作为HIVgp120抗原的模拟表位的抗独特型单克隆抗体

摘要

描述了新的抗独特型单克隆抗体，其能够与人类抗gp120抗体的独特型特异性地反应，能够抑制gp120抗原和人类抗gp120抗体之间的结合，并且能够在它们被施用于的动物宿主中引发中和抗gp120免疫反应。本发明的抗独特型单克隆抗体可以根据它们的轻链和重链的可变部分的氨基酸序列来确定。此外，公开了获得抗独特型单克隆抗体组的方法，在产生前述抗独特型单克隆抗体的重组DNA过程中可用的表达载体和转化的宿主细胞，以及这些抗体的治疗性、预防性和诊断性用途。

说明书

本发明一般地涉及免疫学领域，具体地涉及抗独特型单克隆抗体 或其片段，其与人抗体特异性地反应，所述人抗体能够结合人类获得 性免疫缺陷病毒(HIV)gp120蛋白，并且当施用给动物、包括人类 时能够诱导抗gp120反应。

发明背景

长久以来，HIV感染的冲击已经到达了全世界范围。在全世界， 估计有大约4千万感染人口，证实的新感染以每年5百万新病例持续 增长(UNAIDS-AIDS Epidemic Update-2005)。对感染实行控制机 制的不可能性、或者它们的无效性已经在全球的某些区域构成了可怕 的图景。例如，在非洲撒哈拉以南的某些区域(世界上大流行影响最 大的区域)，估计超过50％的工作年龄的受试者是血清阳性的，对这 个地区无论如何已经毁坏的经济具有明显的影响。但是，在正在经历 着令人印象深刻的经济增长期的地区，例如，印度次大陆和东南亚， 类似的情况也在发生。在这些地区，血清阳性的数量接近1千万，新 的病例每年指数性地增长(UNAIDS-AIDS Epidemic Update-2005).

抗逆转录病毒治疗，当可以使用时，改善了被感染受试者的生存 期望。然而它与一系列的不利因素相联系，所述不利因素在数年内可 能降低它的积极效果。首先，当今可用的治疗不是治愈性的；换句话 说，被治疗的受试者不能完全消灭病毒，而仍然是受感染的，并因而 暴露于发展严重的临床形式感染(明显的AIDS)，以及无论如何向 其他人传播感染的风险中。此外，可用的药物受到非常严重的副作用 的拖累。这导致了患者与治疗本身的低相容性。低相容性，与病毒的 高度分子适应性和其他因素一起，有助于完全药物抗性HIV分离株的 产生和传播。此外，治疗的高成本使得它在世界的贫困地区大规模地 使用完全不可能，如前所述的，这些地区代表了全球水平感染的真正 的爆发性储备地。

总体上，以上描述的因素使得在HIV感染控制领域找出可替代 的，或至少补充性的治疗策略的必要性具有最高的重要性，有效的疫 苗方法的开发当然地具有优先作用。

不幸的是，HIV感染当今仍然是公开的挑战，并且难以由科学共 同体来解决。实际上，基于不能感染、但能够刺激免疫系统的病毒颗 粒施用的传统的疫苗方法，已经被证明对于一种病毒是无效的，所述 病毒利用分子多态性，即，突变能力来逃避免疫反应作为其制胜武器 (McMichael J.，(2006)Annu.Rev.Immunol.24：227-55)。

在以下的说明书中，在简要地说明HIV刺激的主要免疫学机制之 后，将综合地回顾现今为止各种主要的疫苗策略，特别地关注本发明 中的方法涉及的策略，其是本专利申请的主题，即，抗独特型模拟抗 体的获得和施用。

针对HIV的免疫反应

HIV感染的天然历史可见感染后前几周内病毒的不受控制的复 制，病毒血水平常常在前21天内超过每毫升血浆107个病毒颗粒的值。 这个第一阶段之后是另一个特征为病毒血水平突然降低的阶段，是由 于细胞毒性CD8+T细胞和中和抗体的产生所代表的、特异性反应机 制的活化。这个阶段展现了免疫系统一旦被刺激如何能够至少部分地 控制感染。然而，如前一节所提及的，主要的关注在于某些病毒蛋白 质的超变性，其允许病毒克服所刺激的防御，因而恢复不受控制式的 复制。在HIV感染的情况中，在病毒改变之后免疫系统由此被持续地 唤起运行；然而，感染的天然历史表明，免疫系统在这种追逐中持续 地失败。

有效的预防性疫苗的主要目的是自首次接触起为病毒呈现免疫 反应，所述免疫反应能够阻断病毒并因而阻止病毒在机体中不受控制 的增殖。

使得目标细胞感染成为可能的HIV表面蛋白(gp120和gp41)， 是免疫反应、特别是体液型免疫反应的主要目标。然而在天然感染的 过程中产生的抗体产生一种保护，其限于刺激这种反应的病毒。换句 话说，正是这些抗体将不能保护产生它们的患者免受将发展的新的病 毒变体，并且(从疫苗角度来看最重要的方面)更加不能保护被其他 HIV变体感染的其他患者。

然而，HIV诱导的抗体反应的研究已经证明了一些抗体克隆的可 能的作用，所述抗体克隆具有对许多病毒分离株的广泛中和活性 (Pantophlet R.and Burton D.R.，(2006)Annu.Rev.Immunol.24： 739-769)。并且，仅仅少数患者能够产生具有类似特征的抗体，这将 容许它们控制感染长得多的时间，减慢朝向明显AIDS的发展 (Braibant M.等，(2006)AIDS.20：1923-30)。这些患者被科学共 同体定义为长期不进展者(LTNP)，并且当然地代表了为了有效疫 苗的开发而被研究的抗HIV免疫反应的实例。

根据采集的数据，科学共同体在此几乎普遍地认识到，有效的预 防性或治疗性疫苗将能够刺激足够的抗体反应，类似于在LTNP患者 中描述的。潜在有效的体液反应的主要靶点是，如前所述的，两种表 面糖蛋白(gp120和gp41)，其以三聚体的形式构成了刺突，刺突允 许病毒结合目标细胞并穿透到目标细胞内。然而，特别地，保守的关 键表位，因而对于不同的病毒分离株是共同的，可能在这些蛋白质中 被检测到。实验室和临床实验数据实际证明了，广泛的中和活性反应 实际上是针对这些表位的(Braibant M.等，(2006)AIDS.20：1923-30)。 科学共同体一致地认识到，存在具有与病毒第一次接触时类似特征的 抗体，将最有可能能够中和感染，来获得甚至是最有效的治疗方案也 未能成功获得的，即，完全的病毒清除(Pantophlet R.and Burton D.R.， (2006)Annu.Rev.Immunol.24：739-769)。

病毒逃避机制

在文献中已经深度研究了细胞和体液免疫反应针对HIV病毒发 挥的选择压力，然而它对免疫学缺陷的发展以及在临床上的影响还不 清楚。自早期感染阶段开始，中和抗体产生的选择压力实际上很容易 在体外和体内观察到。实际上，病毒通过一系列突变来逃避，所述突 变使得通常产生的非广泛性中和抗体无效。有时涉及单个氨基酸残基 的这种突变一般涉及表面糖蛋白，特别是所谓的gp120蛋白V(可变) 区域。因而，容易理解的是，这种关键抗原的序列可变性是自然感染 过程中产生的抗体不能完全阻断病毒的主要原因之一。通过用完整病 毒颗粒或重组gp120免疫受试者获得保护性反应的所有“经典”尝试失 败的分子原因同样是可以容易理解的(Pantophlet R.and Burton D.R.， (2006)Annu.Rev.Immunol.24：739-769)。

