用于治疗犬骨关节炎的ω－3脂肪酸

摘要

本发明披露了用于恢复骨关节炎性狗的更接近正常的关节功能的方法和用于终止狗发生骨关节炎的可能性的方法。这些方法可以包括对狗给予包括有效浓度的ω－3脂肪酸，二十碳五烯酸的组合物。

说明书

本申请是申请号为200480023251.6、发明名称为“用于治疗犬骨关节炎的ω-3脂肪酸”的专利申请的分案申请。

背景技术

骨关节炎是一种常发生在人和宠物中的变性关节病(Richardson等，Vet.Clin.North Amer.Small Animal Practice 27：883-911，1997；Curtis等，Drug Disc.Today 9：165-172，2004)。该病涉及带有最低限度炎症的关节软骨的进行性退化(Schoenherr等在Small AnimalClinical Nutrition ^4thEd.中所述，Hand等Eds.，Walsworth PublishingCompany，Marceline，MO，2000，907-921；Hedborn等，Cell Mol.LifeSci 59：45-53，2002；Pool，Front Biosci 4：D662-70，1999)。骨关节炎的控制可以包括药物治疗、外科手术、给予营养品和膳食控制。然而，治疗目前的控制手段集中在症状缓解，且照此它们尚未在疾病控制或治疗潜在病理学情况中获得完全成功。因此，对控制人和宠物中的骨关节炎的新手段仍然存在持续的需求。

概述

因此，本发明者在本文中已经成功地发现给予有效量的ω-3脂肪酸，特别是二十碳五烯酸(EPA)可以提供用于控制狗的骨关节炎的新手段。该方法可以有效控制狗的骨关节炎。

因此，本发明在不同的实施方案中可以包括用于恢复患有骨关节炎的狗的更接近正常的关节功能的方法。该方法可以包括对所述的狗饲喂包括浓度至少约为0.2％重量或浓度至少约为0.3％重量的EPA的组合物。

本发明还可以包括用于终止狗发生骨关节炎的可能性的方法。该方法可以包括对所述的狗饲喂包括浓度至少约为0.2％重量或浓度至少约为0.3％重量的EPA的组合物。

本发明用于恢复骨关节炎性狗的更接近正常的关节功能的方法还可以包括对所述的狗饲喂一种组合物，该组合物为基于包括脂肪酸成分的组合物，所述的脂肪酸成分包括恢复关节功能用量的EPA。

本发明用于终止狗发生骨关节炎的可能性的方法可以类似地包括对所述的狗饲喂一种组合物，该组合物为基于包括脂肪酸成分的组合物，所述的脂肪酸成分包括恢复关节功能用量的EPA。

本发明还可以包括用于终止狗发生骨关节炎的可能性的方法和用于恢复骨关节炎性狗的更接近正常的关节功能的方法，包括对所述的狗给予包括用量约37.5mg/kg体重、约56.25mg/kg体重、约75mg/kg体重或约93.75mg/kg体重的EPA的组合物。可以由动物食品组合物、动物治疗剂或动物补充剂包括这类组合物。

在不同的实施方案中，用于恢复骨关节炎性狗的更接近正常的关节功能的方法可以包括治疗狗的骨关节炎病或减轻该病的症状，且用于减少狗发生骨关节炎的可能性的方法包括预防狗发生骨关节炎病或减轻狗的该病症状表现。

本发明的方法还可以基于进一步包括如下用量的成分的组合物：总量不大于约3％重量的ω-6脂肪酸和/或比例约0.2-约1.1的ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸和或比例约1.0-约12.5的ω-6脂肪酸与EPA。

详细描述

本发明可以包括在控制哺乳动物且特别是狗中的骨关节炎性疾病和这类疾病的症状中给予ω-3脂肪酸，特别是EPA。

ω-3脂肪酸也称作n-3脂肪酸，认为它们是一组多不饱和脂肪羧酸类。一般来说，ω-3脂肪酸含有带有亚甲基打断的双键的12-26个碳原子。在生理上更重要的ω-3脂肪酸的长度为18-22个碳且是直链的。n-3脂肪酸在如从该分子的甲基端确定的第3-4碳原子之间带有双键。二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和α-亚麻酸(α-lenolenicacid)(ALA)为用于控制哺乳动物中的骨关节炎的重要的n-3脂肪酸且EPA在控制狗的骨关节炎中是特别重要的。ω-3脂肪酸的衍生物也可以用于控制骨关节炎。许多类型的衍生物是本领域技术人员众所周知的。合适的衍生物的实例为酯类，诸如ω-3脂肪酸，特别是EPA的支链或不饱和和/或饱和或不饱和C₁-C₃₀环烷基酯类，特别是C₁-C₆烷基酯类。

