鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇复配杀菌剂及其应用

摘要

本发明涉及一种鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇复配杀菌剂，成品药剂中包括有效活性成分、助剂以及溶剂，其特征在于：有效活性成分占成品药剂的重量百分比为1～50％，所述的有效活性成分由鲍曼菌液活性粗浸膏和戊唑醇组成，在有效活性成分中，鲍曼菌液活性粗浸膏的重量百分比为：25～75％。本发明的优点是：将鲍曼菌液活性粗浸膏与戊唑醇进行复配后，与现有单剂使用相比，明显增效，大大提高了杀菌活性，减少了病菌抗药性；采用植物病害生防菌与化学农药复配，大幅度降低了化学农药的用量，尤其是鲍曼菌液活性粗浸膏在环境中较易降解，不仅降低了化学农药使用成本，而且减少了化学农药的残留以及它对环境的污染。

说明书

一、技术领域：

本发明属于一种生物代谢物-化学协同增效梨树轮纹病杀菌剂农药，涉及一种有效活性成分为鲍曼菌素和戊唑醇的复配杀菌剂。

背景技术：

梨轮纹病(Botryosphaeria berengeriana de.Not.f.sp.Piricola(Nose)Koganecawa et.Sokwwwa)亦称粗皮病、瘤皮病、水烂病等，是我国梨树的重要病害之一。近年来，随着主栽品种的更迭，质优但感病品种的栽培面积不断扩大，该病的发生与危害日趋严重，给梨生产造成了很大的损失，严重影响了梨果的质量和产量。我国每年因梨轮纹病危害造成梨果实减产约25％，严重时烂果率高达80％以上，而且该病不仅侵染田间生长的梨果实、叶片和枝干，还可引起采后果实腐烂，已成为田间和果实贮藏期的重要病害之一。当前梨树轮纹病仍以化学防治为主，但随着“农药公害”、“抗药性”等问题的日趋严重，以及生物防治技术的推广应用，人们也将生物防治深入扩展到病害防治的研究领域。

植物内生菌(Endophyte)是指在植物体内完成其生活史的部分或全部，生长于植物组织的细胞间，分布于叶鞘、种子、花、茎、叶片和根中，但又不引起任何病症的微生物。植物内生菌是一种多样性十分丰富的生物类群，分布广，种类多，具有极其丰富的生物多样性。植物内生菌包括内生细菌、内生放线菌和内生真菌。自20世纪70年代后期，内生菌在一些重要的经济林木，如云杉、红杉、紫杉、桉树、栎树等植物树皮、枝叶内相继被发现并得到了广泛的研究和应用。在多种灌木、草本植物以及栽培作物等植物中也相继发现了内生菌。如从棉花、番茄、甜菜、茄子、瓜类、马铃薯等农作物中分离到Pseudomonas，Serratia，Alcaligenes，Shigella，Citrobacter，Herbaspedicae，Clavibacter，Aumobacterium，Hydrogenophaga，Flavimonas等50多个属的内生细菌。其中从植物内生菌中分离得到的抗菌活性物质结构类型多样，主要有萜类、生物碱类、芳香类、肽类等化合物，具有较强的抑菌、杀菌活性，是临床抗菌药物和生物农药研究与开发的新资源。

鲍曼菌素(Acinetobacter baumannii)是南京大学从药用植物樟树内生细菌中分离出来的次生代谢物，该鲍曼菌株为LCH0606，它是一种植物生防菌，已经由CN1973631号专利文献公开(保藏号为：CGMCC No.1752)。采用该菌株离心后获得的鲍曼菌液次生代谢物对小麦赤霉病等病害具有较好的防治效果。针对鲍曼菌液产生的抗生素种类和活性物质量的分析，用13L鲍曼菌液经离心、大孔树脂吸附浓缩后得到0.5g/L鲍曼菌活性粗浸膏，再硅胶柱层析、葡聚糖凝胶Sephadex-LH20反复纯化鲍曼菌液中的抗菌活性物质，并经核磁、质谱等分析，得出鲍曼菌素的抗菌主要成分为脂肽类物质，其活性成分为IturinA1，iturinA2、iturinA3和IturinA6，三者含量比为1∶1∶1，活性化合物量为3mg/L。LCH0606，在PSA平板上37℃培养24h后的菌落呈现规则圆形、灰白色、表面低凹、不透明、干燥易挑取、无粘性、边缘光滑。对该菌显微染色观察结果为短杆状、无芽孢、无鞭毛，直径约1.0～1.5μm，革蓝氏染色呈阴性。在中性和碱性以及＜100℃条件下相对稳定，抗菌活性可保持80％以上；在酸性条件下鲍曼菌素的抗菌活性易受破坏。加入Ca²⁺可显著提高抗菌活性。易容于水。经处理后病原菌表现为孢子不萌发，菌丝短小，细胞破裂而内含物流出。故LCH0606是一株具有较大开发潜力的农用生防菌。