然而，HIV防卫机制不限于本身已经很有效的超变性的策略。病 毒的结构研究实际上已经揭示了HIV如何利用它自己的超变区域来 向免疫系统隐藏关键表位，例如CD4结合位点和所谓的gp120共同受 体结合位点，即，在感染时物理地结合目标细胞受体和共同受体的蛋 白质部分。换句话说，病毒将仅在与目标细胞直接相互作用时暴露这 些关键区域，因而限制了它们对免疫系统的暴露。

并且，HIV已经发展了隐藏gp120最重要的表位的另一种策略： 分子的50％实际上被碳水化合物覆盖，这使得蛋白质表面对于免疫系 统实际上“不可见”。在体内，病毒还可以修饰这种糖类包被的位置， 因而产生了动态进化模式的假说，所谓的多糖护盾(glycan shield)。 HIV实际上能够调节糖基化，持续地适应它时常要面对的免疫反应种 类。因而，逃避免疫反应的能力不是广泛的现象，不是对所有病毒颗 粒共同的固有特征，而是对每次刺激的中和抗体反应的特异性的和持 续的适应。

作为潜在的疫苗靶点的gp120

如在之前两个小节中公开的，gp120是HIV病毒中和免疫反应的 主要靶点。然而，在前一小节中，已经指出了为什么经典的疫苗方法、 甚至计划利用对病毒如此重要的抗原不能产生积极结果的分子学原 因。特别地，利用灭活的完整病毒颗粒或gp120重组单体形式，引起 了免疫反应的刺激，其仅限于免疫方案中使用的病毒、或获取所述重 组蛋白质的病毒。例如，刺激的反应最后限于在实验室中在永生化T 细胞系培养物中生长的适应的HIV分离株。反而，针对“原始”病毒分 离株，即，直接来自感染的患者的分离株没有见到抗病毒效果。

这些方法的失败引发了将在说明书的这个小节中简要公开的可 能的替代途径的研究，可以综合地分成两个组。

a)更好地代表了HIV刺突上展示的蛋白质结构的gp120三聚物制品的开发。

这种方法依靠施用gp120，不再是单聚形式，而是与其他病毒表 面糖蛋白、gp41蛋白缔合的异三聚形式。这种策略根源的原理是基于 单聚gp120与三聚形式相比不同的抗原特征的观察结果(Pantophlet R. and Burton D.R.，(2006)Annu.Rev.Immunol.24：739-769)。然而， 从关于这种策略的方法采集的第一手数据揭示了一系列相互紧密联 系的问题，都是从技术角度以及从关于方法本身的有效性的角度。从 技术角度，要克服的主要障碍实际上存在于获得稳定的异三聚形式的 能力，所述异三聚形式最好能够模拟病毒包膜刺突的组织机构。在 HIV表面，实际上，gp120-gp41相互作用是由必要的非共价相互作用 介导的，以对刺突的总体结构给予表征其功能的不可缺少的结构适应 性。在实验室中，已经证实了特别难以获得这样的分子，其一方面应 当足够稳定以免解离成单独的单体，然而另一方面应当能够展示蛋白 质、特别是gp120的关键部分。因而必需的是采用一系列的技术策略 来稳定三聚物(原始多聚蛋白裂解位点中的突变、半胱氨酸残基向结 构的非重要部分中的插入)，或将它们展现在与病毒包膜尽可能类似 的结构上(包含到蛋白脂质体中，在病毒样颗粒上表达)。然而，后 面的方法都不能容许完全解决三聚体稳定化和纯化难题，就有效性以 及特别是中和活性的程度而言，与用gp120的单聚形式获得的结果相 比，它们也没有产生明确优越的结果。计划利用突变的gp120重组形 式以使蛋白质的关键部分对免疫系统更可获得的方法，所获得的结果 类似地是不令人满意的。

b)创新的基于表位的疫苗的开发，即，基于gp120的保守的、因而潜在保护性的部分对免疫系统的暴露。

这一组与抗独特型模拟表位策略相关联，本专利申请中例举的发 明也是基于此。

上文例举的所有策略的主要难题涉及除了类型特异性中和反应 之外不能刺激广泛的中和反应。所谓的基于表位的方法必需在一些尝 试的范围内考虑，来降低类型特异性反应和增强交叉中和反应。

为了更好地理解这组中涉及的策略，对gp120抗原结构进行简要 的介绍是有用的。根据比较性序列分析，gp120的研究揭示了，作为 糖蛋白，5个保守的(C1-C5)和5个可变的(V1-V5)片段。进一步 的研究展现了C1和C5区域可能涉及与gp41接触，已经证明的是针 对这个区域的抗体仅识别单体形式的gp120，而不识别三聚的形式。 反而，C2、C3和C4区域的某些部分可能形成gp120分子内隐藏的和 相对疏水的核，可能涉及CD4受体识别。不像保守的区域，可变区域 (特别是V1、V2和V3)是在蛋白质上充分暴露的和可接近的。

基于表位的方法实际上尝试利用gp120结构特征以获得能够专门 地或主要地将免疫反应靶向它的关键表位的分子。在这种情境下，一 种策略是利用gp120单体，其中除去了V1、V2和V3区域，以将保 守的CD4结合部分暴露给免疫系统。类似的方法还没有得到满意的结 果，也是因为从蛋白质中除去这种大的部分对它的整体构象、由此对 CD4结合部分具有不可避免的影响，其可能丧失它自身的独特特征。

另一种可能的策略是对免疫系统有利地利用先前公开的HIV逃 避机制之一，即，gp120部分的超糖基化。就此而论，已经在实验室 中获得了人工糖基化的gp120s，以隐藏非保护性的位点并将反应专门 地靶向蛋白质的重要部分。然而，用这种方法获得的结果不是令人满 意的，在大量的这种策略中，虽然引起了针对分子的非保守部分的免 疫反应的降低，但未能引起对gp120关键部分的广泛的反应。

在这一点上，想到，在很少见的情况下和在非常低的滴度下，在 某些天然感染的过程中，产生了能够中和广泛的病毒分离株的抗体是 有用的。这些抗体(从科学的角度看极度稀少和宝贵)因而代表了基 于极端靶向的表位的方法的理想模板。利用这些分子的独特型(即， 特异性识别和结合抗原的抗体部分)，通过利用反向疫苗学方法，可 能获得其他的(抗独特型)抗体分子，其特异性地针对广泛中和抗体 的独特型，因而能够模拟它们识别的关键表位。换句话说，良好设计 的抗独特型抗体可能代表了实验室中优越的人工抗原，因为它们能够 仅将中和抗体识别的关键表位暴露给免疫系统。

在先的科学和专利文献中的分析已经容许指出，基于抗独特型的 策略已经应用于HIV感染。

然而，就发明人所知的，在先的文献的大部分涉及抗独特型抗体， 其是利用非人类衍生的、特别是小鼠衍生的抗体分子，即，用重组 gp120免疫实验室小鼠获得的抗体作为克隆模板。许多次科学地证明 了，一种相同的表位能够在实验动物中刺激特定的抗体反应，但在人 类中不能，利用非人类衍生的多克隆制品或单克隆抗体作为获取抗独 特型抗体的模板的选择，使得对于免疫目的有用的抗独特型抗体的获 得在人类中是不确定的。即，不确定的是，它们能效地模拟人类免疫 系统识别的基础性gp120抗原部分，并且因而能够在人类中刺激有效 的免疫反应。

人类衍生的模板抗体

然而，少数在先文件描述了具有中和活性的人类单克隆抗体，其 在某些情况下被提出作为获得抗独特型分子的模板。然而，这些在先 文件的大部分没有以实践的方式描述抗独特型分子的产生，也没有描 述它们的性质和应用。