可以通过任意许多给药途径，诸如口服、鼻内、静脉内、皮下等对哺乳动物且特别是狗给予ω-3脂肪酸且特别是EPA。口服途经是特别合适的且可以通过口服给予湿或干膳食形式的EPA，可以将其混入膳食中或诸如通过喷雾、聚集、撒粉或沉淀在表面将其施加在任意膳食成分的表面上。它本身可以存在于营养膳食或点心、补充剂或治疗剂中。它还可以存在于膳食的液体部分中，诸如水或另一种流体。可以将EPA作为粉末、固体或作为液体，包括凝胶给药。如果需要，可以将EPA在营养或药物剂型中口服给药，诸如胶囊、片剂、胶囊形片剂、注射剂等。在所述剂型中，EPA可以作为方面或液体，诸如凝胶存在。可以使用任意的常用营养或药物载体，诸如水、葡萄糖、蔗糖等与EPA一起使用。

在某些实施方案中，本发明可以包括基本上不含DHA和/或ALA的EPA-膳食组合物。基本上不含DHA或ALA或其混合物的含义指的是DHA和ALA两者之一或它们两者基本上不存在或仅存在少量无关重要量的DHA或ALA两者之一或它们两者，例如低于约0.1％，低于约0.03％，低于约0.01％，低于约0.03％或低于约0.001％。在基本上不含DHA和/或ALA的实施方案中，存在的任意量的DHA和/或ALA的浓度足够低，使得在骨关节炎性狗中对骨关节炎疾病、骨关节炎发展或骨关节炎产生的症状基本上不产生作用。

ω-3脂肪酸且特别是EPA对各种形式的骨关节炎以及其它形式的关节炎，包括类风湿性关节炎均有效。

ω-3脂肪酸，EPA起预防关节软骨(cartilege)变性过程发展或减少变性过程和由此改善骨关节炎性狗，否则就是可能发生骨关节炎的狗的关节的作用。这种作用还包括ω-3脂肪酸的抗炎作用，而这种作用在犬的骨关节炎中具有的重要性较低，因为在骨关节炎中涉及的炎症有限。

如下文实施例中所示的涉及膝关节软骨的体外外植术的应用表明EPA是唯一显著减少糖胺聚糖(GAG)从软骨中诱导释放的ω-3脂肪酸。就预防关节因骨关节炎而受到损害而言，特定目标组的宠物，尤其是犬是那些可能需要这类与一般群体相反的预防性护理的动物。例如，宠物，特别是较大品种的犬类，诸如拉布拉多挽救猎犬、洛特维勒牧犬、德国牧羊犬等更易感骨关节炎，正如它在这些宠物中发生率更高所证实的。另外，大于6(6)岁龄的宠物，特别是狗具有更大的骨关节炎发生率。EPA还可以用于治疗患有骨关节炎的犬和猫。目前使用的EPA还可以为其它ω-3脂肪酸，诸如DHA和ALA以及ω-6脂肪酸，可以在诸如鱼油这类来源中找到相对大量的这些ω-3脂肪酸。

应使用的EPA的量可以显著改变。正如下文的实施例中所示，观察到了实际的剂量反应-EPA的含量越大，则抗关节炎作用约高。一般来说，至少约0.2wt％的最低用量基于满足以每日为基础的犬或猫的一般需求的营养膳食用量。例如，可以在常用营养食物定额中使用以每日为基础的具体的量或以每日为基础将在治疗剂或补充剂中的相同每日用量提供给动物。另外，只要能够提供有效量的EPA，则可以使用这些方法或任意其它给予方式的组合。以重量为基础，EPA的用量范围包括至少约0.2％，至少约0.25％，至少约0.30％，至少约0.4％，至少约0.5％，至少约0.6％至最高达约2％，至最高达约2.25％，至最高达约2.5％，至最高达约3％，至最高达约4％或至最高达约5％。应注意所有的wt％均以干物质为基础(DMB)。EPA为ω-3脂肪酸。一般来说，EPA或ω-3与ω-6脂肪酸之比可以显著改变。在不同的实施方案中，ω-6∶ω-3之比可以在约1.10-0.2的ω-6∶1.0的ω-3或约1.08-0.42的ω-6∶1.0的ω-3，且更具体地说，在约0.2、约0.25、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.8、约1.0或约1.0以上。在不同的实施方案中，ω-6与EPA之比可以在约12.5-约1.0的ω-6∶1.0的EPA或约12.4-1.12的ω-6∶1.0的EPA，且更具体地说，在约0.2、约0.25、约0.3、约0.4、约0.4、约0.6、约0.8、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3、约4、约5、约6、约7.5、约10、约12.5或约12.5。花生四烯酸AA(ω-6)与EPA之比可以为约0.28-约0.01的AA∶1.0的EPA到约0.28-0.08的AA∶1.0的EPA，且更具体地说为约0.01、约0.02、约0.04、约0.06、约0.08、约1.0、约1.5、约1.0、约1.5、约2.8或约2.8或以上。

