产生肺炎链球菌(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE)荚膜多糖的缩短的纯化方法

摘要

本文阐述自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)细胞溶解产物培养液产生含有基本上纯化的荚膜多糖的溶液的经缩短方法。超滤并透析过滤澄清肺炎链球菌溶解产物，之后将pH调节至4.5以下、优选地约3.5，从而使溶液中至少98％的蛋白质沉淀而不严重影响多糖产率。此外，在超滤和透析过滤并酸化至低于4.5的pH后，使用活性炭进行过滤，使至少90％的剩余蛋白质沉淀而不严重影响多糖产率。可使用本发明经缩短方法来纯化的实例性非限制性肺炎链球菌血清型为1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一个实施例中，使用脱氧胆酸钠(DOC)溶解肺炎链球菌细胞；而在另一实施例中溶解剂为非动物源性溶解剂，例如N－月桂酰肌氨酸钠(NLS)。

说明书

技术领域

本发明涉及自肺炎链球菌(S.pneumoniae)血清型的细胞溶解产物去除过多可溶蛋白和其它杂质的方法，所述方法用于产生纯化的肺炎球菌多糖。

背景技术

肺炎链球菌是革兰氏(Gram)阳性刀形球菌，其通常成对出现(双球菌)，但也可以短链形式或单细胞形式出现。其易于在血液琼脂板上生长为闪光菌落并表现α溶血，而在厌氧生长时其表现β溶血。其对可裂解细胞壁的胆汁盐以及细胞自身的酶(自溶素)的存在敏感。所述有机体是兼性厌氧菌并且由于其具有复杂营养需求，因此其需要复杂营养。

大多数肺炎球菌血清型的细胞具有荚膜，其为每个细胞周围的多糖包衣。由于此荚膜可通过阻止抗体附接至细菌细胞来干扰吞噬作用，因此其为人类的毒力决定因素。现已确认90种荚膜血清型，其中23种血清型引发约90％的侵袭性疾病。多糖作为疫苗可赋予具有已发育或未受损免疫系统的个体以适当程度的针对肺炎链球菌的免疫力。然而，当使多糖与诸如CRM₁₉₇等高分子量蛋白质偶联并将其调配为含有多血清型偶联物的疫苗时，所述偶联疫苗使得可在肺炎球菌感染的风险同样为最高的婴儿和老人体内引发免疫应答。

用于疫苗产品的每种肺炎链球菌血清型的荚膜多糖都是通过在液体培养基中生长有机体来产生。经常使所述有机体种群自一个种瓶放大至多个种瓶，并使其通过一或多个可增加体积的种发酵罐直至发酵体积达到生产规模。可通过一或多种方式来确定生长周期的终点，在此时通过添加洗涤剂或其它可帮助裂解细胞壁并释放自溶素的试剂来溶解细胞，所述自溶素可在细胞到达静止期时导致细胞溶解。然后收获培养液用于下游(纯化)处理。主要污染物是细胞蛋白、核酸、C-多糖和培养基组份。对于当前市售7-价肺炎球菌偶联(7vPnC)疫苗(普雷夫那(Prevnar))以及新研发的13-价肺炎球菌偶联(13vPnC)疫苗的大多数血清型来说，现有纯化方法需要十六个步骤，其涉及许多昂贵的、劳动密集的并且需要技术性的操作，例如色谱法和多膜分离。先前改良用于肺炎链球菌多糖的纯化方法的尝试包括(例如)在发酵和回收期间调节pH(参见美国专利申请公开案第2006/0228381号)和溶剂与洗涤剂沉淀。然而，在这些方法中去除杂质仍需要多个劳动密集的高成本步骤。由于可溶蛋白的物理和化学特性，蛋白质含量是最难满足的技术要求。

因此，业内需要可降低肺炎链球菌溶解产物中的可溶蛋白质含量并且不具有现有纯化方法无效性的经简化纯化方法，以产生适合纳入肺炎球菌偶联疫苗中的基本上纯化的荚膜多糖。

发明内容

本发明涉及自肺炎链球菌细胞溶解产物产生基本上纯化的荚膜多糖的方法。所述方法包含以下步骤：

(a)提供包含可产生所选肺炎链球菌血清型的细菌细胞的发酵培养液；

(b)用溶解剂溶解步骤(a)中的细菌细胞，由此产生包含细胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的细胞溶解产物；

(c)使用离心或过滤来去除细胞碎片以澄清步骤(b)中的细胞溶解产物，由此产生澄清细胞溶解产物；

(d)超滤并透析过滤步骤(c)中的澄清细胞溶解产物以去除低分子量杂质并提高多糖浓度，由此产生渗余物；

(e)使步骤(d)中渗余物的pH降低至4.5以下以使蛋白质与核酸沉淀，由此形成酸化渗余物溶液；

(f)将步骤(e)中形成的酸化渗余物溶液保持足够长时间以使沉淀物沉降，之后过滤或离心酸化渗余物溶液，由此产生澄清多糖溶液；

(g)通过活性炭过滤器过滤步骤(f)中的澄清多糖溶液；

(h)超滤并透析过滤步骤(g)产生的经过滤溶液，由此产生经浓缩纯化多糖溶液；和

(i)使用无菌过滤器过滤步骤(h)产生的经浓缩纯化多糖溶液；

由此产生呈溶液形式的基本上纯化的荚膜多糖。本发明此实施例中所选实例性非限制性肺炎链球菌血清型是1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一特定实施例中，步骤(e)的pH降低至约3.5。在另一实施例中，步骤(h)的透析过滤包含将pH调节至约5.5至约7.5之间。在另一实施例中，步骤(h)的透析过滤包含将pH调节至约7.0至约7.5之间。在另一实施例中，步骤(h)的透析过滤包含将pH调节至约7.4。在又一实施例中，步骤(e)自步骤(d)的渗余物去除至少98％的蛋白质。在另一实施例中，步骤(g)自步骤(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白质。在另一实施例中，步骤(g)的活性炭过滤器包含木质磷酸-活性炭。在另一实施例中，步骤(f)包含将步骤(e)中形成的酸化渗余物溶液保持至少2小时。在又一实施例中，步骤(b)中的溶解剂为脱氧胆酸钠(DOC)。在另一实施例中，步骤(b)中的溶解剂为非动物源性溶解剂。在又一实施例中，步骤(b)中的溶解剂为非动物源性溶解剂N-月桂酰肌氨酸钠(NLS)。

通过本发明方法自肺炎链球菌细胞溶解产物产生的基本上纯化的荚膜多糖可用于产生肺炎球菌疫苗，优选地产生含有与蛋白质载体偶联的多糖的肺炎球菌疫苗。

本发明也涉及自包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的肺炎链球菌细胞溶解产物产生基本上纯化的荚膜多糖的方法。所述方法包含以下步骤：

(a)提供包含可产生肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的细菌细胞的发酵培养液；

(b)用溶解剂溶解步骤(a)中的细菌细胞，由此产生包含细胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的细胞溶解产物；

