用于预防和治疗牙周炎的包含熟地黄、三七或其混合物提取物作为有效组分的组合物

摘要

本发明公开了用于治疗和预防牙周病的药物组合物，所述药物组合物包含来自熟地黄(Rehmanniae Radix Preparata)、三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)或其混合物的提取物作为活性成分。由于具有保护牙槽骨和促进牙周膜细胞增殖以及抑制TNF－α释放的活性，所述提取物可用于制备可用于治疗和预防牙周病的药物组合物或保健食品组合物。

说明书

【技术领域】

本发明涉及用于预防和治疗牙周炎的组合物，所述组合物包含来自熟地黄(Rehmanniae Radix Preparata)、三七(Notoginseng Radix)或其混合物的提取物作为活性成分。

【背景技术】

牙周组织可以分成牙槽骨、牙龈和牙周膜。牙龈是支撑牙齿的结构，可能会患牙龈炎。当炎症在牙齿的支撑结构上扩展以破坏牙周膜(牙周膜将牙齿的牙骨质连接到牙槽骨上并将牙齿的根部覆盖到骨内)和牙槽骨(牙槽骨形成牙齿周围的牙槽)时，就导致牙周炎。

牙周病包括牙龈炎和牙周炎，指由细菌引起的牙齿支撑结构的炎症，其伴有出血、牙周袋的形成和牙槽骨的破坏，导致牙齿缺失。在形成细菌菌落、细菌浸润牙周组织和破坏牙周组织的过程中产生这种牙周炎。详细来讲，在口腔卫生差的条件下形成的细菌生物被膜可以引起牙龈炎症并伴有出血和口臭。这种口腔状态的进展在牙齿和牙龈之间产生间隙，形成了牙周袋，后来细菌在其中增殖并爆发牙周炎。在恶化时，牙周炎使得牙龈即使在微弱刺激如刷牙时也会出血，并常常产生急性炎症并伴有疼痛的发生。这种炎症降低了成骨功能并提高了骨质吸收，减少了牙槽骨，导致牙齿缺失。

牙周炎有许多原因。局部来讲，当牙斑和牙石在牙周袋内积聚时，它充当了附近厌氧性革兰氏阴性菌的生长环境，这些厌氧性革兰氏阴性菌增殖到牙周袋的深部核。增殖的厌氧性革兰氏阴性菌的毒素和产物直接破坏牙周组织，或刺激免疫系统，免疫系统然后诱导牙周组织的破坏，并伴有炎症。对于对抗破坏的防御机理，多核白细胞和免疫应答充当了全身因素。

由于厌氧性革兰氏菌的代谢，分泌出对牙周组织有毒的细菌毒素硫化氢、氨和胺，同时构成细胞壁的内毒素脂多糖直接破坏牙周组织或刺激免疫系统。受刺激的体液免疫和细胞免疫的各种作用诱导活性氧、前列腺素、白三烯、组胺和细胞因子如白介素的胞外分泌，导致牙周炎症。而且，由细菌和白细胞分泌的胶原酶消化胶原，即牙周组织的基质，引起牙龈退化，导致牙周病。

因此，预防和治疗牙周病关键是杀灭或抑制厌氧性革兰氏阴性菌，除去来自细菌的毒性产物，或恢复退化的牙周组织。

为了治疗牙周病，已经使用了改善口腔卫生、或者非外科或外科疗法，包括牙周再生如刮治、根面平整术、牙龈刮治术和新附着(new attachment)。然而，这些外科疗法需要患者前往牙科诊所。此外，对于牙周病已经进展到一定程度的情况(在大多数情况下，进展到慢性状态)下，使用外科疗法来治疗，而不是预防它们，同时全身施用抗生素或局部施用缓释药剂。可能向不必要的部位递送太大量的药物而不能避免其副作用。事实上，据报道，已经分离了耐受抗生素的牙周炎细菌。

因此，需要用于预防和治疗牙周病的具有重建破坏的或缺失的牙周组织的活性的药剂或组合物。

根据Melcher，牙周再生的结果随着参与牙周再生的细胞的来源而变化。例如，所述结果包括当源自骨的细胞参与再生时的骨整合、当源自结缔组织的细胞(例如牙龈成纤维细胞)参与再生时的牙根吸收、和当源自上皮组织的细胞参与再生时的长附着上皮的产生。然而，这些结果不同于理想的牙周组织再生。相反，在源自牙周膜细胞的细胞参与再生时可以诱导理想的牙周组织再生(Melcher A.H.Journal of Periodontology，47(5)；256-260，1976)。