发明人仅获得了一个在先专利文件，其中具体地公开了从人类衍 生的模板抗体开始获取抗独特型抗体。它是1992年9月17日公开的 国际专利申请WO 92/15885。该专利申请公开了对用于HIV感染的预 防性和治疗性处理的疫苗目的有用的、抗独特型单克隆抗体的选择方 法。简要地，该方法计划利用完整抗gp120人类Igs(Ab1s)的多克 隆制品作为模板获得抗独特型单克隆抗体(G1-Ab2s)，随后选择抗 独特型单克隆抗体的亚组(G2-Ab2s)，其特征在于体外与多种HIV 毒株中和抗gp120抗体反应的能力，并选择能够在灵长类宿主中产生 抗抗独特型抗体(Ab3)反应的进一步的抗独特型单克隆抗体的亚组 (G3-Ab2s)，所述抗体与gp120抗原反应并具有HIV中和性质。

WO 92/15885申请中描述的步骤显示了几个缺点。首先，通过使 用完整的免疫球蛋白作为模板，获得了一组抗免疫球蛋白单克隆抗 体，其主要针对模板免疫球蛋白的无用的部分，即，独特型之外的部 分，并且其大部分因而不是真实的抗独特型。此外，在本专利申请中 公开的在灵长类中实现的中和反应是微弱的，需要在免疫中使用的抗 体的预先纯化。因而可以断定，用WO92/15885方法获得的抗体，除 了对于抗gp120免疫球蛋白的有用部分(独特型)没有足够特异性之 外，不能激发强的中和免疫反应(低抗体滴度)并因而作为疫苗不是 特别有前景。

发明目的

本发明的目的是解决上文例举的现有技术的难题。

更具体地，本发明的一个目的是提供抗免疫球蛋白单克隆抗体或 其抗体片段，其能够免疫学地结合人类抗HIV gp120抗体的独特型， 并且因而其能被定义为“抗独特型”抗体。

本发明的另一个目的是提供如上文定义的抗独特型单克隆抗体 或其抗体片段，其能够抑制gp120抗原和人类抗gp120抗体之间的免 疫学结合。

本发明的另一目的是提供如上文定义的抗独特型单克隆抗体或 其片段，其在施用给动物包括人类时能够激发针对HIV的快速和强烈 的抗抗独特型抗体免疫反应。

本发明的另一个目的是提供制备如上文定义的抗独特型单克隆 抗体或其片段的方法，容许获得一组单克隆抗体，所述单克隆抗体特 异性地针对用作模板的人类抗gp120免疫球蛋白的有用部分，即，它 们的独特型，并且其能够中和HIV病毒。

发明描述

通过附随的权利要求中所定义的抗独特型抗体、它们的核苷酸和 氨基酸序列以及其制备方法，实现了这些和其他目的。权利要求形成 了说明书的整体部分。

更具体地，本发明涉及制备适合的抗独特型单克隆抗体的方法， 所述抗体用于HIV感染或其相关疾病的预防性或治疗性处理，所述制 备方法包括第一步骤，其中提供针对HIV gp120抗原的人类多克隆抗 体(并因而进一步称为“抗gp120抗体”)的制品，所述制品随后将用 作模板用于抗独特型抗体的制备。

重要的是，随后被用作模板的人类多克隆抗gp120抗体的制品是 针对它对抗HIV的广泛中和活性预选择的。所述预选择优选地通过选 择临床特征在于缓慢疾病进展的HIV阳性患者(长期不进展者)的血 清作为抗体来源来进行。这些患者通过根据说明书的实验小节中例举 的极度严格的临床病毒学标准来选择。这些标准的观察容许获得具有 可观的广泛HIV中和活性的血清样品。中和活性的验证可以通过利用 本身已知的方法和技术来进行，本领域技术人员能够将所述方法和技 术应用于具体情况而不需进行发明性活动和没有过度的实验。

优选的，用作模板的人类多克隆抗gp120抗体是纯化的抗gp120 免疫球蛋白G(IgG)。纯化优选地通过(免疫)亲和层析过程来进 行，例如，通过利用含有G蛋白的琼脂糖柱用于IgG纯化，含有gp120 的柱用于特异性针对HIV gp120抗原的抗体的纯化。

用作模板的人类多克隆抗gp120抗体的另一个优选的特征是，它 们是Fab片段的形式。因而，在所述方法的优选的实施方式中，具有 广泛HIV中和活性的、纯化的抗gp120 IgGs作为Fab片段来提供。 这种具有中和活性的抗gp120 Fab片段将进一步被称为“RB1Fabs”。

在所述方法的第二个步骤中，RB1Fabs被用作模板用于产生抗免 疫球蛋白单克隆抗体，其针对用作模板的所述RB1Fabs的独特型。这 种抗免疫球蛋白抗体被进一步称为“抗独特型抗体”。

表述“针对(directed towards)，(directed against)”用于表明， 所关注的抗体能够反应于，即，免疫结合于所指抗原。

如已知的，Fab片段是能够结合抗原的抗体片段，可通过用木瓜 蛋白酶消化完整免疫球蛋白获得。更具体地，Fab片段由与重链的 VH-Cγ1片段缔合的完整轻链组成。通过用木瓜蛋白酶消化完整IgG， 获得两个相同的Fab片段。

在本发明的方法的范围内，利用Fab片段作为模板用于产生抗免 疫球蛋白单克隆抗体有利地允许获得一组抗体，所述抗体更特异性地 针对用作模板的免疫球蛋白的有用部分，即，它们的独特型。因而， 这样的抗体被称为“抗独特型”。术语“独特型”是指免疫球蛋白的可变 结构域的超变区的全体，就是说表征了抗体分子的同质群体的那些结 构，例如，骨髓瘤的蛋白质或单克隆抗体，并因而容许区分抗体分子 的一个同质群体和另一个同质群体(例如，一个单克隆抗体和另一 个)。

用于制备单克隆抗体的任何常规技术，例如，但不限制地，杂交 瘤技术、噬菌体展示技术、酵母展示技术、核糖体展示技术，可以用 于获得一组抗独特型单克隆抗体。优选的，在这个步骤中获得的抗独 特型单克隆抗体是小鼠抗体，通过用RB1Fabs免疫小鼠的杂交瘤技术 产生。

最后，在所述方法的第三个步骤中，筛选在第二个步骤中获得的 抗独特型单克隆抗体组来选择抗体的亚组，所述抗体亚组具有抑制 gp120与人类抗gp120抗体、优选地与用作模板的RB1Fabs结合的能 力。这容许确定用本发明的方法获得的抗独特型是真实的模拟表位， 即，能够免疫学地模拟gp120抗原的抗独特型抗体。筛选可以通过用 于这种目的的任何适合的已知方法来进行，例如通过ELISA，如在以 下的实验小节所描述的。

本发明的范围还包括一组抗独特型单克隆抗体，优选小鼠抗体， 其特征在于特异性地针对人类抗gp120抗体的独特型，以及能够抑制 gp120和人类抗gp120抗体之间的结合。这种抗独特型单克隆抗体组 可通过本发明的方法获得。

术语“抗独特型抗体组”被用于表明用本发明的制备方法产生的抗 免疫球蛋白单克隆抗体的不同群体的总体。得益于所使用的特定制备 方法，获得的抗免疫球蛋白单克隆抗体的各种群体，虽然在抗原结合 区的结构方面相互明确不同，但都享有共同的特征，即，它们针对用 作模板的RB1Fabs的独特型，因而可以被定义为抗独特型单克隆抗体 的群体。

