一株重组毕赤酵母菌株及其筛选方法

摘要

本发明涉及一种基因工程重组微生物及其筛选方法。一株重组毕赤酵母菌株，其特征在于为一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115－07ALDH2CCTCC No：M208266。本发明具有解酒、保肝效果好的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程重组微生物及其筛选方法。

背景技术

随着经济的高速发展，人民生活水平的不断提高，高品质的生活越来越受到人们的关注，这其中最重要的一条就是健康。但是经济的发展又伴随着人们饮食结构的改变，工作、生活压力的增大，运动的减少和居住生活环境的恶化等等对健康不利的因素，各种疾病特别是恶性疾病的发病率有逐年增高的趋势，其中肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位，在部份地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌，在我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。为了预防和治疗这些恶性疾病，全国每年花费大量的人力和物力，但收效甚微。

据统计，全球现在有1500万-2000万人酗酒，其中10％-20％的人有不同程度的酒精性肝病。在我国，也有不少人嗜好饮酒。据报道，适量饮酒对大多数人的健康并没有损害，少量饮用酒精性饮料，如葡萄酒，对身体还有一定的好处。但是，若长期过量饮酒，特别是饮用高度酒，会使肝细胞反复发生脂肪变性、坏死和再生，最终导致肝硬化、肝癌。

另外，根据报道乙醛脱氢酶的补充可以减少心肌缺血/再灌注损伤，减少心肌细胞由于缺氧而引起的凋亡等。许多文献已经表明乙醛脱氢酶的存在对心肌细胞都有良好的保护作用。

基于以上原因，社会迫切的需要一种行之有效的解酒、保肝的保健品出现。今年来出现一些含乙醛脱氢酶的解酒药的报道，但是乙醛脱氢酶至今获得途径的狭窄，成为该类保健品的瓶颈。

发明内容

本发明的目的在于提供一株重组毕赤酵母菌株及其筛选方法。

本发明所提供的一株重组毕赤酵母菌株，为一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株，已于2009年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO：M208266。

本发明所采用的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为华中农业大学生命科学技术学院赠送。

一株重组毕赤酵母菌株的筛选方法，其特征在于：

一).质粒pPIC9K-ALDH2的获得及其验证

1).目的序列设计与合成：

由Genebank上人ALDH2DNA(gene ID217)序列，删除UTR和信号肽并加上内切酶EcoR I和内切酶Not I酶切位点，再根据毕赤酵母密码子用法修改了28个碱基得到目的序列ALDH2；具体序列如下：

CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCAACCAGCAGCCCGAGGTCT  60

TCTGCAACCAGATTTTCATAAACAATGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAAACATTCC  120

CCACCGTCAATCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGAAGGGGACAAGGAAG  180

ATGTGGACAAGGCAGTGAAGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC  240

GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGAACAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG  300

ACAGAACCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT  360

ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCAAATGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA  420

AGTACCACGGGAAAACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACAAGGCATGAAC  480

CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGAATTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA  540

AGCTGGGCCCAGCCTTGGCAACTGGAAACGTGGTTGTGATGAAGGTAGCTGAGCAGACAC  600

CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG  660

TCAACATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG  720

TGGACAAAGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTAATCCAGGTTGCTGCTG  780

GGAGCAGCAACCTCAAGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCAACATCATCA  840

TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC  900

AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGAACCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT  960

TTGTGGAGCGAAGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGAACCCCTTTGATAGCA  1020

AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGAAGATCCTCGGCTACATCA  1080

ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTAAGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG  1140

GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCAAGG  1200

AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGAAGTTCAAGACCATAGAGGAGGTTGTTG  1260

GGAGAGCCAACAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACAAAGGATTTGGACA  1320

AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG  1380

TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG  1440

GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA  1500

AGAACTCAGCGGCCGA                                              1516

按上述目的序列ALDH2，用现有的重叠延伸法合成产人乙醛脱氢酶2序列(ALDH2)，用现有的常规方法将产人乙醛脱氢酶2连接在质粒pUC57上，得到质粒pUC57-ALDH2；使用上海生工的高效制备感受态细胞试剂盒制备大肠杆菌DH5α感受态细胞；将10μL质粒pUC57-ALDH2与50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰上放置30min，然后在42℃热击1-2min；再放置在冰上冷却1-2min后加入500μL的LB培养基，37℃振荡培养1h；取100μL培养物涂布到含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜，得到的含有质粒pUC57-ALDH2的阳性转化子，保存备用；

2).质粒构建：

a.酶切

用酚氯仿或DNA提取试剂盒从含有质粒pUC57-ALDH2的阳性转化子中提取质粒pUC57-ALDH2；准备质粒pPIC9K，并用内切酶EcoR I和内切酶Not I双酶切；

①按下述原料配比：

质粒pUC57-ALDH2            10μL，

缓冲液Wash Solution        3μL，

内切酶EcoR I(20U/μL)      1μL，

内切酶Not I(5U/μL)        3μL，

小牛血清白蛋白BSA(1mg/mL)  3μL，

蒸馏水                     10μL，

选取质粒pUC57-ALDH2、Wash Solution、内切酶EcoR I、内切酶Not I、小牛血清白蛋白和蒸馏水，在37℃酶切12h；电泳并用酚氯仿法或DNA提取试剂盒回收产人乙醛脱氢酶2序列；

②按下述原料配比：

质粒pPIC9K                10μL，

缓冲液Wash Solution       3μL，

内切酶EcoR I(20U/μL)     1μL，

内切酶Not I(5U/μL)       3μL，

小牛血清白蛋白BSA(1mg/mL) 3μL，

蒸馏水                    10μL，

选取质粒pPIC9K、缓冲液Wash Solution、内切酶EcoR I、内切酶Not I、小牛血清白蛋白和蒸馏水，在37℃酶切12h；电泳并用酚氯仿法或DNA提取试剂盒回收酶切后的质粒pPIC9K；

b.连接

按产人乙醛脱氢酶2序列和酶切后的质粒pPIC9K的摩尔比2∶1混合，得到混合DNA，用T4连接酶连接；

按下述原料配比：

T4连接酶        1μL，

T4连接酶缓冲液  2μL，

混合DNA         7μL，

选取T4连接酶、T4连接酶缓冲液和混合DNA，在4℃连接过夜，得到连接产物(pPIC9K-ALDH2)；

连接产物(pPIC9K-ALDH2)转化大肠杆菌DH5α：将10μL上述连接产物(pPIC9K-ALDH2)与50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰上放置30min，然后在42℃热击1-2min；再放置在冰上冷却1-2min后加入500μL的LB培养基，37℃振荡培养1h；取100μL培养物涂布到含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜，得到大肠杆菌DH5α(pPIC9K-ALDH2)；

二)、菌株的构建和筛选：

1).质粒的线性化与电转导：

质粒的线性化：从大肠杆菌DH5α(pPIC9K-ALDH2)中提取质粒pPIC9K-ALDH2；采用内切酶Sac I(2U/μL)5μL、小牛血清白蛋白(1mg/mL)3μL、缓冲液10×BufferG 3μL、超纯水9μL和质粒pPIC9K-ALDH210μL，在37℃孵育过夜；再用酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，抽提线性化产物，然后用乙醇沉淀线性化产物，最后用10-20μL TE缓冲液溶解，得到线性化质粒溶液；

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115的电转导：首先取0.2mL巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115的一级种子液，接种到含50ml YPD培养基的300mL摇瓶中，使巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌体浓度生长至OD600＝1.3-1.5，后收集菌体，用5.0mL灭菌超纯水洗涤菌体5次，最后用0.1mL、4℃的1M山梨醇来悬浮细胞；然后取90μL山梨醇悬浮细胞与10μL线性化质粒溶液混合，转入4℃的1mm电转杯中，在电转仪1200V、5ms的条件进行电转，电转导样品涂布到MD培养基上，30℃培养2-3d，得到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株；