戊唑醇(tebuconazole)化学名称：(1-(4-氯苯基)-4，4-二甲基-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)戊-3-醇)，是一种羟乙基三唑衍生物。理化性状：无色晶体；熔点102.4℃；蒸气压0.013mPa(20℃)；溶解性(20℃)，水32mg/L(pH值为7)；二氯甲烷＞200g/L，己烷＜0.1g/L，异丙醇、甲苯50～100g/L。在pH值4～9，22℃水解DT₅₀＞1年。大鼠急性经口LD₅₀4000mg/kg。毒性分类属低毒杀菌剂。该化台物由德国拜耳公司于1986年最先开发成功。近年来在中国开发的广谱杀菌剂之一，具有内吸治疗作用，并通过植物生长力的部分吸收并向顶部传异，抑制病菌麦甾醇脱甲基化，促进作物生长，使之根系发达，叶色浓绿，植株健壮，从而提高产量。对白粉菌属、柄锈菌属、喙孢属、核腔菌属和壳针孢属菌引起的病害均能有效地防治，但缺乏预防保护作用，增加农业使用成本。

目前生产上主要采用化学防治梨轮纹病，这样不仅严重污染环境，同时也易导致病原菌抗药性产生，尤其是耐药或抗药性病原菌的出现，使人们对各种能够有效抑制或杀死各类致病菌的药物的需求量不断上升。生物农药不仅对人畜安全、环境兼容性好，而且对病虫害不易产生抗药性，已成为当今主要研究的热点之一。但是生物农药也存在一些不足，如：田间防治效果不稳定、药效作用缓慢、杀虫杀菌谱窄等问题。因而用生物与化学农药相结合来提高防效和扩大防治对象、减缓病害抗药性、减少污染、降低农药残留的最佳方法，目前，针对鲍曼菌素和戊唑醇的复配防治梨轮纹病尚未见报道。

二、发明内容：

本发明目的：本发明的目的是针对戊唑醇单剂使用病害抗药性及成本高等问题，提供一种由鲍曼菌素和戊唑醇复配的复配杀菌剂。

本发明这样实现的：一种鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇复配杀菌剂，成品药剂中包括有效活性成分、助剂以及溶剂，其特征在于：有效活性成分占成品药剂的重量百分比为1～50％，所述的有效活性成分由鲍曼菌液活性粗浸膏和戊唑醇组成，在有效活性成分中，鲍曼菌液活性粗浸膏的重量百分比为：25-75％。

本发明的有效活性成分中，鲍曼菌液活性粗浸膏的重量百分比为：50-70％。

本发明的成品药剂中助剂和溶剂所占的重量百分比分别为15-40％和10～60％。

本发明的成品药剂中，所述的助剂为常规乳化剂和促进剂，所述的溶剂为水。

本发明的成品药剂中，所述的助剂包括乳化剂和促进剂，同时还包括增稠剂，或消泡剂，或防冻剂，或它们的组合。

本发明成品药剂的剂型为水悬浮剂。

一种上述复配杀菌剂的应用，其特征在于：将成品药剂稀释后喷洒在梨树上用于防治梨轮纹病。

在复配杀菌剂的具体应用中：将成品药剂稀释100～3500倍，稀释后有效药物成分的含量至少为100mg/L。

在复配杀菌剂的具体应用中：稀释后有效药物成分的最佳含量为160～300mg/L

本发明的优点在于：将鲍曼菌液活性粗浸膏与戊唑醇进行复配后，与现有单剂使用相比，具有明显增效，大大提高了杀菌活性，减少了病菌抗药性，尤其是鲍曼菌液活性粗浸膏在环境中较易降解，不仅降低了化学农药使用成本，而且减少了化学农药的残留及其对环境的污染。