可以以作为mg/kg体重计算的用量给予ω-3脂肪酸，且特别是EPA。因此，例如，可以预计20kg的狗消耗约275g膳食/天。对约27.5mg/kg体重、约41.25mg/kg体重、约55mg/kg体重、约68.75mg/kg体重或约82.5mg/kg体重的狗总计可以给予的EPA在膳食中的量分别约为0.2％、约0.3％、约4％、约0.5％或约0.6％重量。更具体地说，可以给予的EPA量约为20mg/kg体重、约28mg/kg体重、约30mg/kg体重、约40mg/kg体重、约41mg/kg体重、约50mg/kg体重、约55mg/kg体重、约60mg/kg体重、约69mg/kg体重、约70mg/kg体重、约80mg/kg体重、约82mg/kg体重、约90mg/kg体重、约100mg/kg体重、约120mg/kg体重、约150mg/kg体重或约150mg/kg体重或以上。

如上所述，EPA可以可以作为食品形式提供给宠物。这类食品的实例为可提供所有动物的营养物、治疗剂、补充剂等的普通膳食。可以在液体或药物剂型中提供EPA，诸如胶囊、片剂、丸剂、液体乃至非肠道给药，诸如通过注射器给予的剂型。最重要的方面在于应提供给宠物有效量的EPA以便预防或治疗骨关节炎。在不同的实施方案中，给药途径可以为口服且可以将EPA混入食品。在宠物食品工业中一般将食品分类为“湿品”或“干品”。湿食品具有相对高含量的水且通常存在于基本上或完全排除空气的罐或容器中。这类食品的实例为″大块和肉汤″、存在液体肉汤的单个固体颗粒或一般呈容器形状的长面包型的物质。干食品一般为烤制或优选挤压成形的物质，然后将后者切成单个成形的部分，通常称作粗碎物。易于通过常规方式将EPA混入湿食品。可以使用包囊以保护EPA不受干食品中的空气氧化。另外，还可以在包装中使用抗氧化剂和应用氮净化。这种情况以美国专利US4,895,725为典型，该文献中特别强调了具体鱼油的微囊化。具有高水平ω-3脂肪酸的油为油鲱油、鲑鱼油、鳕鱼油等。

本发明在不同的实施方案中还包括涉及给予包括EPA的组合物以减轻骨关节炎临床症候和与该病相关的疼痛的严重程度和频率，但没有显著的不良反应或副作用的方法。另外，本发明在不同的实施方案中提供了减缓动物骨关节炎性疾病临床发展的方法。还在不同的实施方案中提供了显著改善动物的骨关节炎总体情况的方法，使得可以通过骨关节炎性肢体承重增加来客观地确定这种有益作用。本发明还提供了涉及给予EPA与其它治疗骨关节炎的方式联用的方法，包括对动物给予药物和/或饲喂体重控制膳食，它们均是本领域中公知的。

实施例1

本实施例解释了由培养的犬软骨组织中的ω-3脂肪酸引起的糖胺聚糖的释放。

关节软骨获自狗的左和右后膝关节(股髁和胫骨坪)。将软骨外植体在含有10％胎牛血清的培养基中培养3天，然后在不含血清的培养基中洗涤3次。然后在不含血清的含有0、100或300μg/ml n3脂肪酸(EPA、ALA或DHA)的培养基中将外植体培养6天。在脂肪酸培养基中的该期限后，将所有外植体在不含脂肪酸/不含血清的培养基中洗涤3次。然后在1ml脂肪酸和不含血清的不含添加剂(C)、含有10^-6M视黄酸(RA)或50ng/ml制癌蛋白M(OSM)的培养基中将外植体分别培养4天。注意因软骨的可用性问题而导致并非所有的处理都能够对所有的狗进行。在终止培养时测定释放入培养基的蛋白聚糖(μg/mg湿重)。在下表中给出了4只狗中每只的一式三份培养物的糖胺聚糖(GAG)释放的平均值和标准偏差。此外，给出了每次处理的培养基乳酸盐(μg/mg湿重)浓度。

表1.^*

  第1只狗处理  GAG平均值  GAG标准偏差  n  GAG最小值  GAG最大值  乳酸盐平均值  乳酸盐标准偏差  C  1.363  .497  3  .849  1.84  26.07  33.7  C+载体  1.630  .306  3  1.31  1.92  21.95  22.6  C+100EPA  1.590  .291  3  1.29  1.87  23.85  25.4  C+300EPA  1.036  .528  3  .57  1.61  NA^**  RA  10.497  1.837  3  8.89  12.5  36  39.3  RA+载体  7.15  4.527  3  2.  10.5  33.067  45.4  RA+100EPA  8.677  1.999  3  6.61  10.6  29.367  34.8  RA+300EPA  1.593  1.696  3  .436  3.54  26.4  39.1  OSM  13.6  1.562  3  12.6  15.4  25.367  30.8  OSM+载体  14.25  6.44  3  7.35  20.1  27.4  33.8  OSM+100EPA  6.293  2.301  3  4.34  8.8  33.567  52.5  OSM+300EPA  2.167  1.93  3  .93  4.39  20.05  23.8