2).菌株的筛选：

从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株中挑选单菌落，进行诱导表达，首先采用SDS-PAGE电泳来剔除假阳性菌株；然后，再对阳性菌株进行再一次的诱导表达，检测方法改变为检测其上清液中的酶活，选取酶活最高的菌株的最佳菌株，即得到一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株。

本发明的有益效果是：本发明所得到的一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株可应用于解酒、保肝；具有解酒、保肝的效果。

附图说明

图1是质粒pUC57-ALDH2和质粒pPIC9K酶切回收片段图。泳道1、泳道2是质粒pUC57-ALDH2酶切回收图，泳道3是质粒pPIC9K酶切回收图。

图2是大肠杆菌DH5α感受态细胞转化质粒pPIC9K-ALDH2菌液PCR图。

具体实施方式

一、质粒pPIC9K-ALDH2的获得及其验证

1.目的序列设计与合成：

由Genebank上人ALDH2DNA(gene ID217)序列，删除UTR和信号肽并加上内切酶EcoR I和内切酶Not I酶切位点，再根据毕赤酵母密码子用法修改了28个碱基得到目的序列ALDH2；具体序列如下：

CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCAACCAGCAGCCCGAGGTCT  60

TCTGCAACCAGATTTTCATAAACAATGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAAACATTCC  120

CCACCGTCAATCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGAAGGGGACAAGGAAG  180

ATGTGGACAAGGCAGTGAAGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC  240

GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGAACAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG  300

ACAGAACCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT  360

ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCAAATGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA  420

AGTACCACGGGAAAACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACAAGGCATGAAC  480

CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGAATTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA  540

AGCTGGGCCCAGCCTTGGCAACTGGAAACGTGGTTGTGATGAAGGTAGCTGAGCAGACAC  600

CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG  660

TCAACATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG  720

TGGACAAAGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTAATCCAGGTTGCTGCTG  780

GGAGCAGCAACCTCAAGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCAACATCATCA  840

TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC  900

AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGAACCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT  960

TTGTGGAGCGAAGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGAACCCCTTTGATAGCA  1020

AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGAAGATCCTCGGCTACATCA  1080

ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTAAGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG  1140

GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCAAGG  1200

AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGAAGTTCAAGACCATAGAGGAGGTTGTTG  1260

GGAGAGCCAACAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACAAAGGATTTGGACA  1320

AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG  1380

TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG  1440

GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA  1500

AGAACTCAGCGGCCGA                                              1516

按上述目的序列ALDH2，用现有的重叠延伸法合成产人乙醛脱氢酶2序列(ALDH2)，用现有的常规方法将产人乙醛脱氢酶2(ALDH2)连接在质粒pUC57上，得到质粒pUC57-ALDH2；使用上海生工的高效制备感受态细胞试剂盒制备大肠杆菌DH5α感受态细胞；将10μL质粒pUC57-ALDH2与50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰上放置30min，然后在42℃热击1-2min；再放置在冰上冷却1-2min后加入500μL的LB培养基，37℃振荡培养1h；取100μL培养物涂布到含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜，得到的含有质粒pUC57-ALDH2的阳性转化子，保存备用；

2.质粒构建：

a.酶切

用酚氯仿或DNA提取试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司H1-1-3)从含有质粒pUC57-ALDH2的阳性转化子中提取质粒pUC57-ALDH2；准备质粒pPIC9K，并用内切酶EcoR I和内切酶Not I双酶切；

①按下述原料配比：

质粒pUC57-ALDH2            10μL，

缓冲液Wash Solution        3μL，

内切酶EcoR I(20U/μL)      1μL，

内切酶Not I(5U/μL)        3μL，

小牛血清白蛋白BSA(1mg/mL)  3μL，

蒸馏水                     10μL，

选取质粒pUC57-ALDH2、Wash Solution、内切酶EcoR I、内切酶Not I、小牛血清白蛋白和蒸馏水，在37℃酶切12h；电泳并用酚氯仿法或DNA提取试剂盒回收产人乙醛脱氢酶2序列(如图1，酶切验证回收的产人乙醛脱氢酶2序列为目的序列ALDH2)；