具体实施方式：

实施例1：

(1)供试病菌及作物：

以梨轮纹病菌为供试菌(江苏省农业科学院植保研究所提供)，供试梨品种为“丰水”。

(2)供试药剂：

鲍曼菌液由南京大学提供，99％鲍曼菌液活性粗浸膏是通过鲍曼菌液经离心、大孔树脂吸附浓缩后得到(自制，每升鲍曼菌液可以获得0.53g)。将99％鲍曼菌液活性粗浸膏溶于水中，制成1000μg/ml母液备用；95％戊唑醇(南京盼丰化工有限公司提供)，溶于乙醇中，制成1000μg/ml母液备用。

(3)平皿菌丝生长抑制法

①预备试验

单剂毒力测定试验采用抑制生长速率法进行测定圈。取1.01g的99％鲍曼菌液活性粗浸膏和1.05g的95％戊唑醇用洒精配制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6等5个梯度浓度，在各个浓度试管吸取1ml药剂溶100ml的PSA培养基中。

②复配试验

在预备试验的基础上，选择各药剂对病菌菌丝生长抑制率在10～90％范围内的5个浓度。即单剂A(99％鲍曼菌液活性粗浸膏)和单剂B(95％戊唑醇)，按2∶1、1∶2、3∶1、1∶3、1∶1、2∶3、3∶2进行的配比。将配制好的供试药剂母液按照设定的浓度比例加入到50℃左右的PSA培养基中，充分混匀后倒入5个灭菌的培养皿中，制成系列浓度的含药PSA平板，以加乙醇PSA平板为对照。然后用直径为5mm的打孔器在预培养的轮纹病菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，菌丝面朝下接种到含药培养基平板中央，置于25±1℃下进行黑暗培养，待对照的菌落边缘接近皿壁时用十字交叉法测量各处理的菌落直径，并求出5次重复的平均值，得出各处理的平均菌落增长直径(平均菌落直径一5mm)，并计算各药剂处理对病菌的菌丝生长抑制率(％)。

相对抑菌率＝(对照菌饼直径一处理菌饼直径)/对照菌饼直径×100

以试验中设定的浓度对数为横坐标(x)，抑制率值为纵坐标(y)，求出各药剂对供试病菌的毒力回归曲线方程y＝a十bx、相关系数r以及有效抑制中浓度(EC₅₀值)。

增效计算方法参照农药室内生物测定试验准则：杀菌剂混配的联合作用测定(NY/T 1156.6-2006)。试验结果见表1。

表1各药剂对梨轮纹病菌的毒力测定

注：当SR＞1.5表示具有增效作用；当SR＜0.5表示有拮抗作用；当0.5≤SR≤1.5为相加作用。

杀菌剂的复配增效作用通常使用增效指数SR来衡量，由于混剂的增效系数在0.5≤SR≤1.5之间，复配剂有加和作用，大于1.5，复配剂有增效作用，即A、B组分的配比为1∶2、1∶3、2∶3和3∶1时，复配剂有加和作用，当A、B组分的配比为2∶1、3∶2和1∶1复配剂有增效作用。

实施例2：

40％鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇水悬浮剂的配制

A、B组分的配比为2∶1、3∶2和1∶1时其增效指数分别为1.53，1.76和1.63，其中以2∶1中戊唑醇的含量最低，因此我们选择最佳配比2∶1作为本实施例的基础。

助剂：乳化剂采用宁乳34^#；促进剂采用脱糖木质素磺酸钙；增稠剂采用黄原胶和硅酸镁铝；防冻剂采用乙二醇；消泡剂采用有机硅酮。

溶剂：自来水。

将各组分按照下列重量百分比备料：

有效活性成分：

鲍曼菌液活性粗浸膏26.7％，戊唑醇12.3％，相当于总量的40％；

助剂：

宁乳34^#5.0％，脱糖木质素磺酸钙10.0％，黄原胶0.5％，硅酸镁铝3.6％，有机硅酮0.01％，乙二醇5.0％，相当于总量的23.11％；

溶剂：

余量为溶剂，溶剂采用自来水，相当于总量的36.89％。

制备过程：

采用湿法工艺。将鲍曼菌液活性粗浸膏、戊唑醇、脱糖木质素磺酸钙和宁乳34^#按配比称量好，连同溶剂(自来水)总量的70％一起加入到砂磨釜中进行磨研，在研磨好后，加入称量好的黄原胶、硅酸镁铝、有机硅酮和乙二醇，以及剩余溶剂，搅拌均匀后，得到白色均相悬浮剂。