(c)使用离心或过滤来去除细胞碎片以澄清步骤(b)中的细胞溶解产物，由此产生澄清细胞溶解产物；

(d)在室温和中性pH下于无盐介质中超滤并透析过滤步骤(c)中的澄清细胞溶解产物以去除低分子量杂质并提高多糖浓度，由此产生无盐渗余物；

(e)使步骤(d)中无盐渗余物的pH降低至4.5以下以使蛋白质与核酸沉淀，由此形成酸化渗余物溶液；

(f)将步骤(e)中形成的酸化渗余物溶液在室温下保持至少2小时以使沉淀物沉降，之后过滤或离心酸化渗余物溶液，由此产生澄清多糖溶液；

(g)通过活性炭过滤器过滤步骤(f)中的澄清多糖溶液；

(h)超滤并透析过滤步骤(g)产生的经过滤溶液，由此产生经浓缩纯化多糖溶液；和

(i)使用无菌过滤器过滤步骤(h)产生的经浓缩纯化多糖溶液；

由此产生包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的呈溶液形式的基本上纯化的荚膜多糖。在一特定实施例中，步骤(e)的pH降低至约3.5。在另一实施例中，步骤(h)的透析过滤包含将pH调节至约5.5至约7.5之间。在另一实施例中，步骤(h)的透析过滤包含将pH调节至约7.0至约7.5之间。在另一实施例中，步骤(h)的透析过滤包含将pH调节至约7.4。在又一实施例中，步骤(e)自步骤(d)的渗余物去除至少98％的蛋白质。在另一实施例中，步骤(g)自步骤(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白质。在另一实施例中，步骤(g)的活性炭过滤器包含木质磷酸-活性炭。在又一实施例中，步骤(b)中的溶解剂为脱氧胆酸钠(DOC)。在另一实施例中，步骤(b)中的溶解剂为非动物源性溶解剂。在又一实施例中，步骤(b)中的溶解剂为非动物源性溶解剂N-月桂酰肌氨酸钠(NLS)。

本发明也涉及自包含血清型19A的肺炎链球菌细胞溶解产物产生基本上纯化的荚膜多糖的方法。所述方法包含以下步骤：

(a)提供包含可产生肺炎链球菌血清型19A的细菌细胞的发酵培养液；

(b)用溶解剂溶解步骤(a)中的细菌细胞，由此产生包含细胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的细胞溶解产物；

(c)使用离心或过滤来去除细胞碎片以澄清步骤(b)中的细胞溶解产物，由此产生澄清细胞溶解产物；

(d)在约4℃和约6的pH下于磷酸钠缓冲液中超滤并透析过滤步骤(c)中的澄清细胞溶解产物以去除低分子量杂质并提高多糖浓度，由此产生渗余物；

(e)使步骤(d)中渗余物的pH降低至4.5以下以使蛋白质与核酸沉淀，由此形成酸化渗余物溶液；

(f)将步骤(e)中形成的酸化渗余物溶液在约4℃下保持至少2小时以使沉淀物沉降，之后过滤或离心酸化渗余物溶液，由此产生澄清多糖溶液；

(g)将步骤(f)中的澄清多糖溶液的pH调节至约6，由此产生pH经调节的澄清多糖溶液；

(h)通过活性炭过滤器过滤步骤(g)中的pH经调节的澄清多糖溶液；

(i)超滤并透析过滤步骤(h)中产生的经过滤溶液，由此产生经浓缩纯化多糖溶液；和

(j)使用无菌过滤器过滤步骤(i)中产生的经浓缩纯化多糖溶液；

由此产生包含血清型19A的呈溶液形式的基本上纯化的荚膜多糖。在一特定实施例中，步骤(e)的pH降低至约3.5。在另一实施例中，步骤(i)的透析过滤包含将pH调节至约5.5至约7.5之间。在另一实施例中，步骤(i)的透析过滤包含将pH调节至约7.0至约7.5之间。在另一实施例中，步骤(i)的透析过滤包含将pH调节至约7.4。在又一实施例中，步骤(e)自步骤(d)的渗余物去除至少98％的蛋白质。在另一实施例中，步骤(h)自步骤(g)的pH经调节的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白质。在另一实施例中，步骤(h)的活性炭过滤器包含木质磷酸-活性炭。在另一实施例中，步骤(d)中的磷酸钠缓冲液为25mM磷酸钠。在又一实施例中，步骤(b)中的溶解剂为脱氧胆酸钠(DOC)。在另一实施例中，步骤(b)中的溶解剂为非动物源性溶解剂。在又一实施例中，步骤(b)中的溶解剂为非动物源性溶解剂N-月桂酰肌氨酸钠(NLS)。

附图说明

图1展示使用本发明缩短的纯化方法时血清型5的平均工序间多糖(PS)产率、蛋白质/PS比率、和核酸(NA)/PS比率。展示每个纯化步骤的结果。

图2展示得自现有纯化方法的血清型4 PS NMR波谱(A)与得自缩短纯化方法的血清型4PS NMR波谱(B)的对比。在两个波谱间未观察到显著差异。两个波谱中从右边数第二个峰都为丙酮酸盐，并且在两个波谱中丙酮酸盐基团的峰高相当。

图3展示使用本发明缩短纯化方法时血清型4的平均工序间PS产率、蛋白质/PS比率、和NA/PS比率。展示每个纯化步骤的结果。

图4展示使用本发明缩短纯化方法时血清型19A的平均工序间PS产率、蛋白质/PS比率、和NA/PS比率。展示每个纯化步骤的结果。

图5展示使用本发明缩短纯化方法时血清型7F的平均工序间PS产率、蛋白质/PS比率和NA/PS比率。展示每个纯化步骤的结果。

图6展示使用本发明缩短纯化方法时血清型6B的平均工序间PS产率、蛋白质/PS比率和NA/PS比率。展示每个纯化步骤的结果。

图7展示使用本发明缩短纯化方法时血清型6A的平均工序间PS产率、蛋白质/PS比率和NA/PS比率。展示每个纯化步骤的结果。

图8展示使用本发明缩短纯化方法时血清型1的平均工序间PS产率、蛋白质/PS比率和NA/PS比率。展示每个纯化步骤的结果。

图9展示使用本发明缩短纯化方法时血清型14的平均工序间PS产率、蛋白质/PS比率和NA/PS比率。展示每个纯化步骤的结果。

图10展示使用本发明缩短纯化方法纯化的血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F的工序间PS产率的对比。

图11展示使用本发明缩短纯化方法纯化的血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F的蛋白质/PS比率的对比。比较每个纯化步骤的结果。

图12展示使用本发明缩短纯化方法纯化的血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F的NA/PS比率的对比。比较每个纯化步骤的结果。

图13展示本发明缩短纯化方法中酸化步骤产生的蛋白质去除效率。相对于酸化前初始蛋白质浓度绘示血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F批次酸化前后蛋白质浓度(SDS-PAGE)的差异。用蛋白质浓度差异除以初始蛋白质浓度来反应酸化步骤的蛋白质去除率。