②按下述原料配比：

质粒pPIC9K                10μL，

缓冲液Wash Solution       3μL，

内切酶EcoR I(20U/μL)     1μL，

内切酶Not I(5U/μL)       3μL，

小牛血清白蛋白BSA(1mg/mL) 3μL，

蒸馏水                    10μL，

选取质粒pPIC9K、缓冲液Wash Solution、内切酶EcoR I、内切酶Not I、小牛血清白蛋白和蒸馏水，在37℃酶切12h；电泳并用酚氯仿法或DNA提取试剂盒回收酶切后的质粒pPIC9K(如图1)；

b.连接

按产人乙醛脱氢酶2序列和酶切后的质粒pPIC9K的摩尔比2∶1混合，得到混合DNA，用T4连接酶连接；

按下述原料配比：

T4连接酶       1μL，

T4连接酶缓冲液 2μL，

混合DNA        7μL，

选取T4连接酶、T4连接酶缓冲液和混合DNA，在4℃连接过夜，得到连接产物(pPIC9K-ALDH2)；

连接产物(pPIC9K-ALDH2)转化大肠杆菌DH5α：将10μL上述连接产物(pPIC9K-ALDH2)与50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰上放置30min，然后在42℃热击1-2min；再放置在冰上冷却1-2min后加入500μL的LB培养基，37℃振荡培养1h；取100μL培养物涂布到含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜，得到大肠杆菌DH5α(pPIC9K-ALDH2)。

3.验证：

挑取大肠杆菌DH5α(pPIC9K-ALDH2)，接种到1mL含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃150r/min振荡培养过夜，离心，离心条件：10000g离心1min，弃上清，挑取少量菌体悬浮于20μL蒸馏水中，沸煮10min，离心，离心条件：10000g离心1min，取4μL上清作模板，进行菌液PCR；PCR引物为5′AOX1(5’-gactggttccaattgacaagc-3’)和3′AOX1(5’-gcaaatggcattctgacatcctct-3’)；

PCR体系(20μL)：

模板              4μL，

上游引物(2mmol/L) 2μL，

下游引物(2mmol/L) 2μL，

10×buffer        2μL，

MgCl₂(25mmol/L)   1.5μL，

dNTPs(2mmol/L)    2μL，

Taq酶(5U/μL)     0.5μL，

蒸馏水            6μL；

混合后在PCR条件反应：

95℃3min，

72℃8min，

PCR产物琼脂糖电泳检测(错误！未找到引用源。)；菌液PCR阳性的进一步测序验证，大肠杆菌DH5α(pPIC9K-ALDH2)中ALDH2序列为前述的目的序列ALDH2。

按毕赤酵母偏好性设计人ALDH2的核酸序列与人ALDH2cDNA序列(NM_000690)比较：

Identity＝98.13％(1472/1500)Gap＝1.06％(16/1516)

二、菌株的构建和筛选：

1.质粒的线性化与电转导：

质粒的线性化：从大肠杆菌DH5α(pPIC9K-ALDH2)中提取质粒pPIC9K-ALDH2；采用内切酶Sac I(2U/μL)5μL、小牛血清白蛋白(1mg/ml)3μL、缓冲液10×BufferG 3μL、超纯水9μL和质粒pPIC9K-ALDH210μL，在37℃孵育过夜；再用酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，抽提线性化产物，然后用乙醇沉淀线性化产物，最后用10～20μLTE缓冲液溶解，得到线性化质粒溶液；

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115的电转导：首先取0.2mL巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115的一级种子液，接种到含50ml YPD培养基的300mL摇瓶中，使巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌体浓度生长至OD600＝1.3-1.5，后收集菌体，用5.0mL灭菌超纯水洗涤菌体5次，最后用0.1mL、4℃的1M山梨醇来悬浮细胞；然后取90μL山梨醇悬浮细胞与10μL线性化质粒溶液混合，转入4℃的1mm电转杯中，在电转仪1200V、5ms的条件进行电转，电转导样品涂布到MD培养基上，30℃培养2-3d，得到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris.)GS115-07ALDH2菌株；