根据上述解释，因而明显的是，在本说明书的范围内，术语“抗免 疫球蛋白抗体”与术语“抗独特型抗体”不是同义的。抗免疫球蛋白抗体 一般是通过用免疫球蛋白免疫动物获得的抗体，所述免疫球蛋白在这 种情况下用作抗原。抗免疫球蛋白可以针对用作抗原的任何免疫球蛋 白区域，包括，例如，Ig恒定区或其他保守的部分。相反，抗独特型 抗体是特异性地针对用作抗原的免疫球蛋白的独特型的抗免疫球蛋 白抗体。因而，抗独特型抗体的类别是比抗免疫球蛋白抗体的类别更 具体的。

本专利申请的实验小节详细说明了用于制备本发明的抗独特型 单克隆抗体的方法，以及免疫学特征，其使得获得的某些抗体在针对 HIV感染或与之相关的疾病的疫苗(治疗或预防性)应用中特别有效。 处于Fab片段形式的抗独特型单克隆抗体的获取在实验小节中特别说 明了。并且，描述了两种具体的抗独特型Fabs(称为P1和P2)，其 通过从杂交瘤开始的分子生物学技术获得，并通过它们的重链和轻链 的可变部分的氨基酸和核苷酸序列来确定。在标题为“序列表”的说明 书小节中提供了这些序列。

明显地，本发明的抗独特型抗体，包括P1和P2，可以以Fabs以 外的其他形式制备和使用，例如，作为完整的免疫球蛋白、或以其他 抗体片段类型(例如，F(ab′)₂片段或比Fabs更小的抗体片段)的 形式，或甚至是具有与本发明的Fabs相同免疫学性质的肽。

例如，单链抗体可以根据Ladner等人的美国专利4,946,778中描 述的方法来构建，通过引用合并在此。单链抗体包括通过柔性接头连 接的轻链和重链可变区。被称为单结构域抗体的抗体片段甚至小于单 链抗体，因为它由单独分离的VH结构域组成。获得具有与完整抗体 至少部分相同结合能力的单结构域抗体的技术是现有技术中已知的。 例如，Ward，等，在″Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escheria coli，″Nature 341：644-646，描述了获得抗体重链的可变区(VH单结构域抗体)的 筛选方法，所述抗体重链的可变区具有对目标表位的足够的亲和力从 而它将以分离的形式结合所述表位。

在以下的说明中，术语“抗独特型抗体”因而用于指所有上述的抗 独特型抗体实施方式，即，完整免疫球蛋白、Fab片段或其他抗体片 段类型，单链抗体、单结构域抗体，等等。

本发明的抗独特型抗体可以以游离形式或以载体结合的形式产 生和使用。载体是能够与抗体结合并使得它有免疫原性或提高它的免 疫原性的任何分子。

载体的非限制性的实例有蛋白质例如KLH(钉形贝血蓝蛋白)、 麻仁球蛋白、甲状腺球蛋白、白蛋白，例如，牛血清白蛋白(BSA) 或人类血清白蛋白(HSA)、红血球，例如绵阳红血球(SRBC)、 破伤风变性毒素、霍乱变性毒素、聚氨基酸例如聚(D-赖氨基酸：D- 谷氨酸)等等。为了促进抗独特型与载体的结合，抗独特型C-末端或 N-末端可以被修饰，例如，通过插入其他的氨基酸残基，例如，能够 形成二硫键的一个或更多个半胱氨酸残基。

由于将在实验小节中详细显示的它们的性质，本发明的抗独特型 抗体特别适合于在治疗和/或诊断应用中，特别是在用于HIV感染或 与之相关的疾病的预防或治疗性处理的药物的制备中，以及在用于检 测生物学样品中抗HIV gp120抗体的检测方法中使用。

如前所述，本发明还提供了本发明的两种具体抗独特型Fabs、分 别称为P1和P2的重链和轻链可变区的氨基酸和核苷酸序列。如在实 验小节详细描述的，P1和P2 Fabs已经通过分子生物学技术从称为 Mab1和Mab2的两个杂交瘤开始而获得，所述杂交瘤能够产生抗独特 型单克隆抗体，所述单克隆抗体能够抑制gp120和RB1Fabs之间的免 疫学结合。用于产生本发明的P1和P2Fabs的确切步骤在实验小节中 详细公开了。一般地，编码Mab1杂交瘤产生的单克隆抗体的轻链和 重链可变区的基因的mRNA被克隆到本身已知，称为RBCaf的表达 载体中，由此获得的重组构建体被转染到已经变为感受态的大肠杆菌 (E.coli)菌株XL1Blue细胞中。相同的步骤用于Mab2杂交瘤产生的 单克隆抗体。从每个单克隆抗体获得约40个重组细菌克隆。然后根 据它们产生能结合纯化的RB1Fabs的小鼠Fabs的能力来选择重组细 菌克隆。这样选择了两个克隆，每个克隆一个，分别称为Pomona1(P1) 和Pomona2(P2)。获得了小鼠P1和P2 Fabs的重链和轻链可变区的 氨基酸和核苷酸序列。这些序列在标题为“序列表”的小节中报告了。

小鼠P1和P2 Fabs结果是有益地积极的，不仅对于它们抑制 gp120-RB1Fab结合的能力、以及对于它们在小鼠以外的动物模型，例 如兔子中刺激特异性抗gp120免疫反应的能力。本专利申请的实验小 节中描述的免疫实验显示了这些Fabs能够引发快速和强烈的特异性 抗gp120免疫反应，在高血清稀释(1∶1600)中也是明显的。还可能 的是验证在兔子中响应于本发明的P1和P2 Fabs的免疫所引发的抗 gp120抗体展现了高度HIV中和活性。获得的数据表明，本发明的P1 和P2分子在疫苗应用中特别有用，特别是用于HIV感染或与之相关 的疾病的预防和治疗性处理的疫苗应用。

本发明的抗体引发强烈的抗病毒免疫反应(不使用病毒)的能力 在与人类系统发育很远的动物模型，例如兔子中被证实，不仅在该观 察结果的基础上预测了这些性质，而且还通过来自用本发明的抗独特 型单克隆抗体免疫的兔子的血清的中和活性评估分析实验性地证实 了它们。利用人类神经胶质瘤细胞系进行的这些中和实验的结果在以 下的实验小节中说明了。

因而，包含免疫学有效量的至少一种本发明的抗独特型抗体(优 选的P1或P2分子)以及药学上可接受的载体和/或稀释剂的免疫原性 组合物也被包括在本发明的范围中。免疫学有效量的至少一种本发明 的抗独特型抗体是能够在所施用的动物宿主，包括人类中诱导抗 gp120免疫反应的量。

任选地，所述免疫原性组合物可以进一步包括一种或更多种佐 剂。佐剂是具有对免疫系统的非特异性刺激活性的化合物。佐剂的非 限制性实例有完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、维生素E、非离子嵌 段聚合物、胞壁酰肽、免疫刺激复合物、皂苷、矿物油、蔬菜油、 Carbopol、热不稳定大肠杆菌毒素(LT)、霍乱毒素(CT)、氢氧化 铝、磷酸铝或氧化铝，等等。

用于本发明的免疫原性组合物的有用的药学上可接受的载体或 稀释剂的其他非限制性实例包括稳定剂，例如SPGA，碳水化合物(例 如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)，蛋白质例如 白蛋白或酪蛋白，含蛋白质的试剂，例如牛血清或脱脂奶，以及缓冲 液(例如，磷酸缓冲液)。

