提高隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测回收率的过滤浓缩方法

摘要

一种水环境水质监测技术领域的提高隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测回收率的过滤浓缩方法，包括采样过滤；加入洗脱液；超声震荡和离心处理，待离心处理结束后依次采用免疫磁性分离法进行染色制片后用荧光显微镜计数，统计回收率。本发明通过对过滤浓缩阶段某些操作步骤进行改进，以达到降低隐孢子虫和贾第鞭毛虫测试成本和提高回收率的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种水质监测技术领域的方法，具体是一种提高隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测回收率的过滤浓缩方法。

背景技术

隐孢子虫(Cryptosporidium)和贾第鞭毛虫(Giardia)是2种严重危害水质安全的致病性原生动物。2007年7月1日实施的《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)与之前的标准相比在微生物指标部分增加了对贾第鞭毛虫、隐孢子虫的检测，其中明确规定隐孢子虫、贾第鞭毛虫的标准限值，即＜1个/10L。

经过对现有技术的检索发现，目前国际上最为常用的水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫标准检测方法是EPA1623方法，用EPA1623方法来检测两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)主要有三个步骤，分别为过滤浓缩、免疫磁性分离(IMS)和免疫荧光(IFA)镜检。该方法存在的主要问题是测试成本高、回收率低。通常测试一个水样的成本为2025元左右，其中采样过滤阶段使用的一次性进口滤囊的成本就高达1300元，占检测成本的三分之二。而使用该方法所能达到的两虫回收率通常只有20％左右，为EPA1623中规定的最低限值。通过对EPA1623方法的3个主要步骤的分步研究发现，两虫测试过程中，回收率主要损失在过滤浓缩阶段，而免疫磁分离和免疫荧光检测这两个步骤相对损失则非常小。按EPA1623方法，水样经滤囊过滤后加入洗脱液，采用震荡洗脱的办法将滤膜上的两虫洗脱下来。进一步的试验证实，这种机械性的震荡洗脱难以彻底将两虫从滤膜表面洗脱下来，从而导致两虫回收率损失较大。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种提高隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测回收率的过滤浓缩方法，通过对过滤浓缩阶段某些操作步骤进行改进，以达到降低隐孢子虫和贾第鞭毛虫测试成本和提高回收率的目的。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

第一步、将滤囊的两端分别密封连接橡皮管，并将一根橡皮管放入待测水样中，另一根橡皮管与真空泵密封连接，启动真空泵开始采样过滤。

所述的采样过滤是指：用计量泵将真空泵的流速调整至2L/min，采样时间为20min；

第二步、用密封盖密封滤囊的出水口，在滤囊的进水口中倒入150mL洗脱液，然后再次密封滤囊的进水口。

所述的洗脱液的组分及质量百分比含量为：1％表面活性剂、1％三羟甲基氨基甲烷、0.2％乙二胺四乙酸、1.5％消泡剂，余量为纯水。

所述的消泡剂为有机硅氧烷类消泡剂、聚醚类消泡剂或酰胺类消泡剂中的一种。

第三步、将两端密封的滤囊放入盛有40℃温水的超声装置中，设置超声频率为40kHz-60kHz，超声震荡时间为15分钟。

第四步、将滤囊取出并打开滤囊的进水口并倒入离心管中开始离心处理，待离心处理结束后依次采用免疫磁性分离法进行染色制片后用荧光显微镜计数，统计回收率。

本发明适用于所有的水源水和出厂水的水样检测，采用国产率囊+超声洗脱的方式替代EPA推荐使用的Envirochek囊式滤器和滤囊振荡器，可使测试一个水样的成本降低为865元，较EPA1623方法下降1160元左右。

EPA1623规定使用的滤囊振荡器只能达到上下振动的效果，因此需要每5分钟调节一次滤囊在振荡器上的方向，操作复杂且洗脱效果不佳。采用超声洗脱可通过空化效应产生的气泡不断作用在滤膜表面，使截留在滤膜表面的两虫得到彻底的洗脱。两种洗脱方法对比发现超声洗脱效果更佳，具体表现为可使两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)的回收率可提高10％以上。通过对超声频率、时间和水温的控制，可以得到两虫洗脱效果的最佳条件。

附图说明

图1为实施例测试环境示意图。

图2为实施例收率示意图。

图3为实施例6效果示意图。

图4为实施例7效果示意图。

图5为实施例8效果示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

取1份40L去离子水并分别加入两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)标样，水样中隐孢子虫和贾第鞭毛虫各100个；如图1所示，将两端连接橡皮管的滤囊的一端放入水样中，另一端连接真空泵，确保进水口与出水口末端连接正确之后，启动真空泵进行采样过滤，调整流速至2L/min，使水样通过滤囊流出，待水样全部经过滤囊，取下滤囊进水口端的橡皮管，确保不外溅出滤囊内的水，用密封盖盖好滤囊进水口；松开滤囊出口，让水样自然流干，用密封盖盖好出水口。