图14展示本发明缩短纯化方法中炭吸附步骤产生的蛋白质去除效率。相对于初始蛋白质载量绘示血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F批次的蛋白质去除(吸附在炭上)量。用蛋白质去除量除以初始蛋白质载量来反映炭吸附步骤的蛋白质去除率。

具体实施方式

本发明涉及可在肺炎链球菌细胞溶解产物中降低可溶蛋白质含量以产生适合纳入肺炎球菌偶联疫苗中的基本上纯化的荚膜多糖的缩短纯化方法。对于当前市售7-价肺炎球菌偶联(7vPnC)疫苗(普雷夫那)以及新研发的13-价肺炎球菌偶联(13vPnC)疫苗的大多数血清型来说，现有多糖纯化方法需要多达十六个步骤。这些步骤涉及许多昂贵的、劳动密集的并且需要技术性的操作，例如色谱法和多膜分离。本发明方法在达成相同纯化的同时取消了这些步骤中的多达八个步骤，并且不需要实施色谱法。因此，本发明涉及更有效的纯化方法，其成本较低，用时较短，并且涉及的步骤较少。

本发明缩短的纯化方法涉及以下发现：超滤并透析过滤澄清肺炎链球菌细胞溶解产物培养液，之后将经浓缩溶解产物培养液的pH酸化至4.5以下，优选地酸化为约3.5，从而可沉淀溶液中至少98％的蛋白质而不严重影响多糖产率。通过超滤并透析过滤经溶解的澄清发酵培养液，之后将pH酸化至4.5以下、优选地约3.5，可消除蛋白质的“盐溶”效应并提高“盐析”蛋白质的比例。“盐溶”是指蛋白质的溶解度提高，而“盐析”是指在溶液中的蛋白质到达其等电点时发生沉淀。超滤和透析过滤步骤也可阻止当将经碳酸钠处理的培养液酸化至甚至pH 5.0时观察到的起泡(参见美国专利申请公开案第2006/0228381号)。因此，对澄清溶解产物培养液实施超滤和透析过滤使得可在肺炎链球菌血清型发酵期间使用任何诸如碳酸钠等低分子量pH滴定剂，并在将pH酸化至4.5以下时阻止澄清溶解产物培养液起泡。

“澄清溶解产物培养液“是指已进行离心或过滤来去除细胞碎片的溶解产物培养液。

“透析过滤(diafiltering、diafiltration、DF)“和类似术语是指(例如)使用具有适当物理和化学特性的半透膜自溶液中去除小分子。

“超滤(ultrafiltering、ultrafiltration、UF)”和类似术语是指(例如)使用具有适当物理和化学特性的半透膜区分溶液中的各种分子，并将相同分子浓缩至较小体积溶液中。

在本发明方法中，超滤和透析过滤通常包含“横向流”或“切向流”过滤以避免阻塞滤膜。在“横向流”过滤中，使欲过滤溶液横向经过膜表面。将穿过膜的物质称作渗透物。未穿过膜的物质称作渗余物。将渗余物再循环至进料库中以供再过滤。

只要可达成低于4.5、具体来说约3.5的pH，本文所用任何酸都可用于降低经超滤和透析过滤的溶解产物培养液的pH。因此，有机和矿物酸二者都可用于本发明方法中。本文所用术语“矿物酸”是指通过化学反应衍生自无机矿物质的与有机酸相反的酸。可用于本发明方法中的矿物酸的实例性非限制性实例包括盐酸、硝酸、磷酸、和硫酸。在特定实施例中，使经浓缩溶解产物培养液的pH降低至低于4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1或3.0。在其它实施例中，使经浓缩溶解产物培养液的pH降低至约4.4、约4.3、约4.2、约4.1、约4.0、约3.9、约3.8、约3.7、约3.6、约3.5、约3.4、约3.3、约3.2、约3.1、约3.0、约2.9、约2.8、约2.7、约2.6、约2.5、约2.4、约2.3、约2.2、约2.1或约2.0。

本发明缩短的纯化方法也涉及以下发现：结合上述浓缩和降低pH的步骤，使用活性炭过滤可使剩余蛋白质中的至少90％沉淀而不严重影响多糖产率。在特定实施例中，发现使用得自锯末或其它木质产品并且经磷酸活化的炭实施炭过滤可比现有炭过滤方法中所用的炭更有效地减少或去除蛋白质杂质。

因此，本发明涉及自肺炎链球菌细胞溶解产物产生基本上纯化的荚膜多糖的方法，其包含以下步骤：

(a)提供包含可产生所选肺炎链球菌血清型的细菌细胞的发酵培养液；

(b)用溶解剂溶解步骤(a)中的细菌细胞，由此产生包含细胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的细胞溶解产物；

(c)使用离心或过滤来去除细胞碎片以澄清步骤(b)中的细胞溶解产物，由此产生澄清细胞溶解产物；

(d)超滤并透析过滤步骤(c)中的澄清细胞溶解产物以去除低分子量杂质并提高多糖浓度，由此产生渗余物；

(e)使步骤(d)中渗余物的pH降低至4.5以下、具体来说约3.5以使蛋白质与核酸沉淀，由此形成酸化渗余物溶液；

(f)步骤(e)中形成的酸化渗余物溶液在搅拌或不搅拌的情况下保持足够长时间、具体来说至少2小时以使沉淀物沉降，之后过滤或离心酸化渗余物溶液，由此产生澄清多糖溶液；

(g)通过活性炭过滤器、具体来说包含木质磷酸-活性炭的活性炭过滤器来过滤步骤(f)中的澄清多糖溶液；

(h)超滤并透析过滤步骤(g)产生的经过滤溶液，由此产生经浓缩纯化多糖溶液；和

(i)使用无菌过滤器过滤步骤(h)产生的经浓缩纯化多糖溶液；

由此产生呈溶液形式的基本上纯化的荚膜多糖。步骤(i)中的无菌过滤可用于自经浓缩纯化多糖溶液去除细菌和颗粒。本发明此实施例中所选实例性非限制性肺炎链球菌血清型为1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一特定实施例中，步骤(e)自步骤(d)中的渗余物去除至少98％的蛋白质。在另一实施例中，步骤(g)自步骤(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白质。在另一实施例中，步骤(h)的透析过滤包含将pH调节至约5.5至约7.5之间。然而，为改良在长期储存期间基本上纯化的荚膜多糖的稳定性，步骤(h)的透析过滤包含将pH调节至约7.0至约7.5，并且更具体来说调节至约7.4。