理化性能

用量筒混合法测定复配药分散性，在标准硬水条件下，(硬水配制方法参照农药乳液稳定测定方法GB/T 1603-2001)，将40％鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇水悬浮剂稀释500～3000倍液观察悬浮率均大于80％，本实施例可以满足在500～3000倍以下的稀释比例内使用。

冷贮稳定性

在-10±2℃下贮藏无结冰。

热贮稳定性

将40％鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇水悬浮剂装入50ml瓶中，密封，在54±2℃恒温箱中保存14d，取出冷却。查漏后在24h内检测有效成份含量符合标准要求。

本实施例根据世界卫生组织推荐的农药危害分级标准中分类为低毒级。大鼠急性经口LD₅₀分别为4800mg/kg。对家兔皮肤、眼睛无刺激性。在试验剂量内无致畸、致癌、致突变作用。

实施例3：

田间药效试验：

(1)药剂：

被测农药：

处理①：将40％鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇水悬浮剂(实施例2提供)的1500倍稀释液(有效药物成分266mg/L)；

处理②：将40％鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇水悬浮剂(实施例2提供)的2000倍稀释液(有效药物成分200mg/L)；

处理③：将40％鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇水悬浮剂(实施例2提供)的2500倍稀释液(有效药物成分160mg/L)；

对照农药：

处理④：99％鲍曼菌液活性粗浸膏(自制)的3000倍稀释液(有效药物成分330mg/L)；

处理⑤：25％戊唑醇SC的2000倍液(张家港七洲农药化工有限公司提供)(有效药物成分125mg/L)；

处理⑥：80％多菌灵可湿性粉剂的1000倍液(镇江农药厂有限公司提供)(有效药物成分800mg/L)；

空白对照

处理⑦：清水。

(2)试验方法：

田间药效试验在江苏省农业科学院园艺研究所试验田进行。供试品种为丰水梨，9年生，株行距4×5m。试验根据不同药剂共设7个处理，其中三个为被测农药组，三个为对照农药组，一个为空白对照组。每处理4次重复，每重复为一个小区，每小区2棵树，共计28个小区，随机区组排列。每小区用水量为4kg，施药器械为新加坡利农HD-400型背负式手动高压喷雾器。首次喷药在梨果谢花后10d进行，以后根据雨日分布情况每隔20d喷1次，共喷施5次。药效调查分别于采收期和贮藏期进行。采收期每处理随机调查200果实，记录总果数、病果数。采收当日，每处理剔除虫及机械伤果装筐，每处理不少于100个果，置自然室温下贮藏15d，调查药效。计算防效方法参照国家农药田间药效试验准则。采用邓肯氏新复极差Duncan法对试验数据进行分析。(参见表2)

表2  40％鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇水悬浮剂对梨轮纹病采收期防治效果

由表2可知：40％鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇水悬浮剂高、中、低剂量药后15d梨果实轮纹病的防效分别为89.3％、85.1％、82.3％；对照药剂99％鲍曼菌液活性粗浸膏3000倍稀释液防效为83.6％、25％戊唑醇SC2000倍稀释液防效为80.1％；80％多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释液防效为72.2％。由方差分析可知：40％鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇水悬浮剂高、中、低剂量之间防效有显著差异，且高、中剂量显著高于对照药剂(25％戊唑醇SC2000倍稀释液和80％多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释液)。

表3  40％鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇水悬浮剂对梨轮纹病贮藏期防治效果

由表3可知：40％鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇水悬浮剂高、中、低剂量贮藏15d时梨果实轮纹病的防效分别为87.2％、82.2％、75.9％；对照药剂99％鲍曼菌液活性粗浸膏3000倍稀释液防效为75.9％、25％戊唑醇SC 2000倍稀释液防效为73.1％；80％多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释液防效为65.9％。由方差分析表可知：40％鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇水悬浮剂高、中、低剂量之间防效有显著差异，且高、中剂量显著高于对照药剂(25％戊唑醇SC 2000倍液和80％多菌灵可湿性粉剂1000倍液)。

药效评价：40％鲍曼菌液活性粗浸膏戊唑醇水悬浮剂复配剂1500～2500倍液对梨轮纹病均有较好的防治效果，田间防效可达82％以上，室内防效可达72％以上，且对梨树生长安全。