取下滤囊进水口的密封盖，倒入150ml事先配置好的洗脱液，盖好密封盖，把滤囊水平放入超声波装置中，装置中加水并使其充分淹没滤囊，设置频率为20KHZ，时间为15分钟，温度为40℃，开启超声波装置。超声波停止后取出滤囊，打开进水口的密封盖，倒出洗脱液至离心管内，开始离心处理，最后采用免疫磁分离法进行染色制片后用荧光显微镜计数，统计回收率。

所述的洗脱液的组分及质量百分比含量为：1％表面活性剂、1％三羟甲基氨基甲烷、0.2％乙二胺四乙酸、1.5％有机硅氧烷类消泡剂，余量为纯水。

如图2所示，本实施例中使用20KHZ的超声频率，在水温为40℃的条件下超声15分钟，两虫的回收率分别为：隐孢子虫的回收率为21％，贾第鞭毛虫的回收率为20％。

实施例2

取1份40L去离子水并分别加入两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)标样，水样中隐孢子虫和贾第鞭毛虫各100个；如图1所示，将两端连接橡皮管的滤囊的一端放入水样中，另一端连接真空泵，确保进水口与出水口末端连接正确之后，启动真空泵进行采样过滤，调整流速至2L/min，使水样通过滤囊流出，待水样全部经过滤囊，取下滤囊进水口端的橡皮管，确保不外溅出滤囊内的水，用密封盖盖好滤囊进水口；松开滤囊出口，让水样自然流干，用密封盖盖好出水口。

取下滤囊进水口的密封盖，倒入150ml事先配置好的洗脱液，盖好密封盖，把滤囊水平放入超声波装置中，装置中加水并使其充分淹没滤囊，设置频率为40KHZ，时间为15分钟，温度为40℃，开启超声波装置。超声波停止后取出滤囊，打开进水口的密封盖，倒出洗脱液至离心管内，开始离心处理，最后采用免疫磁分离法进行染色制片后用荧光显微镜计数，统计回收率。

所述的洗脱液的组分及质量百分比含量为：1％表面活性剂、1％三羟甲基氨基甲烷、0.2％乙二胺四乙酸、1.5％有机硅氧烷类消泡剂，余量为纯水。

如图2所示，本实施例中使用40KHZ的超声频率，在水温为40℃的条件下超声15分钟，两虫的回收率分别为：隐孢子虫的回收率为33％，贾第鞭毛虫的回收率为30％。

实施例3

取1份40L去离子水并分别加入两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)标样，水样中隐孢子虫和贾第鞭毛虫各100个；如图1所示，将两端连接橡皮管的滤囊的一端放入水样中，另一端连接真空泵，确保进水口与出水口末端连接正确之后，启动真空泵进行采样过滤，调整流速至2L/min，使水样通过滤囊流出，待水样全部经过滤囊，取下滤囊进水口端的橡皮管，确保不外溅出滤囊内的水，用密封盖盖好滤囊进水口；松开滤囊出口，让水样自然流干，用密封盖盖好出水口。

取下滤囊进水口的密封盖，倒入150ml事先配置好的洗脱液，盖好密封盖，把滤囊水平放入超声波装置中，装置中加水并使其充分淹没滤囊，设置频率为60KHZ，时间为15分钟，温度为40℃，开启超声波装置。超声波停止后取出滤囊，打开进水口的密封盖，倒出洗脱液至离心管内，开始离心处理，最后采用免疫磁分离法进行染色制片后用荧光显微镜计数，统计回收率。

所述的洗脱液的组分及质量百分比含量为：1％表面活性剂、1％三羟甲基氨基甲烷、0.2％乙二胺四乙酸、1.5％聚醚类消泡剂或酰，余量为纯水。

如图2所示，本实施例中使用60KHZ的超声频率，在水温为40℃的条件下超声15分钟，两虫的回收率分别为：隐孢子虫的回收率为35％，贾第鞭毛虫的回收率为33％。

实施例4

取1份40L去离子水并分别加入两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)标样，水样中隐孢子虫和贾第鞭毛虫各100个；如图1所示，将两端连接橡皮管的滤囊的一端放入水样中，另一端连接真空泵，确保进水口与出水口末端连接正确之后，启动真空泵进行采样过滤，调整流速至2L/min，使水样通过滤囊流出，待水样全部经过滤囊，取下滤囊进水口端的橡皮管，确保不外溅出滤囊内的水，用密封盖盖好滤囊进水口；松开滤囊出口，让水样自然流干，用密封盖盖好出水口。