^*GAG＝糖胺聚糖；C＝不含血清、不含添加剂的培养基；EPA＝二十碳五烯酸；RA＝视黄酸；OSM＝制癌蛋白M。

^**未分析。

如表1中所示，GAG的释放因使用在OSM处理的培养物中100μg/ml EPA和使用在RA和OSM处理的培养物中300μg/ml EPA而显著减少。在使用任何剂量的EPA情况下，培养基中的乳酸盐浓度没有显著下降。

表2.^*

  第2只狗处理  GAG平均值  GAG标准偏差  n  GAG最小值  GAG最大值  乳酸盐平均值  乳酸盐标准偏差  C+载体  .503  .422  3  .127  .96  22.8  NA  C+100EPA  .340  .333  3  .1  .72  39.523  24.568  C+300EPA  .573  .46  3  .250  1.1  39.2  13.865  OSM+载体  11.7  5.11  3  7.1  17.2  26.9  4.766  OSM+100EPA  5.25  3.002  3  2.19  8.19  21.7  9.838  OSM+300EPA  2.83  .229  3  2.66  3.09  16.233  3.602  C+载体  .973  .222  3  .84  1.23  17.4  NA  C+100DHA  .640  .312  3  .45  1  21  6.265  C+300DHA  .843  .361  3  .43  1.1  36.2  NA  OSM+载体  8.73  .777  3  8.1  9.6  25.333  7.106  OSM+100DHA  8.567  4.219  3  3.7  11.2  28.133  2.715  OSM+300DHA  6.073  4.029  3  3.18  10.7  24.8  1.947  C+载体  .821  .684  3  .193  1.55  15.567  1.955  C+100ALA  1.12  .089  3  1.05  1.22  28.4  13.718  C+300ALA  .993  1.104  3  .14  2.24  41.667  14.958  OSM+载体  7.81  7.471  3  .26  15.2  51.7  28.488  OSM+100ALA  8.497  4.356  3  4.09  12.8  28.8  4.957  OSM+300ALA  6.42  2.730  3  3.44  8.8  55.233  30.305

^*GAG＝糖胺聚糖；C＝不含血清、不含添加剂的培养基；EPA＝二十碳五烯酸；RA＝视黄酸；OSM＝制癌蛋白M。

^**未分析。

如表2中所示，在OSM处理的培养物中，GAG的释放因使用EPA而显著减少，但使用ALA或DHA未产生这类结果。使用任何剂量的任何脂肪酸对培养基中的乳酸盐浓度没有显著影响。

表3.^*

  第3只狗处理  GAG平均值  GAG标准偏差  n  GAG最小值  GAG最大值  乳酸盐平均值  乳酸盐标准偏差  C+载体  2.727  .867  3  2.01  3.69  26.33  4.366  C+100ALA  2.117  .428  3  1.81  2.61  24.4  3.995  C+100DHA  1.903  .826  3  1.28  2.84  29.35  5.728  C+100EPA  1.673  .409  3  1.3  2.11  36.1  NA  C+300ALA  2.447  .321  3  2.14  2.18  20.75  7  C+300DHA  1.55  .73  3  .73  2.13  28.4  .566  C+300EPA  1.567  .387  3  1.3  2.01  10.525  10.854  RA+载体  20.823  .653  3  20.1  21.37  38.467  4.782  RA+100ALA  20.44  .903  3  19.4  21.02  43.233  2.281  RA+100DHA  21.093  6.881  3  13.38  26.6  45.667  8  RA+100EPA  16.223  6.654  3  8.61  20.93  41.533  2.515  RA+300ALA  24.467  2.987  3  21.1  26.8  44.733  4.821  RA+300DHA  19.457  2.389  3  17.28  22  47.967  9.139  RA+300EPA  1.537  .618  3  1.08  2.24  NA  NA  OSM+载体  12.773  5.845  3  6.36  17.8  37.867  11.547  OSM-100ALA  22.033  4.596  3  18.4  27.2  32.767  1.815  OSM-100DHA  11.667  6.007  3  5.5  17.5  32.267  11.467  OSM-100EPA  17.85  2.051  3  16.4  19.3  39.05  11.526  OSM-300ALA  23.467  3.102  3  20.3  26.5  34.033  1.38  OSM-300DHA  11.630  5.069  3  6.79  16.9  30.0  5.963  OSM-300EPA  8.1  6.767  3  3.79  15.9  21.467  1.93