2.菌株的筛选：

从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株中挑选单菌落，进行诱导表达，首先采用SDS-PAGE电泳来剔除假阳性菌株；然后，再对阳性菌株进行再一次的诱导表达，检测方法改变为检测其上清液中的酶活，选取酶活最高的菌株的最佳菌株，即得到一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株(即一株重组毕赤酵母菌株)。

三、一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株的鉴定：

1、上述步骤二得到的一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株(即一株重组毕赤酵母菌株)的形态特征与生理生化特性见表1。

表1检测结果：

表1中符号说明：“+”：90％以上的菌株为阳性，“-”：90％以上的菌株为阴性

表1说明该菌株的形态特征与生理生化特性与巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115(为华中农业大学生命科学技术学院赠送)一致。

2、上述步骤二得到的一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株的全细胞脂肪酸组份的鉴定，见表2。

检测结果：

Volume：DATA     File：E091124.00A        Samp Ctr：3    Idnumber：1932

Type：Samp       Bottle：2                Method：YEAST6

Created：1/12/200910:24:34AM

Sample ID：GS115

表2一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株的全细胞脂肪酸组份及其含量

  RT  Respo  n  Ar/  H  RFa  c  ECL  Peak Name  Percen  t  Comment1  Comment  2  1.819  41E+8  0.03  ---  6.994  SOLVENT PEAK  ＜min rt  2.111  2880  0.03  ---  7.519  ＜min rt  10.92  4  12401  0.04  0.90  15.82  0  16:1Cis9(w7)  9.75  ECL deviates  0.003  11.23  1  13054  0.04  0.89  15.99  9  16:0  10.22  ECL deviates  -0.001  Reference  -002  12.63  7  4147  0.04  0.88  16.79  4  17:1Cis9(w8)  3.20  ECL deviates  0.002  14.30  0  38599  0.04  0.87  17.72  5  18:2CIS9，12/18:0  a  29.49  ECL deviates  0.005  14.38  5  61981  0.05  0.87  17.77  3  Sum In Feature 8  47.34  ECL deviates  0.000  18:1CIS9(  w9)  ----  61981  ---  ---  ---  Summed Feature  8  47.34  18:1CIS9  (w9)  18:1(w8)

ECL Deviation：0.003      eference ECL Shift：0.002    Number  Reference Peaks：1

Total Response：130182    Total Named：130182

Percent Named：100.00％   Total amount：114616

表2说明该菌株的全细胞脂肪酸组份与巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115(为华中农业大学生命科学技术学院赠送)相似。

3、上述步骤二得到的一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株的18S Rrna基因序列如下：

ATGACCAAGTTTGTCCAAGTTCAGGCTCGCGCCCTCCCAAAGCCTCACTAAACCATTCA

ATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAGCGCGAGCTG

ATGACTCGCGCTTACTAGGAATTCCTCGTTGAAGCGCCTCTTGCAAAGCGCTATCCCCA

GCACGACGGAGTCTAAGATTCCCCGGCCATCTCTGGCAAGGACTCGCTGCCTCCGTCA

GTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACGTCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCGC

TTCCGCTGGCTTGCGCCAGTTGTCCTTCTAAGAAGATCCCCCAGCAATGCCAGGTAACC

TAGTTAAAAGCCAAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAA

CTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCACAAAATCAAGAAAGTGCTCTCATCCTGTCAAT

CCTCATTGTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCT

CCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCC

CCCCAGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGGGGAAGGCTATTCCCCGATC

CCTAGTCGGCATCGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCATCTTCGATCCCCTAA

CTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACGTCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTGG  