本文所用术语“含有基本上纯化的荚膜多糖的溶解产物“或”含有基本上纯化的荚膜多糖的溶液“是指肺炎链球菌细胞溶解产物或溶液，其中已去除蛋白质从而使得蛋白质与多糖的百分比比率(蛋白质/PS)小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％并且核酸与多糖的百分比比率(NA/PS)小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在特定实施例中，在包含指定血清型并含有基本上纯化的荚膜多糖的溶解产物或溶液中，蛋白质/PS和NA/PS的百分比比率如下所述：对于血清型1，蛋白质/PS比率小于2％并且NA/PS比率小于2％；对于血清型4，蛋白质/PS比率小于3％并且NA/PS比率小于2％；对于血清型5，蛋白质/PS比率小于或等于7.5％并且NA/PS比率小于或等于2％；对于血清型6A，蛋白质/PS比率小于2％并且NA/PS比率小于2％；对于血清型6B，蛋白质/PS比率小于4％并且NA/PS比率小于1％；对于血清型7F，蛋白质/PS比率小于5％并且NA/PS比率小于2％；对于血清型9V，蛋白质/PS比率小于2％并且NA/PS比率小于1％；对于血清型14，蛋白质/PS比率小于3％并且NA/PS比率小于2％；对于血清型18C，蛋白质/PS比率小于2％并且NA/PS比率小于2％；对于血清型19A，蛋白质/PS比率小于2％并且NA/PS比率小于2％；对于血清型19F，蛋白质/PS比率小于3％并且NA/PS比率小于2％；并且对于血清型23F，蛋白质/PS比率小于2％并且NA/PS比率小于2％。量化细胞溶解产物或溶液中蛋白质、多糖和核酸浓度的方法为业内所熟知并且包括(例如)SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析、HPLC(高效液相色谱)和SEC(尺寸排阻色谱)、修改的劳里(Lowry)分析、分光光度法、SEC-MALLS(分子排阻色谱/多角度激光散射)、和NMR(核磁共振)。

在本发明方法中，可使用任何溶解剂来溶解细菌细胞。“溶解剂“是包括(例如)洗涤剂在内的任何可帮助细胞壁裂解并释放自溶素的试剂，所述自溶素可导致细胞溶解。本文所用术语“洗涤剂”是指能诱导细菌细胞溶解的任何阴离子型或阳离子型洗涤剂。用于本发明方法中的所述洗涤剂的代表性实例包括脱氧胆酸钠(DOC)、N-月桂酰肌氨酸(NLS)、鹅脱氧胆酸钠和皂苷。

在本发明一实施例中，用于溶解细菌细胞的溶解剂为DOC。DOC是胆汁酸脱氧胆酸的钠盐，其一般得自诸如母牛或公牛等生物来源。DOC活化LytA蛋白，其为肺炎链球菌细胞壁生长和分裂中涉及的自溶素。LytA蛋白在其C-末端部分具有胆碱结合结构域，并且已知lytA基因的突变可产生对DOC溶解具有抗性的LytA突变体。

尽管没有证据表明在肺炎链球菌多糖纯化期间使用DOC会造成健康危险，但使用所述生物源试剂可能会产生潜在的调控问题。因此，在本发明一实施例中，用于溶解细菌细胞的溶解剂是非动物源性溶解剂。用于本发明方法中的非动物源性溶解剂包括作用模式与DOC类似(即影响LytA功能并导致肺炎链球菌细胞溶解)的来自非动物源的试剂。所述非动物源性溶解剂包括(但不限于)DOC类似物、表面活性剂、洗涤剂和胆碱的结构类似物，并且可使用下文实验部分中所述的程序来确定。在一实施例中，非动物源性溶解剂选自由以下组成的群组：癸烷磺酸、叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇(例如伊格保(Igepal)CA-630，CAS编号：9002-93-1，购自西格玛-奥德里奇(SigmaAldrich)，密苏里州圣路易斯(St.louis，MO))、辛基苯酚氧化乙烯缩合物(例如曲拉通(Triton)X-100，购自西格玛-奥德里奇，密苏里州圣路易斯)、N-月桂酰肌氨酸钠(NLS)、亚氨基二丙酸月桂酯、十二烷基硫酸钠、鹅脱氧胆酸盐、猪脱氧胆酸盐、甘氨脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、和胆酸盐。在另一实施例中，非动物源性溶解剂是NLS。

本发明也涉及对上述方法的血清型特异性修改。例如，由于血清型19A多糖不稳定并且其分子量在纯化期间发生变化，因此发现对所述方法进行修改可用于稳定19A多糖。这些修改包括在酸化前在约4℃和约6的pH下于磷酸钠缓冲液中实施超滤和透析过滤步骤，在约4℃下将酸化渗余物溶液保持至少2小时以使沉淀物沉降，以及在实施活性炭过滤步骤之前将澄清多糖溶液的pH调节至6。相反，人们发现对于血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F来说，当在酸化前于诸如水等无盐介质中实施超滤和透析过滤步骤时，可达成较少多糖损失和较高蛋白质去除，并且此步骤可在室温和中性pH下实施。

因此，本发明也涉及自包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的肺炎链球菌细胞溶解产物产生基本上纯化的荚膜多糖的方法，其包含以下步骤：

(a)提供包含可产生肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的细菌细胞的发酵培养液；

(b)用洗涤剂溶解步骤(a)中的细菌细胞，由此产生包含细胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的细胞溶解产物；

(c)使用离心或过滤来去除细胞碎片以澄清步骤(b)中的细胞溶解产物，由此产生澄清细胞溶解产物；

(d)在室温和中性pH下于无盐介质中超滤并透析过滤步骤(c)中的澄清细胞溶解产物以去除低分子量杂质并提高多糖浓度，由此产生无盐渗余物；

(e)使步骤(d)中无盐渗余物的pH降低至4.5以下、具体来说约3.5以使蛋白质与核酸沉淀，由此形成酸化渗余物溶液；

(f)将步骤(e)中形成的酸化渗余物溶液在室温和搅拌或不搅拌的情况下保持至少2小时以使沉淀物沉降，之后过滤或离心酸化渗余物溶液，由此产生澄清多糖溶液；

(g)通过活性炭过滤器、具体来说包含木质磷酸-活性炭的活性炭过滤器来过滤步骤(f)中的澄清多糖溶液；

(h)超滤并透析过滤步骤(g)产生的经过滤溶液，由此产生经浓缩纯化多糖溶液；和

(i)使用无菌过滤器过滤步骤(h)产生的经浓缩纯化多糖溶液；

由此产生包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的呈溶液形式的基本上纯化的荚膜多糖。在一特定实施例中，步骤(e)自步骤(d)中的无盐渗余物去除至少98％的蛋白质。在另一实施例中，步骤(g)自步骤(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白质。在另一实施例中，步骤(h)的透析过滤包含将pH调节至约5.5至约7.5之间。然而，为改良在长期储存期间基本上纯化的荚膜多糖的稳定性，步骤(h)的透析过滤包含将pH调节至约7.0至约7.5，并且更具体来说调节至约7.4。