^*GAG＝糖胺聚糖；C＝不含血清、不含添加剂的培养基；EPA＝二十碳五烯酸；RA＝视黄酸；OSM＝制癌蛋白M。

^**未分析。

如表3中所示，脂肪酸中没有一种显著改变GAG从这种特定动物中RA-和OSM-刺激的软骨中释放。没有与使用任何剂量的任何脂肪酸相关的培养基乳酸盐改变。

表4.^*

  第4只狗处理  GAG平均值  GAG标准偏差  n  GAG最小值  GAG最大值  乳酸盐平均值  乳酸盐标准偏差  C+载体  1.96  .533  3  1.51  2.55  22.933  4.75  C+100ALA  2.103  .107  3  1.98  2.17  20.533  3.478  C+100DHA  2.343  .331  3  2  2.66  19.1  2.352  C+100EPA  2.678  .996  3  1.72  3.71  23  6.183  C+300ALA  1.533  1.244  3  .13  2.5  29.167  22.074  C+300DHA  2.307  .361  3  1.93  2.65  24.933  3.4  C+300EPA  2.1  .455  3  1.64  2.55  24.767  13.004  RA+载体  14.113  3.89  3  9.64  16.7  34.533  12.368  RA+100ALA  12.547  6.348  3  5.94  18.6  39.933  11.594  RA+100DHA  11.28  9.123  3  4.79  18.9  25.6  11.766  RA+100EPA  14.393  2.9  3  11.23  16.93  32.967  4.219  RA+300ALA  14.093  6.138  3  8.98  20.9  59.367  31.166  RA+300DHA  11.3  6.815  3  3.5  16.1  25.333  11.684  RA+300E PA  9.093  1.316  3  8.26  10.61  25.1  4.67  OSM+载体  16.083  3.544  3  12.05  18.7  31.2  5.991  OSM+100ALA  11.7  2.19  3  9.43  13.8  26.333  9.25  OSM+100DHA  24.967  3.262  3  21.2  26.9  36.833  5.066  OSM+100EPA  15.883  4.316  3  11.95  20.5  27.237  6.34  OSM+300ALA  19.557  3.909  3  15.5  23.3  26.667  6.099  OSM+300DHA  16.4  6.27  3  9.4  21.5  36.233  20.342  OSM+300EPA  13.493  5.752  3  7.54  19.02  27.8  2.722

^*GAG＝糖胺聚糖；C＝不含血清、不含添加剂的培养基；EPA＝二十碳五烯酸；RA＝视黄酸；OSM＝制癌蛋白M。

^**未分析。

如表4中所示，EPA在300μg/ml下显著减少GAG从RA处理的培养物中释放，但并非任何其它脂肪酸在任何剂量下均可产生这类结果。在用300μg/ml OSM预处理的对照组、RA-和OSM-处理的培养物中培养基的乳酸盐浓度显著降低。

实施例2

本实施例解释n-3脂肪酸进入犬的软骨细胞(chondrocyle)膜。

使用单层培养物进行这些实验中的大部分，不过，在单一实验中，分析了将脂肪酸进入犬软骨的外植体培养物。

单层培养

在24或48小时内没有18∶3n-3脂肪酸ALA进入来自两只狗的软骨细胞。在单独的培养基中保温的软骨细胞中％18∶3n-3＜1到5(范围＝0.3-0.9％)且在与100或300μg/ml ALA一起保温24或48小时后，这一百分比没有显著改变(范围＝0.3-2.5％)。

在48小时内20∶5n-3脂肪酸EPA大量进入来自1只狗的软骨细胞。当用100或300μg/ml EPA处理48小时时，％20∶5n-3从＜1％(范围＝0.2-0.6％)增加到约7％(范围＝5.6-8％)。当在有或没有5％FCS存在下进行培养时，进入量是不同的。

在48小时内20∶5n-3脂肪酸EPA大量进入来自1只狗的软骨细胞，但18∶3n-3脂肪酸ALA没有此结果(每种脂肪酸的剂量为300μg/ml)。％20∶5n-3从＜1％增加到约15％。

3或6天内，20∶5n-3脂肪酸EPA大量进入来自1只狗的软骨细胞(剂量为μg/ml EPA EPA)。％20∶5n-3从＜1％增加至16-18％，在3-6天保温期间没有差异。

外植体培养

在6天内，明显进入20∶5n-3脂肪酸EPA来自1只狗的软骨外植体，但18∶3n-3DHA或n-6脂肪酸AA(花生四烯酸(arachadonic acid))未产生这类结果(每种脂肪酸的剂量为300μg/ml)。％n-320∶5从0％(无一种可检测到)增加到约2％。

这些数据表明EPA，但并非其它n-3脂肪酸进入单层或外植体培养物中的犬软骨细胞膜。

实施例3

本实施例解释了n-3脂肪酸对犬软骨细胞代谢的作用。

为了评价n-3脂肪酸对犬软骨中蛋白质和蛋白聚糖代谢的潜在作用，如实施例1中所述建立培养物，但最终培养4天，不加入分解代谢刺激物(即所有“对照”培养物)。在最终24小时的培养过程中，向培养基中加入(1)³⁵SO₄或(ii)³⁵S-甲硫氨酸和³⁵S-半胱氨酸以分别放射性标记新近合成的蛋白聚糖和蛋白质。在终止培养时测定进入软骨基质的放射性标记。未尝试对24小时标记期限内从软骨中缺失的放射性标记物质进行定量。作为DPM/mg湿重进入的³⁵SO₄(“PG”)或³⁵S-甲硫氨酸和³⁵S-半胱氨酸(“PROT”)的平均值和标准偏差如下表5中所示。

