一种水产品中磺胺类和抗生素类药物多残留的分析方法

摘要

本发明涉及水产品组织中残留物的检测方法，尤其涉及一种水产品中磺胺类和抗生素类药物多残留的分析方法。它包括如下步骤：将填料和EDTA钠盐加入待检测的水产品组织中，混合得混料；用淋洗剂淋洗混料；用洗脱剂对淋洗所得混料进行洗脱得洗脱液；将洗脱步骤所得洗脱液浓缩后用溶剂溶解后过滤得滤液；HPLC测定：以缓冲溶液作为流动相将滤液进行HPLC测定。本发明方法能同时检测待测样品中磺胺类和四环素类药物的残留。

说明书

技术领域

本发明涉及水产品组织中残留物的检测方法，尤其涉及一种水产品中磺胺类和抗生素类药物多残留的分析方法。

背景技术

磺胺类药物和四环素类药物作为广谱抗菌药，在水产养殖中被广泛用作添加剂，用于防治肠道感染和促进生长。但如果使用不当，会引起毒性反应、二重感染和细菌产生耐药性等问题，对食品安全、生态环境和人体健康造成直接或潜在的危害，因此，兽药残留的检测研究一直是食品安全领域的研究重点。目前国内外对水产品中磺胺类药物、四环素类药物多残留检测技术报道很多，主要有高效液相色谱法、毛细管区域电泳法、气相色谱法、液相色谱-质谱法等，但所采用的方法并未涉及到上述两大类药物残留的同时检测。

现有的检测方法只能将上述两大类药物分开检测，费时费力。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时检测磺胺类药物和四环素类两大类药物在水产品中残留的方法。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种水产品中磺胺类和抗生素类药物多残留的分析方法，它包括如下步骤：

取样：将填料和EDTA钠盐加入待检测的水产品组织中，混合得混料；

淋洗：用淋洗剂淋洗混料；

洗脱：用洗脱剂对淋洗所得混料进行洗脱得洗脱液；

浓缩溶解：将洗脱步骤所得洗脱液浓缩后用溶剂溶解后过滤得滤液；

HPLC测定：以缓冲溶液作为流动相将滤液进行HPLC测定。

淋洗主要是洗掉肌肉中脂肪对残留药物的干扰，而肌肉中的兽药还留未洗下来；所用的淋洗剂可以是正己烷，也可以是其它淋洗剂例如3％的甲醇水溶液、1％的甲醇-草酸的混合水溶液等其它溶液，本领域普通技术人员可根据需要选取。作为本发明的优选，所述的淋洗剂为正己烷。

所述的洗脱剂是甲醇水溶液、甲醇和乙腈的混合溶液、纯甲醇、纯乙腈。

所述的缓冲溶液可以是草酸-甲醇的缓冲溶液、磷酸-甲醇的缓冲溶液、醋酸-乙腈的缓冲溶液，本发明优选草酸-甲醇的缓冲溶液。

由于动物性水产品中兽药残留物水平很低，样品基质复杂，干扰物质多，要尽可能除去与目标物同时存在的杂质，减少色谱干扰峰，避免检测器和色谱柱污染。因此，样品的分离纯化是兽药残留分析中最费时、费力的一个瓶颈步骤。多类兽药残留集成化检测技术和兽药提取分离技术已经成为了当今的研究热点，本发明将带检测组织在固态时分散到基质中，然后通过液相萃取的方法获得各组分，这种方法应用于待测样品的检测时，其色谱干扰峰较少。

本发明选择EDTA钠盐作为络合剂，降低了杂质，能够全面获得待测样品中磺胺类和抗生素类药物残留，取得了良好效果。在混合步骤中需要待测样品捣碎与填料和钠盐混合均匀以得到较好的效果。

本发明中填料的作用是(1)兽药残留在鱼肉组织中分散均匀，更有利于药物残留的洗脱；(2)在研磨的过程中可起到干燥作用，也有利于兽药残留的洗脱。它可以是三氧化二铝、硅藻土等填料，本发明优选C18填料。

本发明所述的草酸-甲醇缓冲液的pH值可以在2.0～4.0间，甲醇为色谱纯。

本发明基质固相分散萃取技术应用于这两类药物的同时检测其节省时间、节约分析成本、减少环境污染；它能在较短的时间内分析出这两大类药物残留，有效解决了基质中大部分干扰物质的影响，方法简便、精密度和准确度均能达到残留分析的要求。尤其是在样品前处理过程中添加了EDTA钠盐后提高了四环类物的洗脱效率；在样品分析时，流动相中用草酸的缓冲溶液，而不是常用的醋酸或磷酸的缓冲溶液，有利于四环素类药物的稳定，防止它们分解。

为了更好络合待测样品中的各种待测物，作为本发明的优选，所述的EDTA钠盐的重量为水产品组织的0.4～0.6倍，更为优选的是0.5倍。

作为本发明的优选，所述淋洗剂、洗脱剂的用量分别为水产品组织重量的6～9倍之间。淋洗剂、洗脱剂的用量可相同也可不同。更为优选的是所述的淋洗剂为正己烷，它与二次淋洗液的用量相同且为水产品组织重量的8倍。

作为本发明的优选，所述浓缩溶解步骤具体为：将洗脱液在30～40℃转蒸发至近干，再用空气流吹干，然后加入重量为水产品组织的1～2倍的40％(体积比)甲醇水溶液溶解残渣，过滤。

作为本发明的优选，所述的过滤所采用的滤膜为0.40～0.50μm滤膜。

作为本发明的优选，所述缓冲溶液的pH值为2.0～4.0。更为优选的是，所述缓冲溶液为草酸-甲醇的缓冲溶液。

作为本发明的优选，所述的HPLC测定采用梯度洗脱的方式，具体是：0～5min 80∶20(V/V，体积比)，6～20min 75∶25(V/V，体积比)，21～30min80∶20(V/V，体积比)。0～5min 80∶20(V/V，体积比)即分析测试时间在0～5分钟内，草酸的缓冲溶液体积百分比为80％，色谱纯甲醇的体积比为20％。