GGCGATCCAAGAATTTCACCTCTGACGCCCCAATACTGACGCCCCCGACCGTCCCTGTT

AATCATTACGCGGCCCCGAACCAACAAAAGAACCGTATCCTCTTCTGTTATTCCATGCTA

ATATATTCAACTACTGCCTTGAACACTCTAATTTCCTCAAAGTAACGTCCGTTCAACTAC

GAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGC

TGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGTATTTACGTTGTACTCATTCCA

ATTACAAGACCAAAGGCCCTGTATCGTTATTTATTGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATT

GGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTCTCTCAGGCTCCCTCT

CCGGAATCGAACCCTTATTCCCCGTTACCCGTAGAAACCATGGTAGGCCTCTATCCTACC

ATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCCTAAGATTCGAAAAGTTATTAT

GAATCACCAAAACGAAGGTTTTATCTAATAAATACGCCCGAGGGCTGATCAAGTATTAG

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该菌株的18S rRNA基因序列与巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115的18S rRNA基因序列完全相同。

以上三方面检测结果说明，检测菌株为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。命名为一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株(即为一株重组毕赤酵母菌株)，已于2009年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCCN0：M208266。

四、一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株应用：

将一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株在BMGY培养基中培养24h，再收集菌体转入到BMMY培养基中诱导表达60h，离心(6000转/分)5分钟，取上清液加入质量浓度为250g/L的聚乙二醇PEG8000沉淀上清液中的人乙醛脱氢酶2，然后加入和上清液等体积的蒸馏水，溶解人乙醛脱氢酶2，得到含人乙醛脱氢酶2的酶液，最后采用壳聚糖来进行固定，

固定具体过程如下：

①取3.00g壳聚糖(脱乙酰度＞90％)，加入蒸馏水100mL，磁力搅拌10min，充分混匀；再加入1mL冰醋酸，磁力搅拌2h，得到壳聚糖胶液；

②在磁力搅拌的情况下，向上述50mL壳聚糖胶液中，加入10mL含人乙醛脱氢酶2的酶液(浓度为100mg/mL)，搅拌均匀后，再加入质量浓度为20mg/mL的焦磷酸钠溶液50mL，搅拌10min，静置固定化3h；得到初始固定化酶，用蒸馏水将多余的焦磷酸钠洗掉，得到固定化酶样品；

③将上述固定化酶样品用冷冻干燥机干燥，在-50℃下干燥48h至干燥完全，得到固定化酶(产品)。

所述的BMGY培养基：1％(质量含量)酵母膏，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱YNB(含硫酸铵，不含氨基酸)，4×10^-5％生物素，1％甘油，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH为6.0)；余量为蒸馏水。

所述的BMMY培养基：1％酵母膏，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱YNB(含硫酸铵，不含氨基酸)，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH为6.0)，余量为蒸馏水。

五、毕赤酵母基因表达产物乙醛脱氢酶的动物学检验：

将人乙醛脱氢酶2进行固定化处理，得到的样品来检验解救小鼠急性酒精中毒的能力。

1、人乙醛脱氢酶2固定化处理：

动物的胃液pH值很低，而ALDH2极易分解，故用壳聚糖进行固定化处理后再进行小鼠灌胃实验。具体过程如下：

①取3.00g壳聚糖(脱乙酰度＞90％)，加入蒸馏水100mL，磁力搅拌10min，充分混匀；再加入1mL冰醋酸，磁力搅拌2h，得到壳聚糖胶液；

②在磁力搅拌的情况下，向上述50mL壳聚糖胶液中，加入10mL含人乙醛脱氢酶2的酶液(100mg/mL)，搅拌均匀后，再加入质量浓度为20mg/mL的焦磷酸钠溶液50mL，搅拌10min，静置固定化3h；之后得到初始固定化酶，用蒸馏水将多余的焦磷酸钠洗掉，得到固定化酶样品；

③将上述固定化酶样品用冷冻干燥机干燥，在-50℃下干燥48h至干燥完全，固定化所得酶制剂置4℃保存。小数灌胃前取4g酶制剂加入到10mL 1％CMC中制成悬浊液备用[因为固定化酶(产品)是固态，不方便喂养小鼠，所以将固定化酶(产品)做成悬浊液为方便喂养，所以后面所涉及到喂食的固定化酶(产品)都为这种悬浊液，取名为“固定化酶悬浊液”]。

