荧光标记mini-STR进行人类基因分型的测试方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种采用荧光标记mini-STR进行人类基因分型的测试方法，包括下列步骤：a)提取DNA，b)复合扩增mini-STR基因座，并标记，c)检测、确认扩增产物，上述的mini-STR基因座为D10S1248、D2S441、D1S1677、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63、D2S1776或D4S2408、D20S482、D6S1017、D6S474中的至少一个，与其配套的试剂盒，包括PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、引物、ladder、DNA模版，所述的引物为D10S1248、D2S441、D1S1677、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63、D2S1776、D4S2408、D20S482、D6S1017、D6S474中的至少一种。采用本发明对高度降解的检材能够准确、稳定分型，从而识别不同的个体。

说明书

技术领域

本发明涉及在人类基因检测，特别涉及mini-STR(short tandem repeats，短串联重复序列)的分析，具体地说是采用荧光标记mini-STR进行人类基因分型的测试方法及试剂盒。

背景技术

STR遗传标记系统由于在人类基因组中分布广泛，并且具有高度的遗传多态性及简单快捷的检测方法，被广泛应用于法医学、考古学、遗传学等领域。目前，用于个人识别和亲权鉴定常用的STR商品化试剂盒主要有AmpFLSTRIdentifiler、16和DNATyper15三种。AmpFLSTR Identifiler系统包括15个常染色体基因座：D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA和一个性别鉴定位点Amelogenin；16系统包括15个常染色体基因座：Penta E、D18S51、D21S11、TH01、D3S1358、FGA、TPOX、D8S1179、vWA、PentaD、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818和一个性别鉴定位点Amelogenin；DNATyperTM15包括14个常染色体STR基因座D6S1043、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、D13S317、D8S1179、D16S539、Penta E、D5S818、vWA、D18S51、FGA和一个性别鉴定位点Amelogenin。这三种试剂盒的扩增产物片段均分布在100-500bp之间，在日常检案中能够对大部分检材作出正确的分型。

但是对于某些DNA高度降解的检材，如陈旧骨骼、牙齿、腐败的肌肉、组织等，如使用这些商品化STR复合扩增试剂盒进行检测时，片段较大的STR基因座往往无法进行有效的扩增，表现为：扩增效率随片段增大而显著降低、等位基因缺失或完全丢失等，如PowerPlex16试剂盒中CSF1PO、Penta D等基因座信号很弱，无法判型。这使得高度降解DNA检材在一定程度上成为现阶段法医DNA检验的难点，从而制约了某些重要物证在法医或考古过程中应发挥的作用。

在现有技术的基础上，通过改进DNA提取方法，或提高模板DNA浓度和纯度，优化扩增条件，增加循环次数，减小STR体系等方法，也可以在一定程度上提高DNA高度降解检材的STR检出率，但都不能从根本上解决等位基因缺失或者完全丢失等问题。

发明内容

本发明针对高度降解检材的DNA分型困难，提供一种适合中国人群的mini-STR分型测试方法及配套的试剂盒，使检测DNA的片段范围缩短至80～150bp，提高对高度降解DNA分型的成功率。

为解决上述问题，本发明的测试方法包括以下步骤，a)提取DNA，b)复合扩增mini-STR基因座，并标记，c)检测、确认扩增产物，上述的mini-STR基因座为D10S1248、D2S441、D1S1677、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63、D2S1776、Amelogenin、D4S2408、D20S482、D6S1017或者D6S474中的至少一个。

上述mini-STR基因座根据以下标准进行选取：(1)多态性程度高，杂合度大于0.7；(2)与CODIS基因座之间无连锁关系；(3)系统内的mini-STR基因座之间处于连锁平衡状态；(4)PCR产物小于150bp；(5)突变率小于0.002。选择的上述基因座在中国人群中具有较高的鉴别能力，且具有较小的扩增产物，与CODIS基因座无连锁关系，适用于高度降解检材的DNA分析，采用上述基因座即可识别不同的个体。其相关信息见表1。