如在以下实验小节将详细描述的，已经确认的是，通过使动物经 历特定的免疫方案，可用本发明的抗独特型分子免疫测试动物(例如， 兔子)实现的结果可以被进一步改进(对于抗gp120免疫反应强度来 说，参见附图3)，所述免疫方案计划本发明的抗独特型抗体(优选 的P1或P2)以及gp120抗原或其他天然存在的或人工的抗原的同时、 独立或序贯的施用。

因而，包含本发明的抗独特型抗体，优选的P1或P2，以及HIV gp120抗原或其他天然存在的或人工的抗原作为用于在针对HIV的治 疗或预防性免疫方案中同时、独立或序贯施用的组合制品的试剂盒也 被包括在本发明的范围内。

最后，考虑到它们与抗HIV gp120抗体特异性反应的已证实的能 力，本发明的抗独特型抗体，优选的P1和P2，可以用作体外方法中 的诊断试剂，用于检测生物学样品中的抗gp120抗体和/或抗体亚群， 例如，来自动物、包括人类的血清、血浆、血液或任何其他适合的生 物学材料的样品，所述人类例如感染的或怀疑被HIV感染的患者。

实验小节

从HIV病毒中和血清获得人类IgGs

从临床特征在于疾病的缓慢进展的HIV阳性患者(长期不进展 者)的血清纯化了人类IgGs。

通过根据在长期不进展者的定义中最严格的临床病毒学标准来 选择这些患者。所有选定的患者实际上用以下参数来表征：

-HIV血清阳性至少8年；

-CD4+T淋巴细胞水平超过600个细胞/μl至少5年(这是用于 评估所选受试者的免疫学状态的极其重要的参数，不仅是在研究之 时，还在研究之前的长期时间期间)；

-没有HIV相关临床病征至少5年(这是随着时间的过去的感染 控制的极其重要的指征)。

通过根据这些参数，可能的是随着时间的过去获得(根据所提出 的标准的严格性具有明显的难度)血清样品，其具有令人惊讶的广泛 中和活性，并因而对于研究的继续是最理想的。

此外，不是所有的选定患者的血清样品可被用作多克隆制品模板 来获得抗独特型：仅仅能够显著地抑制宽范围的HIV分离株组的血清 被选择用于研究的继续。

来自这些患者的血清等分量被评估它们的HIV-1中和能力。

简要地，对于病毒中和，参考的嗜淋巴细胞病毒毒株(HIV-1 IIIB) (Advanced Biotechnologies Inc.-ABI)首先通过Karber的方法(Oxford University Press，Virus Culture-A Practical Approach，ed.A.J.Cann， p.84)在HTLV-1转化的人类细胞系(C8166-ECACC#88051601) 上，对每个病毒稀释度(范围：1∶10到1∶16000)使用6个副本来 滴定，从而获得表示为TCID₅₀(即，能够在50％的感染细胞中测定细 胞病变效果的剂量)的病毒滴度。在中和测试中，因而100 TCID₅₀与 所选血清的分步稀释物预先孵育，评估后者抑制C8166细胞被病毒感 染的能力。为此，在预孵育后3、7和10天采集培养物上清液以测量 病毒p24(HIV Duo Ultra，Biomerieux)。

选择具有更高中和活性的血清，组合所有的等分量。从血清纯化 IgGs通过免疫亲和层析来进行。简短地，中和血清的库用3倍体积的 PBS(磷酸盐缓冲盐水：NaCl 8mg/ml；KCl 0.2mg/ml；Na₂HPO₄ 1.44 mg/ml；KH₂PO₄ 0.24mg/ml)稀释，过滤通过0.45μm过滤器(Millipore Corporation；Bedford，MA)。滤液然后通过含有蛋白G的琼脂糖柱 (Gammabind Sepharose^TM，GE Healthcare Life Sciences，UK)。在用 10倍体积PBS对柱洗涤一次之后，用10倍体积的0.1M柠檬酸、pH 3洗脱结合的IgG成分，迅速用碱性溶液(1.5M Tris-Base)中和。获 得的各种级分然后在分光光度计中读取(O.D.280nm)以评估获得的 IgG的数量。

抗HIV gp120抗体的纯化

针对HIV gp120糖蛋白的抗体通过已经描述的技术(Hariharan 等，1993)的修改版来纯化。简要地，700μg重组型IIIB gp120糖蛋 白(ImmunoDiagnostics Inc.，Woburn，MA)通过共价结合与CNBr 活化的Sepharose 4B(CNBr-activated Sepharose^TM 4B，GE Healthcare Life Sciences，UK)偶联。溶于4ml的偶联缓冲液(100mM NaHCO₃； 500mM NaCl；用HCl调节到pH 8.2)中的前述数量的抗原添加到4ml 50％再生的树脂上，之前用1mM HCl洗涤。混合物在4℃进行旋转混 合过夜，用过量的偶联缓冲液洗去过量的未结合的抗原。树脂然后转 移到10ml注射器中并用十倍体积的10mM Tris、pH 7.5洗涤。然后 将10倍体积的100mM甘氨酸(pH 2.5)施加到柱上，随后是10倍 体积的10mM Tris(pH 8.8)和10倍体积的100mM三乙胺(pH 11.2)， 最后，柱用10mM Tris(pH7.5)洗涤直到pH值达到7.5。

1∶3稀释到10mM Tris(pH 7.5)中的患者的抗体在4℃缓慢通 过含树脂的柱7次。然后用10倍体积的10mM Tris(pH 7.5)洗涤柱 子，最后用100mM甘氨酸(pH 2.5)洗脱抗体，并立即中和。通过 ELISA分析级分的针对gp120的反应性。特别地，用重悬浮在25ml PBS中的100ng的抗原包被每个孔，随后平板在4℃孵育过夜。类似 地，用对照抗原牛血清白蛋白(BSA-#A7030-Sigma，St.Louis，MO) 包被一些孔。未结合到平板的过量的抗原然后通过用蒸馏水的一系列 洗涤来除去。平板用PBS/1％BSA封闭，在37℃孵育1小时。然后添 加所描述的每个纯化的级分的分步稀释物(从1∶100到1∶6400)， 容许与抗原在37℃孵育2小时。在用PBS/0.05％Tween 20的一轮10 次洗涤之后，针对人类IgGs的Fc部分的、40μl的在PBS/1％BSA中 1∶700稀释的辣根过氧化酶结合的山羊多克隆抗体溶液(Sigma，St. Louis，MO)添加到每个孔中。在37℃孵育1小时之后，进行用 PBS-Tween的另一个10次洗涤。然后向孔添加酶底物(OPD-o-苯二 胺-Sigma)，通过在450nm O.D.读取的分光光度计检测信号，与BSA 值小心地比较gp120值。

含有抗gp120抗体的级分组合到单个制品中，通过超滤来浓缩。

通过分析纯化的抗体与抗原的反应性来证明没有污染抗体，针对 所述抗原的抗体在制备之前存在于患者的血清中(单纯性疱疹病毒和 风疹病毒抗原)。为此，用两种病毒(ATCC#VR-733；ATCC#VR-553) 感染Vero细胞(ATCC#CCL-81)。在37℃孵育6天后，收集感染 的细胞(和未感染的Vero细胞作为阴性对照)。细胞团然后重悬浮 到250μl的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8，150mM NaCl；0.02％叠 氮化钠；0.5％Triton-X)中，在冰上孵育20分钟，在4℃12000g离 心2分钟。然后通过利用商业上可获得的试剂盒(BCATM蛋白测定 试剂盒-Pierce，Rockford，Illinois)计算上清液中的蛋白质浓度。 根据早先对gp120描述的方案，300ng的蛋白质提取物然后用于包被 ELISA平板孔。

