统的监测防制措施。BVDV对部分牛形成持续性感染，可严重影响牛的繁殖和生产，给养牛业造成了严重的经济损失，阻碍了我国牛养殖业的健康发展，因此对牛群进行普查，检测其感染情况，淘汰感染个体，成为本病防制的重要环节。所应用的检测手段必须能够有效的区分感染个体和非感染个体。

目前，普通的血清学检测方法不但无法区分自然感染个体和疫苗免疫个体，同时也无法检出因长期持续性感染而无抗体产生的个体，传统的病原学分离操作手段复杂、耗时无法应用于大规模筛查检测。应用RT-PCR检测牛病毒性腹泻病毒核酸灵敏度差，较难检测持续性感染牛只。应用Real-time PCR检测，虽然灵敏度较高，但是Real-time PCR检测成本昂贵、需要专业设备及专业人员参与检测，不适于现阶段中国畜牧业发展状况，较难大规模推广使用。

发明内容

本发明目的是为了解决现有检测牛病毒性腹泻病毒的方法存在成本昂贵，需要专业设备及专业人员参与检测且不适于现阶段中国畜牧业发展状况的问题，而提供检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备及其使用方法。

检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备方法按以下步骤实现：一、从基因数据库中检索所有牛病毒性腹泻病毒的基因序列，通过Clustalw软件分析找出特异性的保守靶DNA序列，然后利用PrimerExplorer 4软件设计6条引物；二、根据所得的6条引物配制逆转录环介导等温扩增反应液，即完成检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备；其中步骤一中保守靶DNA序列为：TGAGGGACAAATCCTCCTTAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAACAAGGAGGGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTTGTGCGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAGCGGGGGTCGTTCAGGTGAAAACGGTTTAACCAACCGCTACGAATACAGCCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACTGTATCGCTACTAAAAATCTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGATTACAAATG；

步骤一中6条引物分别为：

名称                    序列

F3    5’-TGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3’

B3    5’-AGCACCCTATCAGGCTGTA-3’

FIP   5’-CGAACCACTGACGACTACCCTGTTTTGGTAGCAACAGTGGTGAGTT-3’

BIP   5’-CAAGCCTCGAGATGCCACGTTTTTCCGTTTTCACCTGAACGACC-3’

FL    5’-AGGGCTTCAGCCATCCAACG-3’

BL    5’-CAGCACATCTTAACCTGAGCGG-3’；

步骤二中逆转录环介导等温扩增反应液为每20μl反应液由1.9μl的Nuclease-Free水、2.5μl的10×ThermoPol反应缓冲液、0.1μl的1M Mg₂SO₄、2μl的5M Betaine、4μl的10mM dNTP、1μl的20×SYBR GREEN I、1μl的5μM引物F3、1μl的5μM引物B3、1μl的20μM引物FL、1μl的20μM引物BL、1μl的40μM引物FIP、1μl的40μM引物BIP、1μl的8U/μl BstDNA聚合酶、0.5μl的40U/μl Ribonuclease Inhibitor和1μl的10U/μl AMV ReverseTranscriptase组成。

检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的使用方法：

一、取5μl含牛病毒性腹泻病毒样品的RNA提取物，加入20μl逆转录环介导等温扩增反应液，均匀混合后放置于62℃下进行逆转录环介导等温扩增反应1h；二、扩增反应后以10000r/min的转速离心1min，反应管底部有沉淀产生，则待测样品中存在牛病毒性腹泻病毒，反应管底部无沉淀产生，则待测样品中不存在牛病毒性腹泻病毒。

检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的使用方法：

一、取5μl含牛病毒性腹泻病毒样品的RNA提取物，加入20μl逆转录环介导等温扩增反应液，均匀混合后放置于62℃下进行逆转录环介导等温扩增反应1h；二、扩增反应后加入5μl的10000×SYBR GREEN I，然后置于紫外灯下，反应液变成绿色，则待测样品中存在牛病毒性腹泻病毒，反应液为橘黄色，则待测样品中不存在牛病毒性腹泻病毒。

检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的使用方法：

一、取5μl含牛病毒性腹泻病毒样品的RNA提取物，加入20μl逆转录环介导等温扩增反应液，均匀混合后放置于62℃下进行逆转录环介导等温扩增反应1h；二、取1μl扩增反应后液体用质量浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，为弥散状条带，则待测样品中存在牛病毒性腹泻病毒，不存在弥散状条带，则待测样品中不存在牛病毒性腹泻病毒。