表1 mini-STR基因座有关信息

  位点名称  染色体定位  位置  杂合度  片段长度  /bp  序列  D10S1248  10q26  124669516-124669762  0.792  79-123  GGAA  D2S441  2p13  67976019-67976170  0.774  78-110  CTAT  D1S1677  1q23.3  134804939-134805141  0.746  77-117  TTCC  D9S2157  9q34.13-q34.3  105529052-105529306  0.844  71-107  ATA  D9S1122  9q21-q22  49519646-49519852  0.734  92-125  GGAA  D10S1435  10  2178225-2178490  0.766  82-139  TATC  D12ATA63  12  105439947-105440157  0.829  76-106  TAA  D2S1776  2q24  161524205-161524497  0.763  12-161  AGAT  D4S2408  4  30647679-30647954  0.722  85-109  ATCT  D20S482  20  4459832-4459988  0.701  85-126  AGAT  D6S1017  6  41396081-41396231  0.725  81-110  ATCC  D6S474  6  110453868-110454021  0.761  107-136  AGAT

上述测试方法配套的试剂盒，包括PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、引物、ladder、DNA模版，其特征在于：所述的引物为D10S1248、D2S441、D1S1677、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63、D2S1776、Amelogenin、D4S2408、D20S482、D6S1017或者D6S474中的至少一种，所述的ladder为D10S1248、D2S441、D1S1677、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63、D2S1776、D4S2408、D20S482、D6S1017或者D6S474中的至少一种。

所述的试剂盒用于分析来自人类的血液、骨骼、毛发、肌肉或者组织器官的DNA样品。

采用上述试剂盒即可对高度降解的检材进行准确分型，完成对不同个体的识别。下面通过试验数据来说明本发明试剂盒的优势。

对比试验1

按照常规方法提取在37℃、100％湿度下高度腐败降解两天的肌肉样品的DNA，然后分别采用Power Plex 16试剂盒和本发明的试剂盒对提取的DNA进行复合扩增，再采用ABI PRISM 310或ABI3130基因分析仪检测后，用Genemapper3.2软件分析结果。

检测结果参见图1和图3-1、图3-2，从图l中可以看出，用Power Plex 16试剂盒虽然在短片段有荧光信号峰出现，但不能准确分型；从图3-1、2可以看出，而采用本发明试剂盒，虽然13个基因座的荧光信号峰的峰值不高，但均可正确分型。

比对试验2

提取DNase I消化20min的样本的DNA，然后分别采用Ampf/STR Identifiler试剂盒和本发明的试剂盒对提取的DNA进行复合扩增，再用ABI PRISM 310或ABI3130基因分析仪检测后，用Genemapper 3.2软件分析结果。

检测结果见图2和图4-1和图4-2，从图2可以看出，用Ampf/STRIdentifiler试剂盒检测片段较小的基因座可分型，但大片段产物显著减少，杂带也明显增多；从图4-1、2中可以看出，采用本发明的试剂盒使13个基因座全部可以正确分型。

采用本发明有益效果在于：采用本试剂盒对高度降解检材进行检测，其鉴别能力、灵敏度、扩增特异性、基因座间平衡性、分型准确性、稳定性等方面能满足法医DNA检验实际工作的要求，是现有STR试剂盒有益的补充，且其成本低、性能好，可广泛用于陈旧骨骼、牙齿、腐败的肌肉、组织等DNA高度降解的检材，以及痕量血痕、指(趾)甲、毛发等低含量DNA检材的检测。

附图说明

图1是用Power Plex 16试剂盒对在37℃、100％湿度下高度腐败降解两天的肌肉样品DNA分型结果；

图2是用Ampf/STR Identifiler试剂盒对DNase I消化20min的样本进行分型的结果；

图3-1和图3-2是用本发明试剂盒对在37℃、100％湿度下高度腐败降解两天的肌肉样本DNA分型结果；

图4-1和图4-2是用本发明试剂盒对DNase I消化20min的样本进行分型的结果。

具体实施方式

下面结合实施例进行详细说明。

实施例一

荧光标记mini-STR进行人类基因分型的测试方法，包括下列步骤：a)提取DNA，b)复合扩增mini-STR基因座，并标记，c)检测、确认扩增产物，其特征在于，上述的mini-STR基因座为D10S1248、D2S441、D1S1677、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63、D2S1776、Amelogenin或D4S2408、D20S482、D6S1017、D6S474中的至少一个。