本发明也涉及自包含血清型19A的肺炎链球菌细胞溶解产物产生基本上纯化的荚膜多糖的方法，其包含以下步骤：

(a)提供包含可产生肺炎链球菌血清型19A的细菌细胞的发酵培养液；

(b)用洗涤剂溶解步骤(a)中的细菌细胞，由此产生包含细胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的细胞溶解产物；

(c)使用离心或过滤来去除细胞碎片以澄清步骤(b)中的细胞溶解产物，由此产生澄清细胞溶解产物；

(d)在约4℃和约6的pH下于磷酸钠缓冲液(25mM磷酸钠)中超滤并透析过滤步骤(c)中的澄清细胞溶解产物以去除低分子量杂质并提高多糖浓度，由此产生渗余物；

(e)使步骤(d)中渗余物的pH降低至4.5以下、尤其约3.5以使蛋白质与核酸沉淀，由此形成酸化渗余物溶液；

(f)将步骤(e)中形成的酸化渗余物溶液在约4℃和搅拌或不搅拌的情况下保持至少2小时以使沉淀物沉降，之后过滤或离心酸化渗余物溶液，由此产生澄清多糖溶液；

(g)将步骤(f)中的澄清多糖溶液的pH调节至约6，由此产生pH经调节的澄清多糖溶液；

(h)通过活性炭过滤器、具体来说包含木质磷酸-活性炭的活性炭过滤器来过滤步骤(g)中的pH经调节的澄清多糖溶液；

(i)超滤并透析过滤步骤(h)中产生的经过滤溶液，由此产生经浓缩纯化多糖溶液；和

(j)使用无菌过滤器过滤步骤(i)中产生的经浓缩纯化多糖溶液；

由此产生包含血清型19A的呈溶液形式的基本上纯化的荚膜多糖。在一特定实施例中，步骤(e)自步骤(d)中的渗余物去除至少98％的蛋白质。在另一实施例中，步骤(h)自步骤(g)的pH经调节的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白质。在另一实施例中，步骤(i)的透析过滤包含将pH调节至约5.5至约7.5之间。然而，为改良在长期储存期间基本上纯化的19A多糖的稳定性，步骤(i)的透析过滤包含将pH调节至约7.0至约7.5，并且更具体来说调节至约7.4。

提供以下实例以举例说明而非限制本发明。

实验

以下实例阐述使用本发明经改良方法以10L的规模纯化肺炎链球菌多糖血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F的结果，并将所述结果与现有纯化方法的结果进行比较。

实例1.用于肺炎链球菌多糖血清型1、4、5、6A、6B、7F、14和19A的缩短的纯化方法

用脱氧胆酸钠(DOC)溶解的肺炎链球菌发酵培养液是在其收获或储存于4℃下之后两天内获得，并在随后一周内加以处理。如下所述，本发明纯化方法相对于现有纯化方法包括以下变化：

1)将酸化步骤自开始时移至第一超滤/透析过滤(UF/DF)步骤后，并且将pH调节至3.5而非5；

2)将透析过滤缓冲液自0.025M磷酸盐变为去离子(DI)水；3)将炭吸附变为使用木质磷酸-活性炭的2CUNO R32SP碳盘(坤诺(CUNO)公司，韦恩(Wayne)，NJ)，并且将吸附时间自4次翻转延长至12次反转(每次反转为22分钟)；和4)在最后的30K透析过滤步骤期间当透析过滤约5次时将pH调节至7.4。相同纯化程序适用于血清型1、4、5、6A、6B或7F。对于血清型19A，进一步修改所述步骤并且在冷冻室中实施纯化，如下所述。

纯化步骤

所有步骤都是在室温下实施，但19A型例外，在此情况下所述方法是在4℃下于冷冻室中实施。

溶解产物的澄清：此步骤的目的是去除细胞碎片并澄清培养液。此步骤是通过离心或过滤来完成的。在20℃下(19A型为4℃)将培养液以10,000g离心30min或直至培养液变澄清，或用添加有赛普尔(Celpure)助滤剂(美理勤公司(AdvancedMinerals)，圣巴巴拉，CA)的微孔预滤器(Millipore Prefilter)(密理博(Millipore)公司，比尔里卡，MA)将其过滤。收集澄清溶解产物以供进一步处理并弃去沉淀。

第一UF/DF(超滤/透析过滤)：此步骤提供体积降低和缓冲液交换并且也去除低分子量杂质。将澄清溶解产物浓缩为初始体积的大约1/8。使用约10体积DI水(pH 6，19A为25mM磷酸盐)来实施透析过滤。

酸化：在此步骤中去除超过98％的蛋白质。将浓磷酸谨慎地搅拌添加至渗余物中。将渗余物的pH调节至pH 3.5的目标值。将酸化渗余物搅拌半小时并在室温下陈化过夜(将19A在4℃下陈化2小时)，导致蛋白质和核酸沉淀。

酸化渗余物的澄清：此步骤是在酸化后去除沉淀的澄清步骤。在20℃下于转子中以10,000rpm(17,000相对离心力或RCF)将酸化溶液的浆液离心一小时(6B例外，在此情况下于37℃下离心6小时)。收集上清液并弃去沉淀。在此步骤中也可使用以添加有赛普尔助滤剂(美理勤公司，圣巴巴拉，CA)的微孔预滤器(密理博公司，比尔里卡，MA)实施的深度过滤。

炭吸附：在大多数情况下，在对酸化100K渗余物实施离心后其为淡黄色。使用木质磷酸-活性炭通过炭吸附来达成颜色去除。此步骤也去除在酸化后剩余的残留蛋白。使澄清多糖溶液经5-6小时或过夜再循环经过炭过滤器(对于19A，在炭吸附前将pH调节至6)。

最终30K UF/DF：这是将溶液浓缩为＞2g/L的最终多糖(PS)浓度的另一次浓缩和缓冲液交换步骤，其中将所述溶液透析过滤至去离子(DI)水中。浓缩炭过滤PS溶液。然后用DI水将浓缩物透析过滤10X。在透析过滤期间将pH调节至7.4。

最终0.2μm无菌过滤：用0.22μm过滤器或可弃式无菌过滤器单元对最终PS溶液实施无菌过滤并将其储存于4℃冰箱中。

分析方法

蛋白质、PS、和核酸浓度的量化是使用业内熟知的方法来实施，包括SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析、HPLC(高效液相色谱)和SEC(尺寸排阻色谱)、修改的劳里分析、分光光度法、SEC-MALLS(分子排阻色谱/多角度激光散射)、和NMR(核磁共振)。

结果与讨论

5型经缩短纯化批次：表1中展示使用经缩短方法纯化5型的三个批次与使用现有方法的最终PS产率、PS分子量和主要杂质水平的对比。所有起始培养液皆为DOC溶解的高细胞密度发酵批次，其多糖浓度(约0.5g/L)高于标准SOP发酵培养液(约0.3g/L)。使用30K或50K膜来进行第一UF/DF步骤。使用杂质/PS比率来计算杂质水平。使用相同方法来量化本文所述所有其它血清型。