检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的使用方法：

一、取5μl含牛病毒性腹泻病毒样品的RNA提取物，加入20μl逆转录环介导等温扩增反应液，均匀混合后放置于62℃下进行逆转录环介导等温扩增反应1h；二、扩增反应后采用Real-time PCR仪进行保温反应，每隔1min收集一次荧光信号，在1h内有扩增曲线，则待测样品中存在牛病毒性腹泻病毒，在1h内无扩增曲线，则待测样品中不存在牛病毒性腹泻病毒。

本发明检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒，填补了国内外没有用于检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒这一空白，制备方法简单，可批量生产；本发明检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的4种使用方法，均可在恒温条件下进行，只经过一步反应便可达到检测的目的，检测方便快速，特异性高，灵敏度高，无需昂贵仪器，降低成本，同时非专业人员也能够快速熟悉操作，适合广泛推广使用，能够满足对畜场现场检疫的需要，也可用于出入境检验检疫等对牛病毒性腹泻病毒的检疫检验工作，适用于现阶段中国畜牧业发展状况。

附图说明

图1为具体实施方式四中琼脂糖凝胶电泳的图谱，其中“1”为阴性对照组，不存在弥散状条带；“2”为存在弥散状条带，待测样品中存在牛病毒性腹泻病毒。图2为具体实施方式五中Real-time PCR荧光检测图谱，其中“1”为阴性对照组，1h内无扩增曲线；“2”为1h内有扩增曲线，待测样品中存在牛病毒性腹泻病毒。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备方法按以下步骤实现：一、从基因数据库中检索所有牛病毒性腹泻病毒的基因序列，通过Clustalw软件分析找出特异性的保守靶DNA序列，然后利用Primer Explorer 4软件设计6条引物；二、根据所得的6条引物配制逆转录环介导等温扩增反应液，即完成检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备；其中步骤一中保守靶DNA序列为：TGAGGGACAAATCCTCCTTAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAACAAGGAGGGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTTGTGCGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAGCGGGGGTCGTTCAGGTGAAAACGGTTTAACCAACCGCTACGAATACAGCCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACTGTATCGCTACTAAAAATCTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGATTACAAATG；步骤一中6条引物分别为：

名称                序列

F3   5’-TGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3’

B3     5’-AGCACCCTATCAGGCTGTA-3’

FIP    5’-CGAACCACTGACGACTACCCTGTTTTGGTAGCAACAGTGGTGAGTT-3’

BIP    5’-CAAGCCTCGAGATGCCACGTTTTTCCGTTTTCACCTGAACGACC-3’

FL     5’-AGGGCTTCAGCCATCCAACG-3’

BL     5’-CAGCACATCTTAACCTGAGCGG-3’；

步骤二中逆转录环介导等温扩增反应液为每20μl反应液由1.9μl的Nuclease-Free水、2.5μl的10×ThermoPol反应缓冲液、0.1μl的1M Mg₂SO₄、2μl的5M Betaine、4μl的10mM dNTP、1μl的20×SYBR GREEN I、1μl的5μM引物F3、1μl的5μM引物B3、1μl的20μM引物FL、1μl的20μM引物BL、1μl的40μM引物FIP、1μl的40μM引物BIP、1μl的8U/μl BstDNA聚合酶、0.5μl的40U/μl Ribonuclease Inhibitor和1μl的10U/μl AMV ReverseTranscriptase组成。

本实施方式步骤一中6条引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

本实施方式步骤二中10×ThermoPol反应缓冲液购自NEB(北京)有限公司；1M Mg₂SO₄购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；5M Betaine购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；10mM dNTP购自宝生物工程(大连)有限公司；20×SYBR GREEN I购自北京百泰克生物技术有限公司；8U/μlBstDNA聚合酶购自NEB(北京)有限公司；40U/μl Ribonuclease Inhibitor购自宝生物工程(大连)有限公司；10U/μl AMV Reverse Transcriptase购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。

具体实施方式二：本实施方式检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的使用方法：一、取5μl含牛病毒性腹泻病毒样品的RNA提取物，加入20μl逆转录环介导等温扩增反应液，均匀混合后放置于62℃下进行逆转录环介导等温扩增反应1h；二、扩增反应后以10000r/min的转速离心1min，反应管底部有沉淀产生，则待测样品中存在牛病毒性腹泻病毒，反应管底部无沉淀产生，则待测样品中不存在牛病毒性腹泻病毒。