表5.^*

  处理  PG平均值  PG标准偏差  N  PROT平均值  PROT标准偏差  载体  292.667  53.144  3  574.333  198.336  100ALA  246.333  100.779  3  503.667  184.218  100DHA  156.0  82.529  3  503.667  81.365  100EPA  537.333  161.81  3  442.0  72.746  300ALA  443.0  205.385  3  393.667  34.962  300DHA  123.333  38.24  3  564.333  220.048  300EPA  275.667  161.661  3  504.0  44.542

^*PG＝以DPM/mg湿重计的³⁵SO₄进入量；PROT＝作为DPM/mg湿重的³⁵S-甲硫氨酸和³⁵S-半胱氨酸进入量；EPA＝二十碳五烯酸；DHA＝二十二碳六烯酸；ALA＝α-亚麻酸(α-lenolenic acid)。

正如表5中所示，任何n-3脂肪酸对蛋白质合成和进入基质均没有显著性作用。EPA在100μg/ml下显著增加蛋白聚糖合成和进入。没有其它剂量或脂肪酸可以显著改变蛋白聚糖合成和进入软骨基质。

逆转录-PCR用于测定基质蛋白酶(软骨聚集蛋白聚糖酶-1和-2)、环加氧酶-1 &-2、脂氧合酶-5和12以及潜在的自分泌细胞因子及其受体(例如IL-1、IL-6和TNF)的mRNA信息表达水平。

本研究结果发现软骨聚集蛋白聚糖酶-1和软骨聚集蛋白聚糖酶-2mRNA信息在“正常”犬软骨组织中得到表达。此外，某些狗表达了环加氧酶-2(COX-2)的mRNA信息，不过，在这些动物中没有关节病理学的体征。这使得监测n-3和n-6脂肪酸补充对未刺激的犬关节软骨外植体中软骨聚集蛋白聚糖酶和COX-2的mRNA表达的作用成为可能。EPA是唯一能够减少犬关节软骨中降解酶软骨聚集蛋白聚糖酶-1和软骨聚集蛋白聚糖酶-2的mRNA信息的脂肪酸。这证明了EPA″切断′导致软骨降解的基因的能力。

实施例4

本研究解释了ω-3脂肪酸在犬骨关节炎临床研究中的作用。

在临床诊断患有骨关节炎的宠物狗中进行三种临床研究。兽医全科医师和矫形外科转科医师登记了满足具体合格标准的就诊者拥有的狗。要求所有患者：基于宠物拥有者的病史记录和兽医体格检查而具有可测定的疾病临床表现的骨关节炎X线照片影像；否则基于体格检查、CBC、血液化学和尿分析认为健康且没有并发症；在本研究中登记前30天过程中，如果接受对骨关节炎开据处方的药物或补充剂，则维持治疗方案。

进行下列测定。

血清脂肪酸分布：通过气相色谱法测定它，包括用氯仿和甲醇混合物(2∶1)提取，使用三氟化硼-甲醇(BF₃:MeOH)试剂甲基化，随后进行火焰离子检测(FID)。通过将保留时间与已知标准品的保留时间进行比较并使用内标定量来鉴定脂肪酸甲酯类。

兽医临床评价：兽医进行体格检查并在筛选期过程中和临床试验过程中的每次饲喂间隔结束时对患者的骨关节炎情况进行临床评价。兽医评价了5种骨关节炎参数的严重程度：跛行、负重的勉强性、运动范围的减少、举起对侧肢体的勉强性和关节触诊时疼痛。在饲喂期间测定这些参数各自严重程度得分的改变。通过对全部5种单个参数的严重程度得分改变进行合并衍生出膳食介入对患者骨关节炎病的影响的综合兽医临床评价。

宠物拥有者的主观评价：要求宠物拥有者在参与本研究前登记调查表并在临床试验过程中的每次饲喂间隔结束时再登记调查表。

·登记调查表-宠物拥有者评定了观察到的犬骨关节炎的最常见体征的频率和严重程度，包括从休息状态起身的困难、跛行、强直、触摸时疼痛、行走过程中落在后面、疼痛中的吠或啜泣、攻击性行为、奔跑困难、行走困难、攀缘步伐困难、跳跃困难、玩耍困难、运动性和总体活动水平受损。此外，拥有者评定了其宠物的总体骨关节炎情况。