如表1中的数据所示，所有使用经缩短纯化方法的三个批次的蛋白质比率都满足≤7.5％的技术要求，并且也与现有方法相当。核酸(NA)以及C-多糖(C-PS)比率也分别远低于≤2.0％和≤35％的技术要求，并且与现有方法相当。表1中所示三个批次的最终PS产率和杂质水平的结果表明经缩短方法具有可再现性和稳定性。

令人关心的是多糖在3.5的较低pH下是否会水解。因此在纯化方法期间监测PS保留时间的变化，并测量最终经纯化PS的分子量。在HPLC色谱中未观察到血清型5的PS保留时间有显著变化。根据MALLS测量，通过经缩短方法与现有方法(284kg/mol)纯化的PS的分子量也没有显著差异。因此可断定经缩短纯化方法对经纯化PS的分子量无不良影响。

三个经缩短方法批次中每个处理步骤的工序间多糖产率、蛋白质/多糖比率和核酸/多糖比率概述于表2中。

在任一纯化方法中的每个步骤期间产物总会有所损失。对于这三个经缩短方法的批次来说，PS损失主要发生在第一UF/DF步骤和酸化步骤中。在第一UF/DF步骤中，PS因膜表面对PS或PS-蛋白质复合物的吸附而损失。可通过在透析过滤后用DI水冲洗膜的渗余物侧并将冲洗物与初始渗余物合并来将这种损失降至最低。在酸化步骤中PS可能因以下两种原因而损失：沉淀固体对PS的物理吸附，以及在酸化期间多糖与蛋白质结合而共沉淀。进一步研究此第二种可能性并且结果证实了PS/蛋白质的结合。

图1展示在每个纯化步骤中蛋白质/PS比率的降低。尽管离心步骤去除小部分蛋白质，但大部分蛋白质是在酸化步骤中去除。甚至蛋白质含量最高的批次在pH 3.5下处理后也仅检测到痕量的蛋白质。

与蛋白质/PS比率类似，核酸/PS比率表明各批次的杂质水平之间具有差异性。与相同步骤中的蛋白质去除相比，30/50K UF/DF步骤可去除大量核酸。不希望受限于理论，这种情况可能是因核酸的分子大小小于蛋白质所致，从而使其相对更容易通过30/50K UF/DF步骤来去除。第一离心和酸化步骤也去除大量核酸。

表2显示，活性炭吸附步骤也可降低蛋白质/PS和NA/PS水平。所述百分比降低不如最初两个步骤显著，但此步骤对去除溶液颜色具有重要作用并确保杂质水平符合技术要求。

4型经缩短纯化批次：4型的三个经缩短纯化批次概述于表3中。所有三个批次的进料培养液都经DOC溶解。

4型的PS产率也在50-60％之间。蛋白质/PS比率和核酸/PS比率完全符合其技术要求。C-PS比率也完全符合技术要求。所有三个批次的分子量都接近约300kg/mol。通过现有方法使用类似发酵培养液纯化的血清型4PS也具有285kg/mol的较低分子量。来自发酵培养液与最终纯化溶液的PS的HPLC色谱对比显示，PS保留时间没有差异。这表明，分子量差异的差异不是由于方法改变所致，而是由发酵方法的内在性质所致。

4型PS在经纯化分子中含有丙酮酸盐基团，并且此丙酮酸盐对用于肺炎球菌偶联疫苗中的偶联具有重要作用。为确保酸处理对丙酮酸盐数量无有害影响，实施NMR分析。图2展示标准4型PS与批次L29276-47的NMR波谱。两个波谱之间未观察到显著差异。两个波谱中从右边数第二个峰都为丙酮酸盐，并且在两个波谱中丙酮酸盐基团的峰高相当。所有三个经缩短方法批次的丙酮酸盐比率都为0.8mol/mol，并且符合＞0.7mol/mol的技术要求。

三个4型批次的工序间PS产率、蛋白质/PS和NA/PS比率概述于表4中。PS损失主要发生在第一离心、酸化和活性炭吸附步骤中，平均分别损失10％、8％和20％。总PS产率与5型接近，约为55％。

图3展示表4所示三个批次中每个纯化步骤的平均PS产率、蛋白质/PS和NA/PS比率变化。正如人们所预期，蛋白质去除主要发生在酸化步骤中。第一离心和UF/DF步骤也共同去除了一定量的蛋白质，但蛋白质减少量小于酸化步骤。

与5型类似，核酸/PS比率降低主要发生在50/100K UF/DF、第一离心和酸化步骤中，并且第一UF/DF步骤中的NA降低远大于蛋白质降低。同样，如图3所示，活性炭步骤去除一定量的蛋白质和NA并且使杂质水平低于技术要求。其同样去除溶液颜色。

19A型经缩短纯化批次：在纯化期间19A型多糖不稳定并且分子量有所变化。稍微修改经缩短纯化方法以稳定19A多糖。这些修改概述如下：1)主要在4℃下于冷冻室中实施纯化步骤；2)使用25mM磷酸盐缓冲液(4℃，pH 6)而非使用具有室温的水来冷冻第一100K透析过滤物；3)将酸化保持时间自过夜缩短至2小时；和4)在澄清经酸化100K渗余物后，将pH调节至6并在pH 6而非pH 3.5下实施活性炭吸附。

通过经缩短纯化方法纯化的两个19A批次的结果展示于表5中。

两个经缩短纯化批次的PS产率分别为62％和76％。最终蛋白质/PS比率、核酸比率和C-PS比率都符合其各自的技术要求。两个批次多糖的最终分子量分别为525kg/mol和488kg/mol，并且接近于用于III期临床试验中的19A PS的分子量(486kg/mol)。

两个批次的蛋白质/PS比率都符合＜2％的技术要求。两个批次的NA和C-PS比率二者都完全符合其技术要求。

每个纯化步骤中的PS产率、蛋白质和NA的降低展示于表6和图4中。结果显示，除第一离心步骤外每个纯化步骤中都发生PS损失。与血清型5和4类似，蛋白质和NA去除主要发生在最初三个步骤中，并且在酸化后几乎检测不到任何蛋白质和NA残留。尽管活性炭吸附步骤不能大量去除蛋白质和NA(可能是因为在酸化后蛋白质和NA浓度极低)，但颜色去除仍需要这个步骤。

7F型经缩短纯化批次：7F型是非离子型多糖，与上述血清型相比，其在使用现有方法纯化期间通常需要改变步骤。然而，本发明经缩短纯化方法可成功适用于血清型7F而不需修改方法。使用经缩短方法来纯化两个批次的7F型培养液。一个批次是标准发酵培养液(L29276-107)并且另一个批次是高细胞密度培养液(L29276-157)。两个批次的结果概述于表7中。

7F型的PS产率实际上高于其它血清型，这可能是因为非离子型聚合物与带电荷蛋白质分子结合较少。最终蛋白质、NA和C-PS比率都完全符合其技术要求。7F型的分子量与标准批次相当，并且即使7F分子量相当高，PS溶液也不会非常粘稠，因为非离子型聚合物的排除体积较小。