本实施方式中检测可设立阴性对照组，阴性对照组是以水代替RNA提取物，其余组分均相同。

具体实施方式三：本实施方式检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的使用方法：一、取5μl含牛病毒性腹泻病毒样品的RNA提取物，加入20μl逆转录环介导等温扩增反应液，均匀混合后放置于62℃下进行逆转录环介导等温扩增反应1h；二、扩增反应后加入5μl的10000×SYBRGREEN I，然后置于紫外灯下，反应液变成绿色，则待测样品中存在牛病毒性腹泻病毒，反应液为橘黄色，则待测样品中不存在牛病毒性腹泻病毒。

本实施方式中检测可设立阴性对照组，阴性对照组是以水代替RNA提取物，其余组分均相同。

具体实施方式四：本实施方式检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的使用方法：一、取5μl含牛病毒性腹泻病毒样品的RNA提取物，加入20μl逆转录环介导等温扩增反应液，均匀混合后放置于62℃下进行逆转录环介导等温扩增反应1h；二、取1μl扩增反应后液体用质量浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，为弥散状条带，则待测样品中存在牛病毒性腹泻病毒，不存在弥散状条带，则待测样品中不存在牛病毒性腹泻病毒。

本实施方式中检测可设立阴性对照组，阴性对照组是以水代替RNA提取物，其余组分均相同。

本实施方式步骤二中电泳采用核酸电泳法；结果如图1所示，存在弥散状条带，待测样品中存在牛病毒性腹泻病毒，而阴性对照组中不存在弥散状条带，则待测样品中不存在牛病毒性腹泻病毒。

具体实施方式五：本实施方式检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的使用方法：一、取5μl含牛病毒性腹泻病毒样品的RNA提取物，加入20μl逆转录环介导等温扩增反应液，均匀混合后放置于62℃下进行逆转录环介导等温扩增反应1h；二、扩增反应后采用Real-time PCR仪进行保温反应，每隔1min收集一次荧光信号，在1h内有扩增曲线，则待测样品中存在牛病毒性腹泻病毒，在1h内无扩增曲线，则待测样品中不存在牛病毒性腹泻病毒。

本实施方式中检测可设立阴性对照组，阴性对照组是以水代替RNA提取物，其余组分均相同。

本实施方式检测结果如图2所示，在1h内有扩增曲线，则待测样品中存在牛病毒性腹泻病毒，而在1h内无扩增曲线，则待测样品中不存在牛病毒性腹泻病毒。

序列表

<110>东北农业大学

<120>检测牛病毒性腹泻病毒的方法逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备及其使用方

     法

<160>7

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>逆转录环介导等温扩增反应引物F3的序列。

<400>1

tgcccttagt aggactagca 20

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>逆转录环介导等温扩增反应引物B3的序列。

<400>2

agcaccctat caggctgta 19

<210>3

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>逆转录环介导等温扩增反应引物FIP的序列。

<400>3

cgaaccactg acgactaccc tgttttggta gcaacagtgg tgagtt 46

<210>4

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>逆转录环介导等温扩增反应引物BIP的序列。

<400>4

caagcctcga gatgccacgt ttttccgttt tcacctgaac gacc 44

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>逆转录环介导等温扩增反应引物LF的序列。

<400>5

agggcttcag ccatccaacg 20

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>逆转录环介导等温扩增反应引物LB的序列。

<400>6

cagcacatct taacctgagc gg 22

<210>7

<211>340

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>牛病毒性腹泻病毒保守靶DNA序列。

<400>7

tgagggacaa atcctcctta gcgaaggccg aaaagaggct agccatgccc ttagtaggac  60

tagcaaaaca aggagggtag caacagtggt gagttcgttg gatggctgaa gccctgagta  120

cagggtagtc gtcagtggtt cgacgctttg tgcgacaagc ctcgagatgc cacgtggacg  180

agggcatgcc cacagcacat cttaacctga gcgggggtcg ttcaggtgaa aacggtttaa  240

ccaaccgcta cgaatacagc ctgatagggt gctgcagagg cccactgtat cgctactaaa  300

aatctctgct gtacatggca catggagttg attacaaatg 340