荧光标记mini-STR进行人类基因分型的试剂盒，包括PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、引物、ladder、DNA模版，其特征在于：所述的引物为D10S1248、D2S441、D1S1677、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63、D2S1776、Amelogenin、D4S2408、D20S482、D6S1017、D6S474中的至少一种，所述的ladder为D10S1248、D2S441、D1S1677、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63、D2S1776、Amelogenin、D4S2408、D20S482、D6S1017、D6S474中的至少一种。

本实施例中，优选荧光标记mini-STR进行人类基因分型的试剂盒，包括PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、引物、ladder、dNTP、DNA模版，所述的引物分为三组：A组D10S1248、D2S441、D1Sl677、D9S2157；B组为D9S1122、D10S1435、D12ATA63、D2S1776、Amelogenin；C组为D4S2408、D20S482、D6S1017、D6S474。

将肌肉组织在37℃，湿度100％条件下，于孵育箱内放置2天，模拟制备成腐败降解生物检材为例，说明采用荧光标记mini-STR进行人类基因分型的测试方法和试剂盒在检测中的应用。

a)提取DNA

步骤如下：

1)取组织少许，研碎，用生理盐水洗去附着在组织上的血，5000r/min离心5min，取上清液，

2)用200μL质量浓度为5％Chelex-100悬浮沉淀，加2μL 10mg/mL蛋白酶K，56℃保温过夜或至少3小时，

3)剧烈振荡5～10s，沸水煮8min，再剧烈振荡5～10s，13000r/min离心2～3min，取1μL上清液用于复合扩增。

b)复合扩增mini-STR基因座，并标记

本实施例采用PCR进行复合扩增(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)。复合扩增体系见表2。

表2PCR复合扩增的组分

引物A组、B组和C组分别与PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、dNTP和模板DNA构成三个复合扩增体系。

每个体系中还包括浓度为25mmol/L的MgCl₂溶液0.5μL和去离子水，每个扩增体系的总体积为10μL。

用于扩增的基因座的引物及荧光标记染料参见表3。

表中，FAM即羧基荧光素，作为蓝色荧光标记染料；TAMRA即四甲基-6羧基罗丹明，作为黄色荧光标记染料；HEX即六氯荧光素，作为绿色荧光标记染料；ROX即若丹明，作为红色荧光标记染料。引物由上海生工生物技术有限公司合成，用HAP方法进行纯化。

表3引物及荧光标记染料

  基因座名称  引物序列  D10S1248  上游引物：[FAM]-TTAATGAATTGAACAAATGAGTGAG  下游引物：GCAACTCTGGTTGTATTGTCTTCAT

  基因座名称  引物序列  D2S441  上游引物：[HEX]-CTGTGGCTCATCTATGAAAACTT  下游引物：GAAGTGGCTGTGGTGTTATGAT  D1S1677  上游引物：[TAMRA]-TTCTGTTGGTATAGAGCAGTGTTT  下游引物：GTGACAGGAAGGACGGAATG  D9S2157  上游引物：[ROX]-CAAAGCGAGACTCTGTCTCAA  下游引物：GAAAATGCTATCCTCTTTGGTATAAAT  D9S1122  上游引物：[HEX]-GGGTATTTCAAGATAACTGTAGATAGG  下游引物：GCTTCTGAAAGCTTCTAGTTTACC  D10S1435  上游引物：[TAM RA]-TGTTATAATGCATTGAGTTTTATTCTG  下游引物：GCCTGTCTCAAAAATAAAGAGATAGACA  D12ATA63  上游引物：[FAM]-GAGCGAGAGCCTGTCTCAAG  下游引物：GGAAAAGACATAGGATAGCAATTT  D2S1776  上游引物：[ROX]-TGAACACAGATGTTAAGTGTGTATATG  下游引物：GTCTGAGGTGGACAGTTATGAAA  Amelogenin  上游引物：[ROX]-CCC TGG GCT CTG TAA AGA ATA GTG  下游引物：ATC AGA GCT TAA ACT GGG AAG CTG  D4S2408  上游引物：[FAM]-AAGGTACATAACAGTTCAATAGAAAGC  下游引物：GTGAAATGACTGAAAAATAGTAACCA  D20S482  上游引物：[H EX]-CAGAGACACCGAACCAATAAGA  下游引物：GCCACATGAATCAATTCCTATAATAAA  D6S1017  上游引物：[TAMRA]-CCACCCGTCCATTTAGGAG  下游引物：GTGAAAAAGTAGATATAATGGTTGGTG  D6S474  上游引物：[ROX]-GGTTTTCCAAGAGATAGACCAATTA  下游引物：GTCCTCTCATAAATCCCTACTCATATC