各纯化步骤中的7F型PS产率、蛋白质和NA比率展示于表8中并且两个批次的平均值绘示于图5中。

在每个纯化步骤中都发生一些7F型PS损失。总之，PS损失少于血清型5和4。主要通过第一离心、100K UF/DF和酸化步骤来降低蛋白质和NA比率。与其它血清型类似，100K UF/DF去除NA比率去除蛋白质更有效。尽管活性炭吸附步骤因酸化后杂质水平极低而不能大量去除蛋白质和NA，但颜色去除仍需要此步骤。

6B型经缩短纯化批次：使用经缩短纯化方法来纯化两个批次的6B。人们发现澄清经酸化100K渗余物需要消耗比其它血清型更长的时间(6小时而非1小时)。除此差异外，所述纯化方法与血清型的纯化方法类似。两个批次的结果展示于表9中。

所有杂质水平(蛋白质、NA和C-PS)都完全符合其技术要求。与其它血清型相比，PS产率相对较高，并且蛋白质和NA比率也相对较高。

各纯化步骤中的工序间PS产率、蛋白质和NA比率展示于表10和图6中。

与19A类似，在每个纯化步骤中都发生PS损失，但第一离心步骤除外，其中PS稍微增加。主要通过第一离心、第一100K UF/DF和酸化步骤来达成蛋白质和NA的去除。然而，在活性炭吸附步骤中蛋白质和NA比率也有所降低。

6A型经缩短纯化批次：使用经缩短纯化方法来纯化两个批次的6A型。最终溶液的PS产率、杂质水平和分子量概述于表11中。

两个6A批次的最终PS产率都＞70％，这是使用经缩短方法处理的血清型中最高的产率。蛋白质、NA和C-PS比率都完全符合技术要求。

表12和图7展示各纯化步骤中的工序间PS产率、蛋白质和NA比率变化。在第一离心和100K UF/DF步骤中几乎没有任何PS损失。在酸化和活性炭吸附步骤中发生约10-15％的PS损失，这与其它血清型接近。主要通过第一离心、100K UF/DF和酸化来降低蛋白质和NA比率。在酸化后，蛋白质和NA比率二者都已低于其技术要求。对于蛋白质，酸化是最有效的步骤，而对于NA，100K UF/DF降低NA/PS比率的程度最大。尽管活性炭吸附步骤因酸化后杂质水平极低而不能大量去除蛋白质和NA，但颜色去除仍需要此步骤。

1型经缩短纯化批次：通过经缩短方法纯化的两个批次的1型概述于表13中。自高细胞密度发酵培养液来纯化批次L29276-170并且自标准发酵培养液来纯化L29276-173。

两个批次的PS产率为约50％，并且蛋白质、NA和C-PS的杂质水平完全符合其技术要求。

每个纯化步骤后的工序间PS产率、蛋白质和NA比率展示于表14和图8中。其趋势与所纯化的其它血清型类似。PS损失主要发生在酸化和活性炭吸附步骤中，并且蛋白质和NA去除主要发生在最初三个步骤中。在100K UF/DF步骤中去除的NA多于蛋白质。尽管活性炭吸附步骤因酸化后杂质水平极低而不能大量去除蛋白质和NA，但颜色去除仍需要此步骤。

14型经缩短纯化批次：使用方法未修改的经缩短纯化方法来纯化两个批次的血清型14。最终PS产率和杂质水平概述于表15中。

与血清型7F类似，血清型14是非离子型多糖，并且其现有纯化方法与其它血清型略有不同。然而，本发明经缩短纯化方法可成功适用于血清型14而不需要所述额外步骤。两个经缩短纯化方法批次的PS产率为50-60％，并且蛋白质和NA比率完全符合其技术要求。经纯化PS的分子量也符合技术要求。

工序间PS产率、蛋白质和NA比率概述于表16和图9中。观察到与上述所测试其它血清型类似的PS损失、蛋白质和NA去除趋势。

实例2不同血清型(血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F)的比较

为比较使用本发明经缩短纯化方法对不同血清型进行的纯化，在图10的一个图中绘示实例1中所述所有血清型以及血清型9V、18C和19F的PS去除。大多数血清型在每个纯化步骤中遵循类似的PS损失趋势。6B型在第一离心步骤中的PS产率和14型在酸化步骤中的PS产率有所提高。不同血清型的PS损失百分比各不相同。5型似乎在酸化步骤中损失最多PS，4型则在活性炭吸附步骤中损失最多。

每种血清型在每个纯化步骤中的蛋白质/PS比率展示于图11中。所述图显示，不同血清型的初始蛋白质/PS比率各不相同，其中1、4、5、9V、19F、和18C型具有最高初始蛋白质/PS比率。即使在第一UF/DF步骤后1、4、5、9V、19F和18C型的蛋白质/PS比率远高于其它血清型，酸化步骤也可显著降低蛋白质/PS比率，并且在此步骤后蛋白质残留很少。

如图12中所示，不同血清型的NA/PS比率也各不相同。1和5型具有最高NA/PS比率，18C和4型次之。第一离心和UF/DF步骤去除这些血清型中的大量NA，并且对于1型似乎最有效。在酸化步骤后仅残留极少量NA。

实例3酸化和活性炭吸附步骤效率分析(血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F)。

对于PnC多糖的纯化，最多最难去除的杂质是蛋白质。为更好地理解经缩短方法的杂质去除效率，分析两个主要纯化步骤酸化和活性炭吸附的蛋白质去除。对于酸化步骤，相对于使用本发明经缩短纯化方法酸化血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F之前的初始蛋白质浓度来绘示酸化前后的蛋白质浓度(SDS-PAGE)差异(图13)。

由于在酸化步骤前后溶液体积变化相对较小，因此用蛋白质浓度差异除以初始蛋白质浓度可反映酸化步骤的蛋白质去除率。图13展示相对于初始蛋白质浓度(通过SDS-PAGE分析来测量)线性拟合蛋白质浓度差异的斜率。观察到在蛋白质浓度变化与初始浓度之间存在极明确的线性关系，其中R²接近于1。斜率为0.9876，其对应于98.76％的蛋白质去除(假定可忽略溶液体积变化)。因此，对于所研究的所有血清型来说，酸化步骤极为有效并且其平均去除超过98％的蛋白质。

与酸化步骤类似，同样通过相对于初始蛋白质载量绘示所去除的蛋白质数量(吸附在炭上)来评估活性炭吸附步骤的效率(图14)。观察到在所去除蛋白质与初始蛋白质载量之间存在明确的线性关系，但R²(0.9723)不如酸化步骤高。因为此线性拟合的斜率对应于蛋白质去除率，所以活性炭吸附步骤导致93.87％的蛋白质去除。

