用于妊娠高血压综合症检测的hsa－mir－210试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及医学生物检测技术领域。妊娠高血压综合症是目前孕、产妇和胎、婴儿死亡的主要因素之一，目前的检测方法主要依靠临床上已出现的症状同时结合一些生化指标进行，而实际上妊高症病因早在妇女怀孕初期即存在，临床上缺少早期检测标志物用来早期检测和干预该病。本发明的目的在于提供一种用于妊娠高血压综合症检测的hsa－mir－210试剂盒，及其检测方法。本发明是通过检测血浆或血清中的hsa－mir－210含量的变化，从而能够更加有效的对妊娠高血压综合症患者进行早期检测，以及早发现妊高症的高危对象，及时进行有效干预，减少妊高症及其相关并发症的发生。

说明书

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，是一种通过血浆或血清中hsa-mir-210的含量变化，来检测妊娠高血压综合症发生发展的试剂盒，及其检测方法。

背景技术

妊娠高血压综合症(妊高症)是一个由于多系统紊乱而导致的妊娠期特有疾病，多发生于妊娠20周之后。临床表现为高血压、蛋白尿、水肿，严重者有头痛、头晕、视物模糊等自觉症状，若没有及时治疗，可能会引起全身性痉挛甚至昏迷，也会造成肾脏、肝脏和大脑的机能紊乱及凝血紊乱，是目前孕、产妇和胎、婴儿死亡的主要因素之一，其中子痫迄今仍是孕产妇死亡的首要因素。

妊高症目前的检测方法主要依靠临床上已出现的症状同时结合一些生化指标进行，而实际上妊高症病因早在妇女怀孕初期即存在，因此临床上缺少通用的早期检测标志物用来早期检测和干预该病。

MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，通过与靶基因的非编码区结合抑制翻译来调控基因的表达。miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢和细胞分化，因此miRNAs可能有非常广泛多样的生物功能。同时，在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性，提示miRNAs有可能作为参与调控基因表达的分子，因此具有重要意义。有研究证实，miRNA在血浆中非常稳定，它们通过一些小分子微颗粒被有效保护以免接触RNases，在变化环境的条件下仍能保持稳定。目前有研究表示，胎盘中存在着大量的miRNA，这提示着它们在胎盘中的表达方式很可能对胎盘-胎儿的生长发育起着重要的作用。

has-mir-210(Mature sequence MIMAT0000267)是一种在人的胎盘中特异性表达的microRNA，同时在缺氧的情况下，其含量急剧升高(Fasanaro P，D ′Alessandra Y，Di Stefano V，Melchionna R，Romani S，Pompilio G，Capogrossi MC，Martelli F.MicroRNA-210 modulatesendothelial cell response to hypoxia and inhibits the receptor tyrosinekinase ligand Ephrin-A3.J Biol Chem.2008 Jun 6；283(23)：15878-83.Epub 2008 Apr 16.)。研究显示，妊高症发生的要素之一正是由于胎盘缺氧，胎儿与母体的物质交换发生障碍，从而导致滋养层细胞凋亡明显增加，引发下游一系列的调控机制改变(Fisher SJ.The placentalproblem：linking abnormal cytotrophoblast differentiation to the maternalsymptoms of preeclampsia.Reprod Biol Endocrinol.2004 Jul 5；2：53.)。

目前并没有任何关于将has-mir-210作为检测妊高症发生发展标志物的相关报道。鉴于研究者在人体外周血中检测到microRNA并证实它能够保持稳定，

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于妊娠高血压综合症检测的hsa-mir-210试剂盒，及其检测方法。

本发明拟通过检测在健康孕妇与妊高症孕妇外周血中has-mir-210的表达含量差异，来检测妊高症及其并发症的发生发展，以期提早干预，尽早缓解患者及胎儿可能存在的危险。

本发明的检测妊娠高血压综合症发生发展的hsa-mir-210检测试剂盒，是通过检测血浆或血清中的hsa-mir-210含量的变化，从而能够更加有效的对妊娠高血压综合症患者进行早期检测，以及早发现妊高症的高危对象，及时进行有效干预，减少妊高症及其相关并发症的发生。

本发明通过对健康人群与妊高症患者血浆中hsa-mir-210的含量比较；以及对妊娠期高血压、轻度先兆子痫、重度先兆子痫三种不同病情的妊高症患者血浆中hsa-mir-210的含量比较，发现：妊娠期高血压患者血浆中hsa-mir-210含量高于健康人群，约是健康人群的3倍；轻度先兆子痫患者血浆中hsa-mir-210含量明显高于健康人群，约是健康人群的5倍左右，病情发展到重度时，血浆当中hsa-mir-122的含量最高，约是健康人群的7倍左右。这个结果显示了随着妊高症病情发展，hsa-mir-210的含量从低变高的变化过程，这一趋势可作为妊娠高血压综合症的早期检测手段。