作为本发明的优选，所述的HPLC测定的测定波长为265nm；流动相流速为0.70～0.9mL/min，更为优选的是0.8mL/min；柱温为23～27℃，更为优选的是25℃；进样量为18～22μL，更为优选的是20μL。

作为本发明的优选，所述一次洗脱和二次洗脱的流速为1min40～70滴，更为优选的是1min 60滴。

综上所述，本明具有以下有益效果：

1.本发明方法能同时检测待测样品中磺胺类和四环素类药物的残留；

2.本发明方法，所用的溶剂少，减少了有毒废弃物的污染，对环境友好，符合目前环保理念的待测样品中兽药残留分析方法的要求。

3.本分析方法操作简便、分析时间短、成本低。

具体实施方式

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

发明人通过实验发现，将带检测的待测样品样品和C18填料研磨混合、装柱、淋洗、洗脱、富集、净化、HPLC测定。待测化合物采用C18柱分离，以3％草酸缓冲溶液-甲醇的混合溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.80mL/min，二极管阵列检测器检测，检测波长265nm。结果表明：加标浓度为0.10ppm、0.20ppm和0.50ppm时，磺胺类药物平均加标回收率73.8～93.8％，相对标准偏差在2.8～9.2％之间；四环素类药物平均加标回收率79.1～91.1％，相对标准偏差在3.5～8.7％。与文献中的分析方法相比，这种检测方法操作简便、分析时间短、成本低。

下述实施例是本发明的具体实验过程。

实施例一：

称取1.0g加标浓度为0.10ppm混合均匀的鱼肉置于玻璃研钵中，并加入1.0g甲醇处理过的C18填料和0.5gEDTA钠盐，用玻璃杵研磨5min左右，使鱼肉和填料混合均匀。取下端带有滤膜垫片的10mL注射器，将样品装柱，上面垫滤纸轻轻压紧。用10mL正己烷洗涤1次(流速为1min 60滴)，真空抽干(弃去淋洗液)；再用10mL乙腈洗脱(流速为1min 60滴)，真空抽干。洗脱液在35℃转蒸发至近干，再用空气流吹干，然后加入2mL 40％(体积比)甲醇水溶液溶解残渣，过0.45μm滤膜后，进行HPLC测定。以草酸-甲醇的缓冲溶液为流动相，pH约为3.0；梯度洗脱：0～5min 80∶20(V/V，体积比)，6～20min 75∶25(V/V，体积比)，21～30min80∶20(V/V，体积比)；测定波长265nm；流动相流速为0.80mL/min；柱温为25℃；进样量为20μL。磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二基嘧啶、磺胺甲基异噁唑、土霉素和四环素的加标回收率分别为：85.1％、89.6％、73.8％、91.6％、79.1％和82.5％；相对标准偏差在4.1～9.2％之间。

实施例二：

称取1.0g加标浓度为0.20ppm混合均匀的虾肉置于玻璃研钵中，并加入1.0g甲醇处理过的C18填料和0.5gEDTA钠盐，用玻璃杵研磨5min左右，使虾肉和填料混合均匀。取下端带有滤膜垫片的10mL注射器，将样品装柱，上面垫滤纸轻轻压紧。用10mL正己烷洗涤1次(流速为1min 60滴)，真空抽干(弃去淋洗液)；再用5mL甲醇和5mL乙腈洗脱(流速为1min 60滴)，真空抽干。洗脱液在35℃转蒸发至近干，再用空气流吹干，然后加入2mL 40％(体积比)甲醇水溶液溶解残渣，过0.45μm滤膜后，进行HPLC测定。以草酸-甲醇的缓冲溶液为流动相，pH约为3.0；梯度洗脱：0～5min80∶20(V/V，体积比)，6～20min 75∶25(V/V，体积比)，21～30min80∶20(V/V，体积比)；测定波长265nm；流动相流速为0.80mL/min；柱温为25℃；进样量为20μL。磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二基嘧啶、磺胺甲基异噁唑、土霉素和四环素的加标回收率分别为：81.8％、92.6％、76.9％、82.6％、81.2％和91.1％；相对标准偏差在2.8～8.7％之间。

实施例三：

称取1.0g加标浓度为0.50ppm混合均匀的蟹肉置于玻璃研钵中，并加入1.0g甲醇处理过的C18填料和0.5gEDTA钠盐，用玻璃杵研磨5min左右，使蟹肉和填料混合均匀。取下端带有滤膜垫片的10mL注射器，将样品装柱，上面垫滤纸轻轻压紧。用10mL正己烷洗涤1次(流速为1min 60滴)，真空抽干(弃去淋洗液)；再用10mL草酸和乙腈的混合溶液洗脱(流速为1min 60滴)，真空抽干。洗脱液在35℃转蒸发至近干，再用空气流吹干，然后加入2mL 40％(体积比)甲醇水溶液溶解残渣，过0.45μm滤膜后，进行HPLC测定。以草酸-甲醇的缓冲溶液为流动相，pH约为3.0；梯度洗脱：0～5min80∶20(V/V，体积比)，6～20min 75∶25(V/V，体积比)，21～30min80∶20(V/V，体积比)；测定波长265nm；流动相流速为0.80mL/min；柱温为25℃；进样量为20μL。磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二基嘧啶、磺胺甲基异噁唑、土霉素和四环素的加标回收率分别为：93.1％、92.6％、86.4％、93.8％、85.6％和80.7％；相对标准偏差在3.2～6.5％之间。