简言之，对牙周组织的再生理想的是促进牙周膜细胞的生长，而不影响牙龈成纤维细胞的生长。

基于以下事实，即当CD4⁺T细胞(它们诱导由免疫系统在受到细菌毒素的刺激后分泌的各类细胞因子(TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、IL-2、IL-6)的分泌)活化时，它们在其表面上表达骨保护素配体以促进破骨细胞生成，从而在骨的破坏中具有关键作用，所以在本发明人看来，治疗牙周病需要抑制细胞因子释放以预防炎症和牙槽骨的破坏(Kong Y.Y.等人，Nature 402，304-309，1999)，促进成骨细胞的增殖和分化，减少破骨细胞的形成和活性以保护牙槽骨，并有效地增加牙周膜细胞的增殖而不影响牙龈成纤维细胞的增殖。

本发明人对熟地黄、三七的各种生理学活性进行了深入彻底的研究，发现来自熟地黄、三七或其混合物的提取物具有抑制负责炎症的细胞因子的释放以预防炎症、促进成骨细胞的增殖和分化并减少破骨细胞的形成和活性以保护牙槽骨、并有效地提高牙周膜细胞的增殖而不影响牙龈成纤维细胞的增殖的功能，因此能够用于预防和治疗牙周病，从而产生本发明。

【发明内容】

【技术问题】

因此，本发明的目的是提供用于治疗和预防牙周病的组合物，所述组合物包含来自熟地黄和三七的各自提取物的混合物作为用于抑制导致牙周病的炎症、促进成骨细胞的增殖和分化、减少破骨细胞的形成和活性以预防牙槽骨的破坏、和刺激牙周膜细胞的增殖的活性成分。

【技术方案】

为了实现上述目的，本发明提供了用于治疗和预防牙周病的药物组合物，所述药物组合物包含来自熟地黄和三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)的各自提取物中的一种、所述各自提取物的混合物、或来自熟地黄和三七的混合物的提取物作为活性成分。

而且，本发明提供了用于治疗和预防牙周病的保健食品组合物，所述保健食品组合物包含来自熟地黄和三七的各自提取物中的一种、所述各自提取物的混合物、或来自熟地黄和三七的混合物的提取物作为活性成分。

【有益效果】

由于具有保护牙槽骨和促进牙周膜细胞增殖以及抑制TNF-α释放的活性，本发明的提取物可用于治疗和预防牙周病。

【附图描述】

图1显示本发明的提取物根据所述提取物的混合比对TNF-α释放的抑制效果。

图2显示本发明的草药混合物提取物对TNF-α释放的抑制效果。

图3显示本发明的提取物根据所述提取物的混合比对成骨细胞增殖的影响。

图4显示本发明的提取物根据所述提取物的混合比对成骨细胞中骨保护素(OPG)表达的影响。

图5显示本发明的草药混合物提取物对成骨细胞中OPG表达的影响。

图6显示本发明的提取物根据所述提取物的混合比对破骨细胞形成的影响。

图7显示本发明的草药混合物提取物对破骨细胞形成的影响。

图8显示本发明的提取物根据所述提取物的混合比对破骨细胞活性的影响。

图9显示本发明的草药混合物提取物对破骨细胞活性的影响。

图10显示本发明的提取物根据所述提取物的混合比对人牙龈成纤维细胞增殖的影响。

图11显示本发明的草药混合物提取物对人牙龈成纤维细胞增殖的影响。

图12显示本发明的提取物根据所述提取物的混合比对人牙周膜细胞增殖的影响。

图13提供组织化学照片，其显示本发明的草药混合物提取物对患有牙周炎的大鼠的骨丢失的抑制效果(AC和CEJ分别表示牙槽骨嵴和釉质牙骨质界)。

图14显示本发明的草药混合物提取物对患有牙周炎的大鼠的骨丢失的抑制效果。

【最佳实施方式】

下面，将详细描述本发明的实施方案。

本发明涉及用于治疗和预防牙周病的组合物，所述组合物包含来自熟地黄和三七的提取物的混合物。

根据本发明，将1∶8熟地黄∶三七的混合物用热水提取三次，将溶液过滤并在40℃以下的真空中浓缩，得到可用于预防和治疗牙周病的提取物混合物。

熟地黄是属于玄参科的草药，在中医学中，它的新鲜或干燥的根被用作药材。特别是，在经过九轮蒸和干燥后获得的根具有优秀的医学功效。熟地黄性温，味甘苦，可以养血补精。因此，在中医学中，熟地黄用于治疗腰膝疼痛、痛经和眩晕。而且，已知它们能预防头发脱色。熟地黄是四物汤的主要成分。它用于治疗体弱所致的发热、咽干和口渴。在韩国民间疗法中，将熟地黄与猪肉汤同食以治疗慢性便秘。