本发明提供一种早期预测妊娠高血压综合症的hsa-mir-210检测试剂盒，该试剂盒由反转录系统、引物系统和扩增系统组成，其中的引物系统由特异性的hsa-mir-210反转录引物及Real-time PCR的上、下游引物组成。

hsa-mir-210反转录引物为：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGCCGCT(SEQ ID NO：1)；

Real-time PCR上游引物为：ACGATGCTGTGCGTGTGAC(SEQ IDNO：2)；

Real-time PCR下游引物为：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ IDNO：3)。

本发明试剂盒的引物是根据已知的生物信息学查得hsa-mir-210的成熟体序列而设计的(详见http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)，包括其特异性的反转录引物、Real-time PCR的上下游引物均通过Primer 5引物设计软件设计。

hsa-mir-210的成熟体序列：CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA(SEQ ID NO：4)

上述试剂盒的反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成，扩增系统由SYBR Premix Ex Taq^TM试剂组成。

本发明的试剂盒，具体组成如下：

A)hsa-mir-210反转录引物(SEQ ID NO：1)，1管，浓度：10μM，100μl/管；

B)Real-time PCR上游引物(SEQ ID NO：2)，1管，浓度：10μM，100μl/管；

Real-time PCR下游引物(SEQ ID NO：2)，1管，浓度：10μM，100μl/管；

C)Trizol reagent(总RNA提取试剂)，1管，2000μl/管

D)氯仿1管，500μl/管；

E)无水乙醇1管，7ml/管；

F)DEPC H₂O(经焦炭酸乙二酯处理的纯水)1管，1000μl/管

G)dd H₂O(双蒸水)1管，2000μl/管。

使用本发明试剂盒早期检测妊娠高血压综合症，首先，将若干已知的健康人、妊高症患者编组，用本发明试剂盒分别检测健康人组、妊高症患者组血清中hsa-mir-210含量，以此作为对照的标准数据。再用相同的方法检测未知患者血浆中hsa-mir-210含量，对照上述标准数据，即可初步确定该患者是否为健康人，若非健康人群，则了解其患病程度如何，以便进一步确诊治疗。

本发明还提供上述妊高症的hsa-mir-210检测试剂盒的检测方法，如下：

按常规抽血取血清或血浆，用总RNA提取试剂处理血清或血浆，加氯仿离心后取上层水相，并富集血清或血浆中的小RNA；由反转录系统反转录hsa-mir-210成cDNA；用扩增系统进行Real-time PCR扩增，测定hsa-mir-210含量。

附图说明

图1：定量RT-PCR验证健康孕妇与妊高症孕妇血浆中has-mir-210的差异表达柱状图；

图2：定量RT-PCR验证不同分期的妊高症孕妇间血浆中has-mir-210的差异表达柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1：制备本发明的试剂盒(供一人用)

本发明的试剂盒组成如下：

1.反转录引物1管，100μl/管浓度：10μM反转录引物为：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGCCGCT

2.Real-time PCR的上、下游引物各1管，100μl/管浓度：10μM；

上游引物为：ACGATGCTGTGCGTGTGAC

下游引物为：GTGCAGGGTCCGAGGT

3.Trizol reagent  1管 2000μl/管

4.氯仿            1管 500ul/管

5.无水乙醇        1管 7ml/管

6.DEPC H₂O        1管 1000μl/管

7.dd H₂O          1管 2000μl/管。

本发明根据已知的生物信息学查得hsa-mir-210的成熟体序列CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA，其特异性的反转录引物、Real-time PCR的上下游引物均通过Primer 5引物设计软件设计，由美国invitrogen公司负责引物合成。

设计的引物序列如下：

(1)反转录引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGCCGCT(SEQ ID NO：1)

(2)Real-time PCR的上下游引物：

上游引物：ACGATGCTGTGCGTGTGAC(SEQ ID NO：2)

下游引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO：3)

制备包括下列组成成分的试剂盒：总RNA提取试剂、氯仿、无水乙醇、特异性hsa-mir-210反转录引物(100μl/管浓度：10μM)、特异性的hsa-mir-210上游引物(100μl/管浓度：10μM)、下游引物(100μl/管浓度：10μM)、DEPC H₂O(1000μl/管)、dd H₂O(2000μl/管)