Fab片段的产生

来自纯化的抗gp120IgGs的Fab片段通过利用Pierce ImmunoPure Fab制备试剂盒(Pierce，Rockford，IL)根据厂家提供的说明来产生。 通过这个实验获得的人类Fabs(称为RB1Fabs)用于免疫小鼠和用于 下文进一步描述的某些ELISA分析。

小鼠抗独特型单克隆抗体(mAbs)的产生

雌性4-6周龄BALB/c小鼠(Charles River Corporate，Wilmington， MA)通过一周一次腹膜内注射0.5ml含约50μg纯化的人类Fabs (RB1Fabs)的PBS与等体积的不完全弗氏佐剂(Gibco)重复三次来 免疫。这3次施用之后是另外3次一周一次地、通过腹膜内途径、但 没有不完全佐剂的施用。在开始方案之前，以及在这种免疫进度之后， 抽取血液，通过ELISA评估每个动物的对来自HIV血清阴性患者的 血清的纯化的IgGs的Fabs的抗体反应。简要地，通过用300ng的Fabs 包被反应孔，如对先前的ELISAs所描述的进行分析。然后从每个动 物的免疫前的血清和免疫方案后抽取的血清制备分步稀释物(从1∶ 100到1∶6400)。然后通过针对小鼠抗体的Fc部分的山羊抗体的多 克隆制品(Sigma，St.Louis，MO)检测结合于不同制品的小鼠抗体。 在满意的反应的情况下(免疫血清1∶1600稀释物的O.D.450超过用 免疫前血清获得的值至少＞1.5)，然后在处死动物用于融合之前3天 进行最后的抗原接种。

小鼠单克隆抗体的产生

小鼠单克隆抗体的产生通过利用具有新的修改的已描述的方法 (R.Burioni，doctoral thesis，1993)来进行。

简要地，来自小鼠NS-1骨髓瘤细胞系(ECACC#85011427)的 细胞用作融合伴侣。细胞以及来自它们的杂交瘤在补充有20％完全失 活的胎牛血清(Flow)的RPMI-1640培养基(Gibco)中培养。两种 培养基用于融合。第一种，称为融合培养基，用5ml的EMEM培养 基(Invitrogen)、0.75ml的二甲亚砜和4.75ml的PEG1540来制备。 另外，用375.5ml的RPMI-1640培养基、100ml的完全灭活的胎牛血 清、13.5ml的7％碳酸氢钠和5ml的100×HAT溶液(Ipoxantine 1.36 mg/ml，胸腺嘧啶核苷0.388mg/ml，氨基喋呤-不存在于HT培养基中 -0.019mg/ml)制备HAT和HT选择培养基。青霉素(100mIU/ml)、 链霉素(100μg/ml)、L-谷氨酰胺(2mM终浓度)和两性霉素B(100 μg/ml)也添加到培养基中。

免疫进度计划的最后的接种之后三天，通过颈部脱臼杀死小鼠， 在无菌条件下取出它们的脾脏。洗涤脾脏，利用注射器针头将它们解 离成小块。脾细胞然后从连接的纤维隔壁上分离，容许后者在相同无 菌罩子下在试管中沉淀数分钟。脾细胞重悬浮在EMEM培养基中， 通过离心(1500rpm 10’)来洗涤，重悬浮在补充有青霉素和链霉素 的EMEM培养基中。

同时，NS-1骨髓瘤细胞在培养物中生长2天，从约500,000个细 胞的初始接种物开始。细胞然后通过离心(1500rpm 10’)在EMEM 培养基中洗涤，再次悬浮在补充有青霉素和链霉素的EMEM中。

两种细胞团(一种由脾细胞组成，另一种是通过培养获得的骨髓 瘤细胞)最后重悬浮在10ml的EMEM培养基中，组合到单个试管中， 在1500rpm离心10’，获得的团粒由脾细胞和骨髓瘤细胞系组成。

立即地，在1分钟内，细胞轻轻地重悬浮在1ml的融合培养基中， 在接下来的3分钟内向其中添加5ml的EMEM培养基。在随后的3 分钟内，添加7ml含有20％完全抑制的胎牛血清的RPMI培养基。细 胞进行离心(1200rpm 15’)，团粒重悬浮到10ml的HAT培养基中， 然后稀释到200ml的相同培养基中。在含有5％CO₂的受控空气室中 在36.5℃孵育1小时之后，细胞悬浮物分配到10个96孔微量滴定平 板(NUNC)中，200μl每个孔，在上述相同的房间中孵育。

在随后数天观察含有来自融合物的细胞的平板，来评估杂交瘤的 可能的生长。在生长的情况下，通过ELISA评估细胞培养物上清液的 抗体的存在。然后通过限制性稀释克隆杂交瘤，扩增并部分维持在液 氮中。

通过ELISA(在所述方案之后)展现了针对来自HIV血清阴性患 者的血清的Fab制品的反应性的克隆被立即丢弃。被证明对获自血清 阴性患者的血清的制品阴性的克隆，分析它们对从血清阳性患者纯化 的抗gp120IgG制品的反应性。通过使用其Fab片段作为抗原对于这 种反应性为阳性的克隆在ELISA中分析，并用于小鼠免疫(RB1Fabs)。 能够与后一制品(RB1Fabs)反应的小鼠单克隆抗体通过利用Montage PROSEP-A柱(Fisher)根据厂家的指导来纯化。最后，纯化和浓缩的 抗体，通过修改已经描述的小鼠抗体方法(Bugli等，J.Virol.2001)， 也就是说，通过使用特异性针对小鼠Fab的保守区域的、过氧化酶结 合的山羊多克隆抗体(Sigma，St.Louis，MO)，在抑制ELISA实验 中评估它们抑制来自患者血清的抗gp120纯化Fabs(RB1Fabs)与抗 原本身(gp120)结合的能力。

与纯化的人类Fabs(RB1Fabs)反应的抗体克隆中的两种被鉴定 为也能够抑制纯化的Fabs(RB1Fabs)和gp120之间的结合。这些克 隆被称为Mab1和Mab2。

对于从培养的细胞制备Fab片段，提取mRNA，编码作为Fab的 部分的轻链和重链部分的cDNAs通过所描述的方法来扩增(CSH press，Phage display manual，ed.D.R.Burton，p.A1.10)，这些cDNAs 然后一起克隆到已经描述的称为RBCaf的表达载体中(Burioni等， J.Imm.Meth，1988)。简要地，编码每个Fab的重链的基因(扩增的 DNA)用限制性酶XhoI和SpeI(Roche)在37℃消化1.5小时，随后 连接到重链的载体的克隆位点，随后用相同的酶消化。另外，轻链(扩 增的DNA)用酶SacI和XbaI(Roche)消化，然后克隆到类似消化的 载体中。

由此为2个克隆的每一个获得的重组构建体然后用于根据利用 0.2cm试管的标准化的方案电转化大肠杆菌XL1Blue菌株(通过在甘 油中冷洗涤变为感受态)(电压：2500V；电容：25μF；电阻：200Ω)。