三七是属于人参科的多年生草药，比人参小，有七片叶子，广泛种植于中国南部。其根形似小梭。三七还称为三七人参，因为它在三个茎上长有7片叶子，貌似人参。其根中皂苷的含量为3-8％，包含大量的人参皂苷Rb1、Rg1和Re以及三七皂苷R1、R2、Fa和Fc，少量的人参皂苷R2、b2、d、e和c，以及痕量的人参皂苷R0。其精油数量少于人参并包含齐墩果酸。三七根在中医学中用于止血和作为强心药，在动物实验中测定时，发现还具有增加通过心脏动脉的血流、降低心肌耗氧量以及减少血液中的脂质和胆固醇水平的功能。三七具有优秀的抗炎、镇痛和止血活性，因此还不仅能用于治疗炎性疾病包括肝炎，而且能通过直接施用到伤口上或口服给药来治疗外出血或内出血。

可以通过常规方法如冷沉淀、热沉淀、加热等制备来自熟地黄、三七或其混合物的提取物。优选地，用水、醇或其混合物处理熟地黄、三七或其混合物。每重量份的熟地黄优选使用8重量份的三七。所述醇优选为甲醇或乙醇。更优选地，将熟地黄、三七或其混合物在70-80℃的甲醇或乙醇中浸泡3-5小时。重复该程序可以提高提取效率。可以在20-40℃的条件下在真空中进行浓缩，但不限于此。对于来自熟地黄或三七的个体提取物，可以按照1-16∶16-1的重量比将它们相互混合。

已知为与牙周病相关的骨丢失、炎症和结缔组织破坏负责的主要细胞因子是白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子(D.T.Graves和D.Cochran，Thecontribution of Interleukin-1 and Tumor Necrosis Factor to Periodontal TissueDestruction，Journal of Periodontology，74(3)：391-401，2003)。

试验了本发明的提取物对肿瘤坏死因子-α(下文称为“TNF-α”)的分泌的影响。在这方面上，用脂多糖(LPS)和本发明的提取物处理人单核细胞系THP-1，然后通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析细胞培养基中TNF-α的水平。结果，发现在用0.1mg/ml的本发明提取物处理后，TNF-α的分泌明显受到抑制(图1和2)。因此，本发明的提取物可以用作对抗TNF-α分泌的抑制剂。

已知牙槽骨的骨发生随着OPG分泌的增加而增加(M.A.Taubman，P.Valverde，X.Han和T.Kawai，Immune Response：The Key to Bone Resorptionin Periodontal Disease，Journal of Periodontology，76(11Suppl)：2033-41，2005)。

当用本发明的提取物处理成骨细胞时，它们的增殖随着提取物浓度的上升而增加(图3)。而且，当用本发明的提取物处理人骨肉瘤MG-63时，其以剂量依赖性方式分泌OPG(图4和5)。

破骨细胞由骨髓中的单核细胞/巨噬细胞祖细胞产生，单核细胞祖细胞通过血液循环，在骨内膜层中增殖并彼此融合以形成多核细胞(Scheven，B.A.A.等人，Nature，321：79-81，1986)。破骨细胞的特征在于它们表达耐酒石酸的酸性磷酯酶(TRAP)，该酶通常被用作组织化学酶来分辨破骨细胞和其它骨组织细胞(Minkin，C.，Calcif.Tissue Int.，34：285-290，1982)。

用本发明的提取物处理可假定的破骨细胞TRAP(+)多核细胞导致随着提取物浓度的上升极大地抑制TRAP(+)多核细胞的形成和破骨细胞的活性。特别是，熟地黄和三七的混合物提取物对TRAP(+)多核细胞的形成和破骨细胞的活性具有明显的抑制效果(图6-9)。