PCR扩增步骤：

在ABI9700PCR扩增仪中进行扩增，热循环参数：94℃、3min预变性；然后在94℃、30s，57℃、30s，72℃、30s，共进行28个循环；60℃，保持30min，最终保持在4℃。

c)检测、确定扩增产物

取扩增产物1.0μL，用去离子甲酰胺12.0μL和GS500LIZ内标0.2μL充分混匀，经95℃、3min，4℃、2min变性后，经过ABI PRISM 310/3100/3130基因分析仪检测，用Genemapper 3.2软件分析结果，根据自制的等位基因分型标准品即ladder和mini-STR自动分型模版进行基因分型和命名。

其中制备ladder的方法如下：

1)等位基因和等位基因分型标准物的制备

首先对D10S1248、D2S441、D1S1677、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63、D2S1776、D4S2408、D20S482、D6S1017、D6S474基因座的等位基因进行筛选、扩增和纯化。从754份DNA样品中筛选目的等位基因；逐一进行各个基因座的扩增、电泳检测确认；聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，回收纯化。然后利用克隆技术进行等位基因的大量制备。扩增目的等位基因；扩增产物经纯化后与pGM-T质粒载体连接，转化到DH5α感受态大肠杆菌中，鉴别阳性克隆并进行序列测定；培养实现等位基因的大量制备。

2)等位基因标准品电泳迁移率的研究和mini-STR自动分型模版的编制

对制备的全部等位基因进行电泳长度测定。电泳选择LIZ500内标来对各等位基因进行精确的长度测定，并将实测电泳片段长度与其测序长度比较得到电泳迁移率。然后对制备的等位基因标准物的电泳检测参数和实验结果进行了系统的研究，根据实验结果计算了电泳偏移值、相对偏移值、平均偏移值，各基因座等位基因分型范围。对mini-STR扩增的大量样品进行分型实验，分析实验数据并进行统计，得到各个基因座详尽的检测分型数据。最终应用Genemapper软件编制出mini-STR的自动分型模板。

对在37℃，湿度100％条件下，于孵育箱内放置2天的肌肉组织进行分型，参看附图3-1和3-2可以看出，采用本发明选取的12个基因座和Amelogenin，和本发明的测试方法，能够对高度降解的肌肉组织很好地进行分型，能够实现对个体的识别。

实施例二

本实施例以DNase I人工降解20min后DNA为检材进行DNA分型。

DNA的提取步骤：

1)将20μgDNA，10×DNase I反应缓冲液80μL加蒸馏水配成220μL的体系，移出10μL作空白对照，再在剩余的210μL中加入2μL DNaseI(1U/μL)；

2)将其在25℃下进行孵育，在其孵育至20min时间点时，移出30μl样本，将移出的样本中加入2μL的25mmol/L的EDTA，并70℃孵育15分钟以终止DNaseI的作用；

3)取10μL样本，进行琼脂糖电泳，用于复合扩增。

扩增和检测步骤同实施例一。分型结果参见图4-1和图4-2，采用本发明能够DNase I人工降解的DNA很好地进行分型，完成对个体的识别。

综上，本发明所选取的基因座对高度降解的检材能够准确、稳定分型，能够满足法医DNA检验实际工作的要求，可以对每一个个体进行准确的DNA分型，从而识别不同的个体，是现有STR试剂盒有益的补充。