通过克隆到RBCaf中获得单克隆Fabs的ELISA评估

用RBCaf构建体转化的细菌克隆接种到分别含有50μg/ml和 10μg/ml的氨苄西林和四环素的10ml SB培养基中，在37℃摇动生长 直到O.D.600＝1。接着，特定的诱导物(IPTG-异丙基β-D-硫代半乳 糖苷)以1mM的终浓度添加，培养物保持在30℃摇动过夜。细胞通 过热激来裂解(分别在-80℃和37℃的3轮冻-融)，然后离心以从含 Fab的上清液分离细胞碎片。获得的溶解的Fabs通过ELISA分析。 96孔微量滴定平板(NUNC)用RB1纯化的Fabs(300ng每孔)和 作为阴性对照抗原的BSA来包被，在4℃孵育过夜。在除去未结合的 抗原之后，平板用PBS洗涤5次，用含3％白蛋白的PBS在37℃封闭 非特异性结合位点1小时。在除去封闭溶液之后，添加如上述处理的 并含有可溶Fabs的细胞培养上清液。这之后是37℃孵育2小时的步 骤。用PBS/0.05％Tween 20的一轮10次洗涤之后，添加针对小鼠Fabs 的、40μl的在PBS/1％BSA中1∶700稀释的辣根过氧化酶结合的山 羊免疫球蛋白(Sigma)的多克隆制品。在37℃孵育1小时以及进一 步的10次洗涤之后，向孔添加底物(OPD-o-苯二胺)。平板在暗处 在室温下孵育30分钟。用1N硫酸终止反应，通过450nm读取的分 光光度计评估光密度。

在克隆结束时，如刚才描述的对每个单克隆抗体分析了40个重 组细菌克隆，对于它们的每一个，选择能产生能够结合纯化的人类 Fabs(RB1Fabs)的小鼠Fabs的克隆。接下来，分析了这些选定克隆， 称为Pomona1和Pomona2(P1和P2)的轻链可变部分和重链可变部 分DNA序列。这些序列是在序列表小节中提供的那些。

P1和P2 Fabs的纯化

然后通过含G蛋白(～2mg/ml)的琼脂糖树脂填充的柱，免疫亲 和地纯化P1和P2 Fabs，所述柱上共价结合了山羊抗小鼠Fab抗体多 克隆制品(PIERCE，Illinois)。简要地，每个克隆的菌落接种到分别 含有50μg/ml和10μg/ml氨苄西林和四环素的10ml的SB培养基中。 在37℃生长过夜的培养物，继代接种到具有补充有与先前相同浓度抗 生素的500ml SB的烧瓶中。随后用1mM IPTG诱导的细胞在30℃摇 动过夜。培养物在5000rpm离心25分钟，悬浮在PBS中的团粒被超 声化。随后在18,000rpm离心25分钟是除去细胞碎片所需的，过滤 上清液，然后缓慢地通过先前描述的琼脂糖柱。然后，树脂用10倍 体积的PBS洗涤，最终结合的Fabs用酸溶液(洗脱缓冲液-H₂O/HCl pH 2.2)洗脱，收集的级分用适当的溶液(Tris 1M pH 9)中和。收集的 级分通过超滤(Centricon，Millipore)来浓缩。纯化的级分的纯度通 过在12％十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上跑等分量 来评估。最终，这种纯化的Fabs的分步稀释物通过先前描述的ELISA 来分析。针对HCV E2糖蛋白的单克隆Fab制品(e8；e20；e137；e509； Burioni等，Hepatology，1998)被包括在每个平板中作为阴性对照。

获得的结果在附图1中公开，其中报道了与单克隆P1和P2 Fabs 相关的平均光密度值(带有它们的相对标准差)。所有报道的数据是 通过在3个不同的时间进行的ELISA实验产生的，其中每个稀释度点 重复双份。

这些数据显示了P1和P2 Fabs针对FabRB1制品的高度反应性， 此外，这些Fabs不能结合特征为对FabRB1的不同结合特异性的人类 Fabs组。即使在最高浓度(～30μg/ml)下，实际上，两种小鼠Fabs 不能以不同的结合特异性识别Fab制品；实际上，在所有的实验中， 产生的O.D.450值是0.5或更低，而对于用RB1制品检测的值高于 2.5。此外，两种Fabs都被证明能够甚至在实验中使用的最低浓度(～ 0.5μg/ml)下识别RB1制品。

获得的抗独特型分子在动物模型中刺激特异性抗gp120反应的能力的评估

如上文描述获得的P1和P2分子被用于免疫除小鼠外的动物模 型，以评估它们刺激特异性抗HIV/gp120反应的能力。特别的，使用 了雌性4-5周龄新西兰兔(Allevamento Bettinardi，Novara，Italy)， 重量在2.3到2.5kg之间。动物(每组6只)分成三组：

-A组：用抗P1独特型Fab免疫的动物；

-B组：用抗P2独特型Fab免疫的动物；

-C组：用没有抗独特型特征的对照Fab(JO1)免疫的动物。

在开始免疫方案前两周，从每只动物的耳中动脉抽取最大达5ml 的血液，以获得免疫前的血清。200μg每种抗原，重悬浮在最大500μl 生理溶液和500μl佐剂溶液中，然后，在接种位点的适当的消毒准备 之后，在背部通过多次注射(最大10次)以三周的间隔施用。每种 免疫亲和纯化的抗原的纯度通过SDS-PAGE来评估。此外，在用佐剂 乳化之前，每种抗原溶液首先通过0.2μm滤器过滤。在第三次免疫后 2周，从每只动物抽取最大5ml血液，以通过ELISA评估体液反应。 使用与先前段落中公开的类似的方法，用50ng/孔的gp120(HIV IIIB) 包被ELISA平板，在4℃过夜。第二天，通过用生理溶液洗涤来除去 未结合的抗原。然后用PBS/1％BSA溶液封闭每个孔的非特异性位点， 在37℃将平板保持孵育1小时。然后将来自每只动物的免疫前和免疫 后(在3次免疫后)的血清的分步稀释物添加到孔中，在37℃孵育 1.5小时。用PBS/0.05％Tween 20溶液自动化地洗涤平板5次，然后 用合适稀释度的辣根过氧化酶结合的抗兔Ig多克隆(Pierce)检测与 抗原结合的抗体。在37℃孵育又一小时、随后另外5次洗涤之后，如 先前描述地读取获得的信号。

获得的结果在附图2中公开，其中报告了属于三个不同的免疫组 的兔子中刺激的抗gp120反应的平均值(和它们相应的标准差)。报 道的数据与ELISA实验相关，所述ELISA实验对于每个稀释点在三 个不同的时间一式两份地重复。

对于这个数据系列，证明的是两种抗体都能够在实验动物中引发 抗gp120免疫反应，从而结论是在疫苗应用中是潜在有用的分子。还 在高血清稀释度(1∶1600)下证明了反应，平均O.D.450nm提高在 用P1免疫的动物的情况下高于1，在P2的情况下约0.5。从用抗独特 型免疫的组获得的数据、与用小鼠对照抗体(JO-1)免疫的组获得的 数据之间的比较，也容许验证结果的统计学有效性。特别的，通过将 未配对数据的非参数测试(Mann-Whitney测试)应用于研究，可能 的是展现出，从3个动物组获得的结果的分布不全是偶然的，由每种 情况中低于0.05的p值所证明。此外，在最高血清稀释度(1/800和 1/1600)下显著性提高，p值低于0.01。除了确认在最小数量的动物 上进行的这个实验的统计学有效性之外，后者的数据证实了观察到的 现象的特异性。

用单克隆抗独特型抗体先前免疫的兔子的gp120免疫

在用P1、P2和JO1二次强化之后六周，分别属于A、B和C组 的兔子用gp120免疫。重悬浮在500μl生理溶液和500μl不完全弗氏 佐剂(Gibco)中的200μg抗原根据与先前描述的相同的方式来施用。 在免疫后两周，从每只动物抽取约5ml血液以通过ELISA评估抗 gp120体液反应，利用与先前描述的类似的方法。数据通过对每个稀 释度点在三个不同的时间一式两份重复的ELISA实验来获得。