总结起来，所述结果表明，本发明的提取物具有抑制TNF-α的分泌、促进OPG的分泌和成骨细胞的增殖、以及抑制可假定的破骨细胞TRAP(+)多核细胞的形成和破骨细胞的活性的功能。因此，本发明的提取物可以用于预防和治疗牙周病，例如牙龈炎和牙周炎。

除了所述活性成分，本发明用于治疗和预防牙周病的药物组合物还可以包含至少一种药学可接受的载体。药学可接受的载体的例子包括盐水溶液、无菌水、林格氏液、缓冲盐水溶液、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、丙三醇、乙醇和它们中的两种或更多种的混合物。如果必要，所述组合物还可以包含其它常规添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。而且，所述组合物还可以包含稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，以便配制成注射剂型如水溶液剂、混悬剂和乳剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。另外，可以优选根据其成分或目的，使用本领域已知的合适方法，如Remington′s Pharmaceutical Science(最新版)，Mack Publishing Company，Easton PA中所述的方法配制所述组合物。

本发明的药物组合物的给药途径没有特别限制，但根据预期用途，所述组合物可以口服或通过胃肠外途径如静脉内、皮下、腹膜内或局部给药。对于任何特定患者的具体治疗有效剂量水平可以根据各种因素，包括患者的体重、年龄、性别、一般健康状况和饮食、给药时间、给药途径、所述组合物的排泄速率以及疾病的严重性而变化。所述组合物可以约0.1～1000mg/kg、优选0.1～500mg/k的每日剂量给药。每日剂量可以单剂量或几个分剂量给予。

为了有效地治疗和预防牙周病，可以优选将所述药物组合物配制成口服制剂。所述口服制剂没有特别限制，但可以是常规形式。所述口服制剂的例子包括牙膏、嗽口水和口腔清洗剂。根据剂型，所述口服制剂可以包含配制它们所必需的各种基质成分和添加剂。所述成分和添加剂的种类和量可以由本领域技术人员容易地选择。例如，当所述口服制剂为牙膏时，它可以包含研磨剂、润湿剂、起泡剂、粘合剂、甜味剂、pH调节剂、防腐剂、医学上有效的成分、漂白剂、着色剂、溶剂等。

本发明还提供了用于预防和治疗牙周病的保健食品组合物，所述保健食品组合物包含来自熟地黄、三七或其混合物的提取物。

可以通过常规方法如冷沉淀、热沉淀、加热等制备来自熟地黄、三七或其混合物的提取物。优选地，用水、醇或其混合物处理熟地黄、三七或其混合物。每重量份的熟地黄优选使用8重量份的三七。所述醇优选为甲醇或乙醇。更优选地，将熟地黄、三七或其混合物在70-80℃的甲醇或乙醇中浸泡3-5小时。重复该程序可以提高提取效率。可以在20-40℃的条件下在真空中进行浓缩，但不限于此。对于来自熟地黄或三七的个体提取物，可以按照1-16∶16-1的重量比将它们相互混合。

为了缓解牙周病，可以将本发明的提取物添加到保健食品中。作为食品添加剂，所述草药混合物提取物可以根据常规方法适当地单独或与其它食品成分组合使用。所述草药混合物提取物的量可以根据其目的(预防、改善健康或治疗性治疗)而变化。通常，当用于制备食品或饮料时，以材料重量计，本发明的提取物可以100wt％以下、优选50wt％以下的量添加。在将所述提取物用于设计成习惯性使用的保健食品中的情况下，其含量可以低于上述范围。然而，所述提取物对身体没有安全性问题，因此可以超过所述范围的量使用。

对于可以使用所述提取物的食品的种类没有特别限制。所述食品的例子包括肉、香肠、面包、巧克力、糖果、快餐、糖食、比萨、拉面(ramen)、面条、奶制品、汤、饮料、饮品、酒精性饮料、维生素片等，并且不限于此。所有通常接受的保健食品都可以包含本发明的提取物。