取下滤囊进水口的密封盖，倒入150ml事先配置好的洗脱液，盖好密封盖，把滤囊水平放入超声波装置中，装置中加水并使其充分淹没滤囊，设置频率为80KHZ，时间为15分钟，温度为40℃，开启超声波装置。超声波停止后取出滤囊，打开进水口的密封盖，倒出洗脱液至离心管内，开始离心处理，最后采用免疫磁分离法进行染色制片后用荧光显微镜计数，统计回收率。

所述的洗脱液的组分及质量百分比含量为：1％表面活性剂、1％三羟甲基氨基甲烷、0.2％乙二胺四乙酸、1.5％酰胺类消泡剂，余量为纯水。

如图2所示，本实施例中使用20KHZ的超声频率，在水温为40℃的条件下超声15分钟，两虫的回收率分别为：隐孢子虫的回收率为28％，贾第鞭毛虫的回收率为21％。

实施例5

取1份40L去离子水并分别加入两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)标样，水样中隐孢子虫和贾第鞭毛虫各100个；如图1所示，将两端连接橡皮管的滤囊的一端放入水样中，另一端连接真空泵，确保进水口与出水口末端连接正确之后，启动真空泵进行采样过滤，调整流速至2L/min，使水样通过滤囊流出，待水样全部经过滤囊，取下滤囊进水口端的橡皮管，确保不外溅出滤囊内的水，用密封盖盖好滤囊进水口；松开滤囊出口，让水样自然流干，用密封盖盖好出水口。

取下滤囊进水口的密封盖，倒入150ml事先配置好的洗脱液，盖好密封盖，把滤囊水平放入超声波装置中，装置中加水并使其充分淹没滤囊，设置频率为100KHZ，时间为15分钟，温度为40℃，开启超声波装置。超声波停止后取出滤囊，打开进水口的密封盖，倒出洗脱液至离心管内，开始离心处理，最后采用免疫磁分离法进行染色制片后用荧光显微镜计数，统计回收率。

所述的洗脱液的组分及质量百分比含量为：1％表面活性剂、1％三羟甲基氨基甲烷、0.2％乙二胺四乙酸、1.5％酰胺类消泡剂，余量为纯水。

如图2所示，本实施例中使用100KHZ的超声频率，在水温为40℃的条件下超声15分钟，两虫的回收率分别为：隐孢子虫的回收率为20％，贾第鞭毛虫的回收率为17％。

实施例6

取2份40L去离子水并分别加入两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)标样，每份水样中隐孢子虫和贾第鞭毛虫各100个；如图1所示，将两端连接橡皮管的进口滤囊和滤囊的一端分别放入水样中，另一端连接真空泵，确保进水口与出水口末端连接正确之后，启动真空泵进行采样过滤，调整流速至2L/min，使水样通过滤囊流出，待水样全部经过滤囊，取下滤囊进水口端的橡皮管，确保不外溅出滤囊内的水，用密封盖盖好滤囊进水口；松开滤囊出口，让水样自然流干，用密封盖盖好出水口。

取下进口滤囊进水口的密封盖，倒入150ml事先配置好的洗脱液，盖好密封盖，把进口滤囊固定在滤囊振荡器上，使进口滤囊保持水平，启动振荡器，设定速度在600rpm，时间为5min。之后旋转滤囊120度，重复两次。完毕，将滤囊中的溶液再全部倒进离心管内，开始离心。离心、免疫磁分离和荧光免疫镜检。

取下滤囊进水口的密封盖，倒入150ml事先配置好的洗脱液，盖好密封盖，把滤囊水平放入超声波装置中，装置中加水并使其充分淹没滤囊，设置频率为60KHZ，时间为15分钟，温度为40℃，开启超声波装置。超声波停止后取出滤囊，打开进水口的密封盖，倒出洗脱液至离心管内，开始离心处理，最后采用免疫磁分离法进行染色制片后用荧光显微镜计数，统计回收率。

所述的洗脱液的组分及质量百分比含量为：1％表面活性剂、1％三羟甲基氨基甲烷、0.2％乙二胺四乙酸、1.5％有机硅氧烷类消泡剂，余量为纯水。

对于加入两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)标样的去离子水，分别使用EPA1623方法和使用滤囊+超声波的替代方法的实验结果；如图3所示，使用替代方法能够使隐孢子虫的回收率提高了12％，贾第鞭毛虫的回收率了10％。一次性Envirochek囊式滤器的价格为1300元，而一次性滤囊的价格为140元，其它费用基本相同，故一次性测试成本降低1160元。