2、醉酒剂量实验：

30只小鼠随机分为3组，每组10只。实验前禁食12h，不禁水。实验时各组小鼠分别按14mL/kg、16mL/kg、18mL/kg的剂量灌胃56°二锅头，观察12h。记录小鼠醉酒时间与醒酒时间以及醉酒率和死亡率。小鼠醉酒的判断标准是：小鼠取背向位放入盒子中。若小鼠背向下的姿势可保持30s以上，则认为翻正反射消失，即为醉酒。剂量实验结果如表3；

表3不同给酒剂量小鼠急性酒精中毒实验结果

3、醉酒预防实验：

将40只小鼠(雌雄各半)预养3d，分成模型组、服用固定化酶悬浊液组。每组10只，各组小鼠实验前禁食12h，不禁水。模型组每只按20mL/kg的灌胃量灌注浓度为1％的CMC，其余三组每组每只按20mL/kg的灌胃量灌注相应的固定化酶悬浊液。30min后各组小鼠均按16mL/kg灌胃56°二锅头，记录给白酒时刻、各组醉酒动物翻正反射消失时刻、翻正反射恢复时刻，进一步计算：睡眠时间(小鼠翻正反射消失至翻正反射恢复的时间)，醉酒时间＝翻正反射消失时刻-给酒时刻，醒酒时间亦即睡眠时间。

4、醉酒治疗实验：

小鼠数目，分组及实验方法同前面醉酒预防实验，将灌酒和灌酶液的先后次序对调，改为灌酒30min后再喂固定化酶悬浊液。记录给酒后，小鼠的醉酒时间和醒酒时间。结果如表；

表4小鼠的醉酒时间和醒酒时间

由结果由表4可知，治疗实验和预防实验结果基本是一致的。喂了固定化酶悬浊液[即固定化酶(产品)]的小鼠的醒酒时间，与对照组相比，均有不同程度的缩短。此外，在灌酒之前用固定化酶悬浊液[即固定化酶(产品)]灌胃可以延缓小鼠的醉酒。说明固定化酶悬浊液[即固定化酶(产品)]有显著的解酒效果。

所选用醉酒时间是表示：小鼠从喝酒到已经醉酒的时间，如果这个时间段越长，说明吃了本发明的固定化酶悬浊液后，小鼠可以有效的延长他们的醉倒。

5、小鼠体内转氨酶的检测：

小鼠30只，随机分为：空白组、模型组、服用固定化酶悬浊液[即固定化酶(产品)]组共3组。每组10只，各组小鼠先禁食12h，不禁水。空白组不喂任何物质，模型组每只按20ml/kg的灌胃量灌注浓度为1％的CMC，其余三个实验组每组每只按20mL/kg的灌胃量灌注相应的酶液。30min后除空白组外其余各组小鼠均按16mL/kg灌胃56°二锅头。300min后所有组的小鼠均断头取血，并解剖取小鼠肝脏。用千分之一天平准确称取小鼠肝脏，按重量体积比加99倍生理盐水制成1％匀浆，3500r/min离心10分钟，取上清待测。按照试剂盒说明书测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶。自断头取血后获得的血液样品制备血清，按照试剂盒说明书进行谷丙转氨酶、谷草转氨酶的测定。结果如表5。

表5血液和肝脏中转氨酶活力测定结果

转氨酶检测结果可以看出固定化酶悬浊液[即固定化酶(产品)]组显著低于模型组(模型组是每只按20mL/kg的灌胃量灌注浓度为1％的CMC，因为本发明的酶是悬浊在1％的CMC里，需要检测防醉酒到底是1％的CMC在起作用，还是本发明的酶在起作用，所以设这一个模型组来证明不是1％的CMC在起作用)，且不同程度地高于空白组。三个实验组之间有明显差别，结果表明固定化酶悬浊液[即固定化酶(产品)]对小鼠的肝脏起到了明显的保护作用。