像目前可用的茶一样，本发明的保健食品组合物还可以包含各种香料或天然碳水化合物。这些天然碳水化合物的例子包括单糖如葡萄糖和果糖、二糖如麦芽糖和蔗糖、多糖如糊精和环糊精、以及糖醇如木糖醇、山梨糖醇和赤藓醇。而且，可以将甜味剂例如天然甜味剂比如祝马丁(thaumatin)和甜叶菊提取物或合成甜味剂如糖精和阿司帕坦添加到使用本发明提取物的保健食品中。以100ml本发明的组合物计，所述天然碳水化合物可以约0.1～20g、优选约1～10g的量使用。此外，本发明的组合物可以包含各种养分、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(flavor)、着色剂、果胶酸或其盐、藻酸或其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、抗菌剂、甘油、醇类和用于碳酸饮料的碳酸化剂。而且，本发明的组合物可以包含果肉用于制备天然果汁、水果饮料和蔬菜饮料。这些成分可以单独或组合使用。这些添加剂的比率不重要，但通常在0.05～50重量份/100重量份的本发明组合物的范围内选择。

【实施例】

通过下列实施例可以更好地理解本发明，给出所述实施方案是为了说明，而不应该解释为限制本发明。

实施例1：从熟地黄和三七中制备草药混合物提取物

实施例1-1：用水从熟地黄和三七中制备草药混合物提取物

从草药店里购买熟地黄和三七。在检查草药三七和熟地黄的杂质后，只选择干净的草药用于下列实验。将三七切碎，并将熟地黄切成1～2cm大小的片。将200g 8∶1熟地黄∶三七的混合物放到3L的烧瓶中，然后在流动条件下，在100℃用2000ml蒸馏水提取三轮，共8小时。合并后，将所得溶液过滤并使用蒸发器在40℃以下，在真空中浓缩成500ml的体积。离心(3000rpm，20min)，然后将上清液冻干成粉末，用于实验(收率62％)。

实施例1-2：用乙醇从熟地黄和三七中制备草药混合物提取物

实施与实施例1-1相同的程序，除了用乙醇代替水。

实施例1-3：用75％乙醇从熟地黄和三七中制备草药混合物提取物

实施与实施例1-1相同的程序，除了用25％水和75％乙醇的混合物代替水。

实施例2：从三七中制备提取物

将100g三七磨成细粉并放到，或将其粉末放到2L的提取器中，并添加10重量份的蒸馏水，然后在95～100℃热提取8小时。将所得溶液通过吸滤器过滤，离心(3000rpm，20min)。在过滤上清液后，使用真空蒸发器在40℃将滤液浓缩，并冻干成粉，用于实验(收率33％)。

实施例3：从熟地黄中制备提取物

将100g熟地黄放到2L的提取器中并添加10重量份的蒸馏水，然后在95～100℃热提取8小时。将所得溶液通过吸滤器过滤，使用真空蒸发器在40℃将滤液浓缩，并保存在冰箱中直到使用(收率45％)。

实验例1：TNF-α分泌的抑制

评价了本发明的提取物对抗人单核细胞系THP-1释放TNF-α的抑制活性。

人单核细胞系THP-1(ATCC No.TIB-202)购自ATCC(Rockville，USA)，并且在用于实验前培养在补充有10％FBS(胎牛血清)的RPMI 1640培养基(Gibco BRL，USA)中。将细胞以5×10⁵个细胞/ml的密度置于96孔板中并用LPS刺激以分泌TNF-α。

对于实验组，将来自熟地黄和三七的各自提取物以0～1.6mg/ml的量组合并与LPS一起添加。或者，用0～1.6mg/ml混合物提取物和LPS一起处理实验组。在处理24小时后，使用ELISA分析培养基的TNF-α水平，并将结果总结于图1和2以及表1。

表1

  三七(mg/ml)熟地黄(mg/ml)  0  0.1  0.2  0.4  0.8  1.60  107.93±1.58  94.16±2.32  81.89±4.14  71.26±3.44  55.39±0.40  45.21±1.820.198.35±6.0383.23±3.14  70.36±3.5463.47±3.5860.48±6.5946.56±6.140.2  93.41±1.44  79.64±2.87  70.96±1.44  60.33±3.48  52.25±2.60  42.96±1.430.4  111.09±3.78  107.09±5.73  93.22±2.14  91.22±3.75  68.10±3.13  55.16±1.260.8  100.77±3.15  92.60±3.93  77.97±1.34  81.66±4.84  57.47±1.47  48.07±0.711.6  103.85±1.08  87.67±4.75  85.05±3.95  69.49±2.07  61.79±5.63  47.92±0.82