·饲喂调查表-宠物拥有者评定了登记过程中基准化的犬骨关节炎体征的频率和严重程度改变。此外，宠物拥有者评定了与骨关节炎相关的其动物疼痛的严重程度。

反作用力测定板步态分析：在第0天、6周和12周使用计算机化的生物力学反作用力测定板在各相应的机构评价狗。将所述的测定板固定在10m走道表面的中央并与该表面齐平。操纵器控制的快步跑的狗通过反作用力测定板且观察者对每次通过该板进行评价以证实足撞击和步态。如果存在不同的同侧前足和后足的撞击，而狗以1.7-2.0m/s的速度快步跑过反作用力测定板，其中加速改变为-0.5-0.5ms²，那么认为试验有效。在每次试验过程中，使用毫秒计时器和两个光电开关测定狗向前的速度。对每次试验进行录像以便评价和证实足撞击的有效性。周密考虑以确保狗触发计时器且在，每次试验过程中维持通过板一致的速度(如通过操纵器和观察者看出的)。

对每只狗的每一受患肢和各同侧肢获得了每一试验期的5次有效试验。测定峰值垂直力的直角地面反应力、垂直冲动、制动和前冲峰值力以及制动和前冲冲动并用专门的软件程序记录(Acquire，SharonSoftware，DeWitt，MI)。将所有力对按千克计的体重校准。取来自每侧肢的有效试验的数据的平均值而获得每一时间期限时每种力或冲动的平均值。

比较作为每一时间期限时跛行与同侧肢之间的百分比差的治疗组与对照组之间的地面反应力数据。在饲喂期开始和结束时比较有关跛行肢的地面力数据的百分比改变。

研究#1

进行犬的研究以便评价饲喂高水平的n-3脂肪酸对诊断为骨关节炎的狗的膳食作用。在本研究中补充了18位兽医全科医师来登记患者。将总计131只狗随机指定两种膳食治疗并饲喂180天。试验和对照食品具有相似的大量营养剂分布，但脂肪酸组成明显不同(表6)。试验膳食含有高水平的ALA、EPA和DHA且用低n-6/n-3比配制。对照组膳食为主要出售的商购狗食，它具有典型水平的n-3脂肪酸和工业用n-6/n-3比例特征。

表6.^*

  膳食营养物  对照食品(％)  试验食品(％)  蛋白质  23.2  19.9  脂肪(总)  13.9  13.6  CHO₂(NFE)  54.7  53.3  C18:3n-3(ALA)  0.12  2.8  C20:4n-6(AA)  0.03  0.06  C20:5n-3(EPA)  ＜0.01  0.38  C22:6n-3(DHA)  ＜0.01  0.31  n-6总和  1.99  2.53  n-3总和  0.09  3.48  n6/n3比  22.8  0.7

^*NFE＝作为不含氮的提取物的可溶性碳水化合物含量；ALA＝α-亚麻酸(α-lenolenic acid)；AA＝花生四烯酸；EPA＝二十碳五烯酸；DHA＝二十二碳六烯酸。

在0、45、90和180天时记录血清脂肪酸和宠物拥有者的评价。血清脂肪酸分布明显受到试验食品调节。在每次饲喂间隔结束时试验组具有显著高于对照组的n-3脂肪酸浓度(P＜0.01)，特别是EPA、DHA、a-ALA，显著低于对照组的AA浓度(P＜0.01)，和显著低于对照组的n-6∶n-3比(P＜0.01)(表7)。基于宠物拥有者的观察结果，试验组在第45天时与对照组相比在从休息起身、奔跑和玩耍方面显著改善且在90天和180天时行走显著改善(P＜0.05)，甚至在有强安慰剂作用存在下也是如此(表8)。

表7.^*

^*ALA＝α-亚麻酸(α-lenolenic acid)；AA＝花生四烯酸；EPA＝二十碳五烯酸；DHA＝二十二碳六烯酸^*

表8.^*

^*骨关节炎严重程度评定量表：1＝良好；2＝未改变；3＝恶化。

^**nsd＝无显著性差异。

研究#2

进行犬的研究以便评价饲喂高水平的n-3脂肪酸对诊断为骨关节炎的狗的膳食作用。在本研究中2位兽医矫形外科专科医师登记患者。将总计38只狗随机指定两种膳食治疗并饲喂90天。如上所述由相同批量的食品生产试验和对照膳食(表6)。试验膳食含有高水平的ALA、EPA和DHA且用低n-6/n-3比配制。

在0、45和90天时记录血清脂肪酸、反作用力测定板步态分析和兽医临床评价。血清脂肪酸分布明显受到试验食品调节。在每次饲喂间隔结束时试验组具有显著高于对照组的n-3脂肪酸血清浓度(P＜0.01)，特别是EPA、DHA、ALA，在第90天时显著低于对照组的AA浓度(P＜0.01)，和显著低于对照组的n-6∶n-3比(P＜0.01)(表9)。