数据在附图3中呈现，其中报告了属于3个不同的免疫组的兔子 中刺激的抗gp120反应的平均值(带有它们相应的标准差)，显示了 在首次免疫后3个兔子组响应gp120，还指出了与用JO1免疫的兔子 组相比，在用P1和P2免疫的兔子组中存在更大的反应。这些数据表 明，与暴露于对照抗原的动物相比，暴露于P1和P2的动物能够产生 更有效的针对gp120的免疫反应。

来自用单克隆抗独特型抗体免疫的兔子的血清的中和活性的评估

通过利用U87.CD4细胞(CXCR4)(NIH AIDS Research & Reagent Program)，一种在其表面表达CXCR4共同受体的人类粘附- 生长神经胶质瘤细胞，进行中和实验。具有丙酮酸钠和L-谷氨酰胺 (EuroClone)、补充有300μg/ml G418(GIBCO)、1μg/ml嘌呤霉 素(Sigma)和10％完全灭活的胎牛血清(EuroClone)的高葡萄糖 DMEM，被用作培养基来维持细胞系。对每只动物评估了免疫前的血 清的中和活性，以及在用抗独特型分子(P1和P2)或用对照抗体(JO1) 三次免疫后采集的血清的中和活性。一种属于IIIB亚型的病毒BH8 分离株(GenBank #K02011)被用作HIV-1分离株。

首先，前述细胞转移到96孔微量滴定平板(Costar)中，以使每 孔具有约8×10³个细胞。第二天，制备无菌的转移平板(Costar)， 在其中病毒与要测试的血清孵育。特别地，含有100TCID₅₀的最终载 荷的病毒的培养基以及每种血清的1/10最终稀释物，在56℃完全抑 制30分钟之后，添加到每个孔中。来自HIV阳性患者的人类多克隆 制品，已知其能够中和所讨论的HIV-1分离株，被用作实验的阳性对 照。另外，标准免疫球蛋白的制品用作阴性对照。每个单独的点重复 三份，在5％CO₂空气中在37℃保持孵育在转移平板中1小时。此后， 100μl的含病毒和血清的溶液从转移平板转移到含有细胞的感染平 板，再次在5％CO₂空气中在37℃孵育过夜。此外，仅含有细胞和病 毒(100 TCID₅₀)的用于感染的阳性对照，以及仅含有细胞的用于细 胞生存力的对照，以及仅含有细胞和血清的用于毒性的对照，被插入 来完成实验，如所描述的进行处理。

第二天，感染平板用无菌PBS洗涤两次，将如前所述的相同培养 基100μl添加到每个孔。这样处理的细胞然后在5％CO₂空气中在37℃ 保持6天。在所述六天的最后，用商业试剂盒(Abbott AXSYM)测 量每孔上清液中产生的p24。对一式三份测试的每个血清计算获得的 p24值的平均值和变异系数，其然后与含有感染阳性对照的反应孔中 一式五份测试获得的值比较。这样，可能评估每种血清的中和活性， 表示为与对照相比在获得的p24值方面降低的百分比。

免疫前的血清没有显示中和活性，与在用小鼠抗体免疫后收集的 血清获得的数据相符。特别地，仅仅用抗独特型分子免疫的动物的血 清产生了p24测量值的降低。对于P1组，实际上，6只动物中的3 只展示了对所使用的HIV-1分离株的中和活性，百分比从最小31.5％ 到最大82.2％。对于用P2抗独特型免疫的两只兔子也获得了类似的数 据，中和值约30％。中和反应的程度和它在可观数量的实验动物中存 在，使得可能推测这些分子在诊断、预防和治疗性疫苗实践中有益的 用途。在所获得的结果的特异性的确认中，重要的是注意到，除了前 述的在免疫前的血清中不存在中和活性之外，用JO-1对照抗体免疫 的动物的血清没有显示中和活性。每个动物获得的结果在下表中总 结。在用相同抗原(P1或P2)免疫的动物的免疫性％中所见的变异 性不是令人惊讶的：这仅仅是由于每个独立的动物对免疫的反应不 同。

动物编号1，14，3，8，9，12：用P1免疫

动物编号17，18，15，20，21，24：用P2免疫

动物编号10，16，4，7，5，22：用JO1免疫

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Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

1               5                   10                  15

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn

            20                  25                  30

Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro Asn Ser Gly Thr

        35                  40                  45

Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp

    50                  55                  60

Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Tyr Tyr Tyr Gly Glu Asp Pro

                85                  90                  95

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Lys

            100                 105                 110

Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln

        115                 120                 125

Thr

<210>2

<211>102

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>2

Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala

1               5                   10                  15

Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln

            20                  25                  30

Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn

        35                  40                  45

Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

    50                  55                  60

Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly

                85                  90                  95

Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100

<210>3

<211>131

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>3

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

1               5                   10                  15

Ile Asp Phe Ser Arg Phe Trp Met Ser Trp Ile Arg Arg Ala Pro Gly

            20                  25                  30

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Asp Gly Ser Thr Ile

        35                  40                  45

Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn

    50                  55                  60

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp

65                  70                  75                  80

Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ala Tyr Gly Asn Tyr Asp

                85                  90                  95

Cys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

            100                 105                 110

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

        115                 120                 125

Ala Gln Thr

    130

<210>4

<211>103

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>4

Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser

1               5                   10                  15

Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr

            20                  25                  30

Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Met Val Ser

        35                  40                  45

Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

    50                  55                  60

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly

65                  70                  75                  80

Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Ala Pro Pro Thr Phe Gly Gly

                85                  90                  95

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100

<210>5

<211>387

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>5

gagctggtga agcctggcgc ttcagtgaag atatcctgca aggcttctgg ttactcattc  60

actgactaca acatgaactg ggtgaagcag agcaatggaa agagccttga gtggattgga  120

gtaattaatc ctaactctgg tactactggc tacaatcaga agttcaaggg caaggccaca  180

ttgactgtag accaatcttc cagcacagcc tacatgcagc tcaacagcct gacatctgag  240

gactctgcag tctattactg tgcagaatat tactacggcg aggatccttt tgcttactgg  300

ggccaaggga ctctggtcac tgtctctaca gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca  360

ctggcccctg gatctgctgc ccaaact                                      387

<210>6

<211>306

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>6

tccttagctg tatctctggg gcagagggcc accatctcat gcagggccag ccaaagtgtc    60

agtacatcta gctatagtta tatgcactgg taccaacaga aaccaggaca gccacccaaa    120

ctcctcatca agtatgcatc caacctagaa tctggggtcc ctgccaggtt cagtggcagt    180

gggtctggga cagacttcac cctcaacatc catcctgtgg aggaggagga tactgcaaca    240

tattactgtc agcacagttg ggagattccg tacacgttcg gaggggggac caagctggaa    300

ataaaa                                                               306

<210>7

<211>393

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>7

ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc tcctgtgcag cctcaggaat tgattttagt    60

agattctgga tgagttggat tcggcgggct ccagggaaag gactagaatg gattggagaa    120

attgatccag atggcagtac aataaactat gcaccatctc taaaggataa attcatcatc    180

tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtac ctgcaaatga gcaaagtgag atctgaggac    240

acagcccttt attactgtgc aagagagggg gcctatggta actatgactg tgctatggac    300

tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc    360

tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa act                                 393

<210>8

<211>309

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>8

tccctgcctg tcagtcttgg agatcaagcc tccatctctt gcagatctag tcagaacatt    60

gtacatagta atggaaacac ctatttagaa tggtacctgc agaggccagg ccagtctcca    120

aagctcctga tctacatggt ttccaatcga ttttctgggg tcccagacag gttcagtggc    180

agtggatcag ggacagattt cacactcaag atcagcagag tggaggctga ggatctagga    240

gtttattact gctttcaagg ttcacatgct cctccgacgt tcggtggagg caccaagctg    300

gaaatcaaa                                                            309