在图1和表1中看到，观察到与对照相比，用0～1.6mg/ml熟地黄和三七的各自提取物的各种组合处理的细胞以剂量依赖性的方式明显抑制了TNF-α释放。

而且，在图2中看到，发现用本发明的草药混合物提取物处理，与没有用其处理的对照相比，以剂量依赖性的方式明显抑制了TNF-α的分泌。

因此，本发明的提取物有效地抑制TNF-α的分泌。

实验例2：测定成骨细胞增殖

分析本发明的提取物对成骨细胞增殖的影响。

鼠颅盖MC3T3-E1(ATCC No.CRL-2593)细胞购自ATCC(Rockville，USA)并且培养在补充有10％FBS(胎牛血清)的DMEM(Gibco BRL，USA)中，用作成骨细胞。

将成骨细胞以20000个细胞/孔的密度涂到24孔板中并在5％CO₂培养箱中培养48小时。然后，用添加有0～1.6mg/ml来自熟地黄和三七的各自提取物的组合的新鲜介质代替培养基，然后再培养48小时。在吸掉培养基后，用胰蛋白酶-EDTA处理细胞并用血细胞计数器计数。将结果制成图3。

在图3中看到，观察到用本发明的提取物处理使细胞的增殖提高了高达20％(按浓度计)。观察到与对照相比，用0～1.6mg/ml来自熟地黄和三七的各自提取物的各种组合处理的细胞增加了细胞数目。

实验例3：测定OPG(骨保护素)的表达

将人骨肉瘤MG-63细胞(ATCC No.CRL-1427)在60mm组织培养皿中培养到融合，并在包含0～1.6mg/ml来自熟地黄和三七的各自提取物的各种组合或者0～1.6mg/ml草药混合物提取物的2ml DMEM中温育24小时。其后，使用OPG-ELISA试剂盒(Oscotec Inc.)分析培养基的OPG水平。结果示于图4和5。

在图4中看到，观察到与各自的提取物相比，当用0.1～1.6mg/ml来自熟地黄和三七的草药混合物提取物处理细胞时，进一步促进了成骨细胞中OPG(抑制破骨细胞形成的蛋白)的表达。与用个体提取物处理的组相比，用草药混合物提取物处理的组的OPG表达水平以剂量依赖性的方式增加了高达300％。

而且，在图5中看到，发现与对照相比，用来自熟地黄和三七的混合物提取物处理明显提高了OPG的表达。

实验例4：抑制TRAP(+)多核细胞的形成

在通过脱颈处死7～9周大的雄性小鼠后，无菌切除股骨和胫骨并清除软组织。然后，在相对端切开髂骨，并通过用26号针头将包含0.1％胶原酶(Gibco)、0.05％胰蛋白酶和0.5mM EDTA(Gibco)的1ml酶溶液注射到一端的骨髓腔中来抽取骨髓。通过将骨髓搅拌30分钟来获得骨髓细胞，并将其在补充有10％FBS的α-MEM中预培养24小时以获得非粘附细胞，即破骨细胞祖细胞。将它们以2×10⁵个细胞/孔的密度涂板并培养。

将培养的细胞中的粘附细胞用PBS洗涤并用柠檬酸盐-乙酸盐-甲醛固定5分钟，然后通过在37℃下在包含萘酚AS-BI磷酸盐缓冲液、Fast GarnetGBC缓冲液和7mM酒石酸盐缓冲液(pH 5)的乙酸盐缓冲液(pH 5.0)中温育1小时，来进行TRAP染色。将具有三个以上细胞核的TRAP(+)多核细胞认为是破骨细胞。

为了诱导破骨细胞分化，利用其中存在破骨细胞祖细胞的骨髓。将TRAP阳性多核细胞认为是破骨细胞，然后将其在0～1.6mg/ml个体草药提取物或0～1.6mg/ml草药混合物提取物的存在下培养，然后监测TRAP-阳性多核细胞的计数。结果制成图6和7。在图6和7中看到，观察到用本发明提取物处理的组的TRAP(+)多核细胞计数明显下降。从这些结果中证实，本发明的提取物可用于抑制破骨细胞的形成。

实验例5：抑制破骨细胞活性

为了监测破骨细胞的生长和活性，在涂布碳磷酸钙(carbonated calciumphosphate)的板(OAAS，OCT Inc.)中培养破骨细胞祖细胞，观察破骨细胞标记TRAP的活性和吸收。