表9.^*

^*ALA＝α-亚麻酸(α-lenolenic acid)；AA＝花生四烯酸；EPA＝二十碳五烯酸；DHA＝二十二碳六烯酸^*

使用反作用力测定板步态分析客观评价狗最严重的骨关节炎性肢的生物力学鉴定(表10)。垂直峰值力是为测定受侵害肢承重所测量的关键参数。就对照组而言，在90天饲喂期限中的平均垂直峰值力没有显著改变(P＝0.91)，而在试验组中的平均垂直峰值力显著增加(P＝0.01)。垂直峰值力的平均改变百分比在两组之间明显不同(P＜0.05)，表明试验组的受侵害肢的承重增加，而对照组在本研究过程中所表现出的承重没有改变。承重能力还可以通过展示每一膳食组的垂直峰值的百分比改变的频数分布来表示。在对照组中仅有31％的动物在90天饲喂后表现出承重改善，而在试验组中有82％的狗在本研究过程中增加了承重。

表10.

由兽医矫形外科医师进行的主观临床评价为试验膳食的有效性提供了附加的支持。基于综合兽医临床评价，经评价改善的方面在于消耗试验食品的狗的百分比显著高于消耗对照食品的狗(P＜0.05)。兽医专科医师还观察到在试验组中表现出关节触诊时疼痛减轻的狗的百分比高于对照组(P＝0.05)。

研究#3

进行犬的研究以便评价饲喂高水平的n-3脂肪酸对诊断为骨关节炎的狗的剂量作用。在本研究中28位兽医全科医师登记患者。将总计177只狗随机指定两种膳食治疗并饲喂90天。约三分之二参与本研究的狗除消耗所评价的治疗膳食外，还接受为治疗骨关节炎开据的药物和/或补充剂。三种试验食品具有相似的大量营养剂分布，但EPA和DHA在组成上改变，其中含有最低水平的变量A且含有最高水平的变量C(表11)。

表11.^*

^*NFE＝作为不含氮的提取物的可溶性碳水化合物含量；ALA＝α-亚麻酸(α-lenolenic acid)；AA＝花生四烯酸；EPA＝二十碳五烯酸；DHA＝二十二碳六烯酸。

在0、21、45和90天时记录血清脂肪酸、宠物拥有者和兽医评价的评价。血清脂肪酸分布明显受到所有膳食变量调节。在每次饲喂间隔结束时饲喂试验变量B&C的狗与饲喂试验变量A的狗相比，前者具有显著高于后者的n-3脂肪酸血清浓度(P＜0.01)，特别是EPA、DHA、ALA，前者具有显著低于后者的n-6脂肪酸浓度，特别是AA(P＜0.01)，且前者具有显著低于后者的n-6∶n-3比(P＜0.01)(表12)。

表12^*

^*ALA＝α-亚麻酸(α-lenolenic acid)；AA＝花生四烯酸；EPA＝二十碳五烯酸；DHA＝二十二碳六烯酸。

宠物拥有者报告14只消耗任意膳食变量21天的狗中有13只的各骨关节炎体征得到改善(表13)。另外，宠物拥有者报告14只消耗任意膳食变量90天的狗中有13只的各骨关节炎体征的严重程度得到减轻(表14)。宠物拥有者还报告在狗消耗任意膳食变量90天后可观察到的骨关节炎体征频率明显减少(表15)。

表13.

上述“p”值指的是第0天到第21天的平均值改变

表14.

宠物拥有者严重程度评定差异(天＝0-90)

上述“p”值指的是第0天到第90天的平均值改变

基于兽医临床评价报告消耗较高浓度n-3脂肪酸的狗比接受最低剂量的那些狗在骨关节炎病情方面具有更显著的改善且在骨关节炎发展方面具有更明显的减轻(表16)。在接受药物和/或补充剂与未含药的组之间的骨关节炎病情改善或骨关节炎发展减轻方面没有显著性差异(表17)。这表明治疗性膳食通过对患有骨关节炎的狗通过附加的有益作用而与其它疗法以协同方式起作用或至少不与其它疗法相抵触。

据报告在参与本研究的狗中不良反应或副作用的发生率极低。据报告在指定食品的215只动物中仅有5只狗发生腹泻和呕吐，这困难是因消耗了膳食变量之一所致。对消耗上述讨论的两种研究中的治疗性膳食的那些狗报告了不良反应或副作用相似发生率(对实施例1和2而言分别为1/88和1/26。

表15.

宠物拥有者频率评定差异(天0-90)

表16.

表17.

将本说明书中引述的所有参考文献引入本文作为参考。本文引述的所有讨论仅拥有概况其作者形成的主张，但不认为任何参考文献或其部分构成相关的现有技术。申请人保留挑战引述参考文献的准确性和适当性的权利。

本发明的描述实际上仅为典型的且由此不脱离本发明要点的变化形式均属于本发明的范围。并不将这类变化形式看做脱离本发明的实质和范围。