实施例7

从水厂中采集2份10L黄浦江源水和长江源水并分别加入两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)标样，每份水样中隐孢子虫和贾第鞭毛虫各100个；如图1所示，将两端连接橡皮管的进口滤囊和滤囊的一端分别放入水样中，另一端连接真空泵，确保进水口与出水口末端连接正确之后，启动真空泵进行采样过滤，调整流速至2L/min，使水样通过滤囊流出，待水样全部经过滤囊，取下滤囊进水口端的橡皮管，确保不外溅出滤囊内的水，用密封盖盖好滤囊进水口；松开滤囊出口，让水样自然流干，用密封盖盖好出水口。

取下进口滤囊进水口的密封盖，倒入150ml事先配置好的洗脱液，盖好密封盖，把滤囊固定在滤囊振荡器上，使滤囊保持水平，启动振荡器，设定速度在600rpm，时间为5min。之后旋转滤囊120度，重复两次。完毕，将滤囊中的溶液再全部倒进离心管内，开始离心处理，最后采用免疫磁分离法进行染色制片后用荧光显微镜计数，统计回收率。

取下滤囊进水口的密封盖，倒入150ml事先配置好的洗脱液，盖好密封盖，把滤囊水平放入超声波装置中，装置中加水并使其充分淹没滤囊，设置频率为60KHZ，时间为15分钟，温度为40℃，开启超声波装置。超声波停止后取出滤囊，打开进水口的密封盖，倒出洗脱液至离心管内，开始离心处理，最后采用免疫磁分离法进行染色制片后用荧光显微镜计数，统计回收率。

所述的洗脱液的组分及质量百分比含量为：1％表面活性剂、1％三羟甲基氨基甲烷、0.2％乙二胺四乙酸、1.5％有机硅氧烷类消泡剂，余量为纯水。

对于加入两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)标样的水源水，分别使用EPA1623方法和使用滤囊+超声波的替代方法的实验结果；如图4所示，使用替代方法能够使隐孢子虫的回收率提高了10％，贾第鞭毛虫的回收率了10％。一次性Envirochek囊式滤器的价格为1300元，而一次性滤囊的价格为140元，其它费用基本相同，故一次性测试成本降低1160元。

实施例8

从水厂中采集2份10L黄浦江源水和长江源水；如图1所示，将两端连接橡皮管的进口滤囊和滤囊的一端分别放入水样中，另一端连接真空泵，确保进水口与出水口末端连接正确之后，启动真空泵进行采样过滤，调整流速至2L/min，使水样通过滤囊流出，待水样全部经过滤囊，取下滤囊进水口端的橡皮管，确保不外溅出滤囊内的水，用密封盖盖好滤囊进水口；松开滤囊出口，让水样自然流干，用密封盖盖好出水口。

取下进口滤囊进水口的密封盖，倒入150ml事先配置好的洗脱液，盖好密封盖，把进口滤囊固定在滤囊振荡器上，使滤囊保持水平，启动振荡器，设定速度在600rpm，时间为5min。之后旋转滤囊120度，重复两次。完毕，将滤囊中的溶液再全部倒进离心管内，开始离心处理，最后采用免疫磁分离法进行染色制片后用荧光显微镜计数，统计回收率。

取下滤囊进水口的密封盖，倒入150ml事先配置好的洗脱液，盖好密封盖，把滤囊水平放入超声波装置中，装置中加水并使其充分淹没滤囊，设置频率为60KHZ，时间为15分钟，温度为40℃，开启超声波装置。超声波停止后取出滤囊，打开进水口的密封盖，倒出洗脱液至离心管内，开始离心处理，最后采用免疫磁分离法进行染色制片后用荧光显微镜计数，统计回收率。

所述的洗脱液的组分及质量百分比含量为：1％表面活性剂、1％三羟甲基氨基甲烷、0.2％乙二胺四乙酸、1.5％有机硅氧烷类消泡剂，余量为纯水。

对于不加入两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)标样的水源水，分别使用EPA1623方法和使用滤囊+超声波的替代方法的实验结果；如图5所示，两种方法都能检测出两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)的存在，由于水源水中两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)密度非常低，两者数量差异不大。一次性Envirochek囊式滤器的价格为1300元，而一次性滤囊的价格为140元，其它费用基本相同，故一次性测试成本降低1160元。