从实验例4分离和培养的破骨细胞祖细胞中除去培养基。用蒸馏水洗涤OAAS板以除去粘附细胞，在5％次氯酸钠溶液中温育5分钟，然后用蒸馏水洗涤，再使用Image Pro plus观察吸收区域。也就是说，为了检验负责骨组织中的骨吸收的破骨细胞的活性，在本发明提取物的存在下，将破骨细胞祖细胞培养在涂布有钙和磷酸盐的板中，所述板被设计以制造类似于骨组织的矿物质部分的条件。监测吸收面积的改变，并将结果示于图8和9。

在图8和9中看到，观察到通过用于培养破骨细胞祖细胞的涂有钙-磷酸盐的板进行测定，本发明的提取物明显抑制了破骨细胞的活性和吸收。

实验例6：对牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞的增殖的影响

测定本发明的提取物对人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞的增殖的影响。

用刮匙对为了正牙而从健康人中拔出的前磨牙的牙周膜进行无菌刮擦并置于培养皿中，然后在补充有10％FBS(胎牛血清)的DMEM(Gibco BRL，USA)中培养。分离拔出的前磨牙的部分牙龈并以相同的方式培养，获得牙龈成纤维细胞。在培养物生长过程中，用显微镜检查细胞从外植体的外生长。在形成细胞集落后，从中取出各自的组织样本，使其单层生长，并进行传代培养直到用于实验。将人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞各自以20000个细胞/孔的密度涂到24孔板上并在5％CO₂培养箱中培养48小时，然后用0～1.6mg/ml个体提取物或0～1.6mg/ml混合物提取物处理细胞，另外再培养48小时。在除去培养基后，添加胰蛋白酶-EDTA并用血细胞计数器将细胞计数。结果制成图10、11和12。

在图10和11中看到，观察到在用草药混合物提取物处理后，牙龈成纤维细胞的增殖水平与用个体提取物处理后一样低或者更低。

在图12中看到，与用来自熟地黄或三七的个体提取物处理相比，用草药混合物提取物处理后，牙周膜细胞的增殖进一步提升了高达40％。

因此，本发明的提取物能有效促进在牙周组织的再生中起关键作用的牙周膜细胞的增殖，而不明显影响牙龈成纤维细胞的增殖。

实验例7：对患有牙周病的动物模型的治疗功效

牙周病是由复杂因素引起的慢性疾病。其中，最重要的因素是细菌。牙齿表面附着有细菌生物膜，它是微生物与唾液蛋白和食物的复杂聚集体。患有牙周病的患者大多数在免疫防御细胞的功能上有缺陷，不能抵御来自细胞的各种产物并且遭受严重的组织破坏的痛苦。

在实验性大鼠模型中，将丝线拴到牙齿上，以在牙齿上自然产生牙斑和牙石，然后引起炎症，导致牙槽骨吸收。

用结扎线绑住大鼠磨牙以诱导牙周病，向大鼠给药本发明的提取物。切除包括牙齿的上颌骨并观察，检验所述提取物对牙周病的预防和治疗效果。

在通过腹部注射氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)的混合物将大鼠全身麻醉后，用结扎丝线(4/0)绑住下颌的第二磨牙以诱导牙周病。

在同样的4周时间内，假手术组和阴性对照口服给予固体食物和5ml/kg水，而实验组还口服给药本发明的提取物(100mg/kg)。

在完成口服给药后，从用CO₂麻醉的大鼠切除下颌骨并用布安液固定2小时。然后，用5％硝酸将它脱钙72小时，除去包括钙的矿物质，将组织软化到适合组织切片的程度。随后，用流动水将牙齿洗涤12小时并按顺序用70％、80％、90％和100％的醇脱水三次，每个浓度2小时，然后换成二甲苯脱水三轮，每轮2小时。通过用液体石蜡处理三轮，每轮2小时，将样品包埋到石蜡中。

在形成石蜡块后，通过用轮转切片机将石蜡块切成5μm的厚度，将切片附着到载玻片上并使用载玻片加温器(40±3℃)干燥，来制备样本。使用二甲苯将完全干燥的载玻片脱除石蜡，用醇脱水，并用苏木精-伊红或三色法染色。其后，染色的组织通过再次经过醇和二甲苯，然后在60℃的培养箱中干燥过夜，将其包封。在光学显微镜下观察它们并拍照。

使用图像分析系统(Image-pro plus；3.0版)，测定照片中牙槽骨嵴(AC)与釉质牙骨质界(CEJ)之间的距离。通过比较实验组与假手术组或阴性对照的AC与CEJ之间的距离，测定来自熟地黄和三七的草药混合物提取物的抑制效果。结果示于图13和14。