根据对酸化和活性炭吸附步骤的分析，在实施所述两个步骤后溶液中仅残留约0.1％的蛋白质。

实例1-3的结论

人们研发出经缩短纯化方法来代替用于肺炎链球菌荚膜多糖的现有纯化方法。经缩短纯化方法可直接应用于血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C和19F，并且稍加修改即可应用于血清型19A。所述方法是以10L的规模使用经DOC溶解的发酵培养液来实施。包括蛋白质/PS、NA/PS和C-PS/PS比率在内的杂质水平都符合其各自的技术要求。PS产率超过50％并且与现有纯化方法相当。绘示工序间PS产率、蛋白质/PS和NA/PS比率以比较不同血清型的性质。根据实施100K UF/DF步骤前后的蛋白质/PS比率，人们发现血清型1、5、9V、19F和18C最难纯化。

步骤分析显示，酸化和活性炭吸附步骤分别去除超过98％和90％的蛋白质(通过SDS-PAGE来测量)。

实例4.在多糖产生中用非动物源性溶解剂取代脱氧胆酸钠

此实例研究是否可在上述产生基本上纯化的肺炎链球菌荚膜多糖的方法中使用非动物源性溶解剂作为脱氧胆酸钠(DOC)的取代物。如上所述，DOC活化LytA蛋白，其为肺炎链球菌细胞壁生长和分裂中所涉及的自溶素。LytA蛋白在其C-末端部分具有胆碱结合结构域，并且已知lytA基因的突变可产生对DOC溶解具有抗性的LytA突变体。

实施快速微量滴定板分析来确定通过与DOC类似的机制导致细胞溶解的化合物。已确定若干种DOC的非动物源性替代物，其在杀灭肺炎链球菌细胞并释放多糖方面与DOC同等有效。在使用标准条件处理后，用非动物源性化合物产生的多糖的大小和纯度与用DOC产生的多糖相同。

方法

细胞溶解：以0.1-0.01％(v/v)的终浓度将欲测试化合物添加至发酵培养液中，并将溶液在37℃下培育一小时。然后将溶液在2-8℃下储存过夜。第二天早上将溶液离心以去除所有细胞碎片。通过SEC-HPLC来分析无细胞培养液以测定所释放多糖的浓度。可在2-37℃之间的任一温度下、优选地在6.0-7.5的pH范围下实施溶解。根据具体洗涤剂，洗涤剂的浓度通常介于0.05-0.2％之间。

微量滴定分析：实施快速微量滴定板分析以检验不同洗涤剂或表面活性剂对肺炎球菌的lytA依赖性溶解。在分析中使用两对肺炎链球菌的等基因菌株；每对中的一个成员具有野生型lytA基因，而另一种菌株的lytA基因中有缺失。因此，如果溶解依赖于活性lytA功能，那么所述洗涤剂不能溶解突变体菌株。在Hy-大豆(HySoy)培养基中将四种菌株R6X、R6X ΔlytA、D39和D39 ΔlytA大致培养至对数中期(OD₆₀₀为约0.2-0.8；OD₆₀₀＝600nm下的光密度)。然后离心细胞并使细胞沉淀再悬浮于Hy-大豆培养基中。向微量滴定板的各孔中添加100μL细胞悬浮液以及10μL洗涤剂原液或对照用水。在36℃下保持约15分钟后，用斯白麦克斯(Spectramax)分光光度计(分子装置公司(Molecular Devices)，森尼韦尔，CA)来测量样品的OD₆₀₀。对于新制备的细胞或冷冻并解冻的细胞观察到以下结果：暴露于DOC、十二烷基硫酸钠、曲拉通X-100和N-月桂酰肌氨酸中的野生型细胞的OD值都与培养基空白相当，这表明发生溶解。另一方面，在这些洗涤剂存在下ΔlytA细胞未溶解，这表明这些洗涤剂溶解细胞需要LytA的功能。

用于对比分析研究的PS的分离：使培养物在10L生物反应器中于Hy-大豆培养基内生长。使用NaOH或Na₂CO₃将pH控制在7.0左右。在生长结束时(表现为光密度不再进一步增加)，用0.12％DOC或0.1％NLS处理培养物。将培养物培育12-16小时。通过将经处理培养液的样品平铺于TSA-血液琼脂板上来证实杀灭细胞的效力。自澄清溶解产物使用标准程序(如上所述)来纯化多糖。使用各种适合测定物质纯度和性质的标准分析技术来检验经纯化多糖。

使用与折射率(RI)检测器偶联的SEC-HPLC来测定溶解产物的PS含量。

使用血清型1和6B来筛选非动物源性溶解剂

使肺炎链球菌血清型1和6B在基于Hy-大豆的培养基中分开生长。分开收获各培养物并将其分别分配于试管中。为了筛选与DOC具有相当的溶解活性的非动物源性化合物，将其制备为原液(存于适宜溶剂中)并添加至培养物中。在培育过夜后，对各试管实施离心并通过SEC-HPLC来测定每种血清型溶解产物中的PS含量，并将其与DOC对比。

使用lytA突变体来筛选非动物源性溶解剂

使含有lytA突变的成对等基因菌株在基于Hy-大豆的培养基中生长。收获细胞并将其分配于微量滴定板的各孔中。添加测试化合物并培育培养物。在36℃下保持15min后，使用斯白麦克斯板读数器(分子装置公司，森尼韦尔，CA)来测定各孔的光密度(OD₆₀₀)(参见表17和18，其概述实例性化合物的两个单独测试的结果)。

根据上述筛选研究，确定DOC的以下非动物源性溶解剂替代物：癸烷磺酸、伊格保CA-630(叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇；CAS编号：9002-93-1；可购自西格玛-奥德里奇，密苏里州圣路易斯)、N-月桂酰肌氨酸钠(NLS)、亚氨基二丙酸月桂酯、十二烷基硫酸钠、曲拉通X-100、鹅脱氧胆酸盐、猪脱氧胆酸盐、甘氨脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、和胆酸盐。

DOC溶解的PS与NLS溶解的PS的对比

以10L的规模根据实例1和2中所述使用本发明经改良方法来纯化肺炎链球菌多糖血清型1、4、5、6A、6B和7F。然而，在一组中使用NLS(0.1％)作为溶解剂，而在另一组中使用DOC(0.12％)作为溶解剂。

如上所述来测量PS产率、蛋白质/PS比率、NA/PS比率和PS分子量，并且结果概述于表19中。这些结果显示，在本发明纯化方法中使用NLS作为溶解剂可获得相对较高的PS产率和相对较低的蛋白质和核酸水平。事实上，对于大多数所测试血清型来说，使用NLS作为溶解剂获得的PS产率高于使用DOC。

说明书中所提及的所有出版物和专利申请案均表现出本发明所属领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请案均以引用方式并入本文中，其程度如同表明将每一个别出版物或专利申请案明确地分别以引用方式并入本文中一般。

尽管为了清晰理解起见上文已通过阐释和实例的方式对本发明进行较详细的描述，但是显然可在随附权利要求的范围内实施某些改变或修改。