如图13和14所示，与假手术组相比，在诱导牙周病后只喂给水的阴性对照的骨缺失上升了三倍，但给药来自熟地黄和三七的草药混合物提取物的组只上升了两倍。

正如在患有牙周病的大鼠中证实的，本发明的提取物可用于治疗和预防牙周病。

下面，将描述本发明组合物的配制实施例。

配制例1：药物制剂

1.散剂的制备

本发明的提取物    2g

乳糖              1g

将这些成分混合并装入密封囊中，制备散剂形式。

2.片剂的制备

本发明的提取物    100mg

玉米淀粉          100mg

硬脂酸镁          2mg

将这些成分混合并根据一般方法压片，制备片剂。

3.胶囊剂的制备

本发明的提取物    100mg

玉米淀粉          100mg

乳糖              100mg

硬脂酸镁          2mg

将这些成分混合并根据一般方法装入明胶胶囊中，制备胶囊剂。

4.嗽口水的制备

本发明的提取物    0.01～1.0g

木糖醇            5～10g

乙醇              5～15g

山梨糖醇          5～15g

糖精钠            10～100mg

单氟磷酸钠        500～1000mg

月桂硫酸钠        100～200mg

聚山梨酯20        100～1000mg

薄荷调味剂        10～100mg

苯甲酸钠          10～100g

净化水            适量

色素              适量

总计              100g

根据一般方法将这些成分混合，制备可用于预防和治疗牙周炎的嗽口水。

配制例2：食品的制备

如下制备包含本发明提取物的食品。

1.调味品的制备

制备包含20～95wt％的本发明提取物的健身调味品。

2.番茄酱和番茄汁(tomato source)的制备

通过将0.2～1.0wt％的本发明提取物添加到一般的番茄酱或番茄汁中，制备促进健康的番茄酱或番茄汁。

3.面食的制备

使用包含0.5～5.0wt％的本发明提取物的面粉混合物制备面包、蛋糕、饼干和面条。

4.汤和肉汁的制备

将量为0.1～5.0wt％的本发明提取物添加到一般的汤或肉汁中，制备用于肉制品或面条的促进健康的汤或肉汁。

5.绞牛肉的制备

将量为10wt％的本发明提取物添加到一般的绞牛肉中，制备促进健康的绞牛肉。

6.乳制品的制备

使用包含5～10wt％的本发明提取物的牛奶制备各种乳制品如黄油和冰淇淋。

7.禅食(zen food)的制备

使用一般方法将糙米、大麦、糯米和未脱壳的薏苡预胶化，干燥并烘干，然后磨成粒度为60目的粉末。

根据一般方法将黑豆、黑芝麻和野芝麻蒸煮，干燥并烘干，然后磨成粒度为60目的粉末。

使用真空浓缩器将本发明的提取物在真空中浓缩并在对流烘箱中干燥，然后磨成粒度为60目的粉末。

按下列比率配制由所述谷物、所述种子和本发明的提取物组成的粉末，获得禅食。

谷物(糙米30wt％，未脱壳的薏苡15wt％，大麦20wt％)，

种子(野芝麻7wt％，黑豆8wt％，黑芝麻7wt％)，

本发明提取物的干粉(3wt％)，

灵芝(Ganoderma lucidum)(0.5wt％)，

毛地黄(Foxglove)(0.5wt％)。

配制例3：饮料的制备

1碳酸饮料的制备

将包含5～10％糖、0.05～0.3％柠檬酸、0.005～0.02％焦糖和0.1～1％维生素C的混合物与79～94％的净化水混合，得到糖浆，然后将其在85～98℃灭菌20～180秒。将灭菌的糖浆与冷水以1∶4的比率混合，然后注射0.5～0.82％的二氧化碳，得到包含本发明提取物的碳酸饮料。

2.保健饮料的制备

将液体果糖(0.5％)、低聚糖(2％)、糖(2％)、盐(0.5％)和水(75％)与本发明的提取物均匀调配，将配制物进行巴氏灭菌并装入瓶子如玻璃瓶、PET瓶等内。

3.蔬菜汁的制备

将5g本发明的提取物添加到1000ml一般的番茄汁或胡萝卜汁中，得到药用蔬菜汁。

4.果汁的制备

将1g本发明的提取物添加到1000ml一般的苹果汁或葡萄汁中，得到药用果汁。