DEPC H₂O的配置：用购买的DEPC(焦碳酸二乙酯)，纯度＞99％，密度为1.12g/ml，配置DEPC H₂O。100ml MiliQ纯水中加0.1mlDEPC，放在100ml干烤过的容量瓶中静置4小时后高压灭菌，制成千分之一浓度的DEPC H₂O，经检测不含RNase、DNase和proteinase。用来溶解合成的反转录引物，并作为反转录时的稀释用水。

dd H₂O的配置：MiliQ纯水经高压灭菌后，配置成Real-timePCR用的dd H₂O。

特异性hsa-mir-210反转录引物：通过Primer 5引物设计软件设计，由美国invitrogen公司负责引物合成，纯度为PAGE级，合成后的引物用DEPC H₂O溶解，终浓度为10μM。

特异性的hsa-mir-210上下游引物：通过Primer 5引物设计软件设计，由美国invitrogen公司负责引物合成，纯度为PAGE级，合成后的引物用dd H₂O溶解，终浓度为10μM。

实施例2：本发明的试剂盒的检测

一、采集血浆样本及样本准备：

由于血浆具有取材方便，无创伤性，并可连续检测的优点，因此从血浆中检测妊娠高血压综合症的生物标志物可以将检测妊高症技术提高到一个新的水平，从而达到早预防、早治疗的目的。

血浆样本分别在上海长海医院妇产科和安徽医科大学第一附属医院妇产科采集，并分为以下四组：(1)妊娠高血压孕妇(n＝10)；(2)轻度先兆子痫孕妇(n＝10)；(3)重度先兆子痫孕妇(n＝10)；(4)健康孕妇作为对照组(n＝10)。所有患者与健康孕妇的孕周差异不超过2周，临床诊断均符合国际上对于妊高症的诊断标准。

样品的收集：收集约4ml病人的外周血加入含50mmol EDTA抗凝剂的试管中，离心处理。

二、采集血浆样本的处理及提取其中的小RNA：

(1)血浆样本的处理

外周血样品采取两步离心法，在4℃的条件下，首先以1600g/10min离心，将上清液加入新的离心管中，再以16000g/10min离心，取上清液并以1∶0.8的比例加入Trizol reagent(即0.8ml血浆中加入1ml Trizol reagent)。

(2)microRNA的提取

将已添加Trizol reagent的样本混匀，放置冰上15min后，在4℃的条件下以1000g/10min离心，取上清，添加入1.5ml的EP管中，并以1∶0.25的比例加入氯仿(即1ml上清中加入400ul氯仿)，摇晃混匀，放置冰上10min左右，在4℃的条件下以12000g/15min离心，取上层水相。之后的步骤参照Applied Biosystems公司购买的mirVana miRNA Isolation Kit说明书中提取miRNA的步骤进行。使用Eppendorf紫外分光光度仪测定RNA的A260值和A260/A280的比值(1.8-2.2)，以评估其浓度和质量。符合定量检测要求的样本进行下一步反应。

三、miRNA的实时定量

1.反转录成hsa-mir-210的cDNA

取富集液50ng为模板，以设计的特异性hsa-mir-210反转录引物进行反转录。按照5×PrimeScript^TM Buffer(for Real Time)4μl、PrimeScript^TM RT Enzyme Mix 0.5μl(PrimeScript^TM RT reagent Kit)(TaKaRa公司)、hsa-mir-122反转录引物0.5μl、富集的小RNA 50ng、DEPC H₂O(补充H₂O使总体积达到20μl)进行反转录。以上步骤所用的tip头、EP管均经过DEPC水处理后高压灭菌。

2.Real-time PCR定量miRNA

采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq^TM试剂和美国AppliedBiosystems公司的：Step Plus One实时定量PCR仪，按照下述体系进行PCR反应：

Premix Ex Taq^TM(2×)                    10μl

上游引物(10μM)                         0.4μl(终浓度0.2μM)

下游引物(10μM)                         0.4μl(终浓度0.2μM)

ROX Reference Dye(50×)                 0.4μl

反转录产物                              1μl

双蒸水                                  7.8μl

总体系                                  20μl

经过预实验确立了hsa-mir-210引物的合适退火温度，最终确定以下条件：

本实验采用标准反转录产物倍比稀释法建立标准曲线，每20μl体系分别添加标准反转录产物2，1，0.5，0.25，0.125μl，每种浓度设立3个平行复管。

按照上述Real-time PCR条件，对前期制备的各样本的反转录产物进行检测。每批次PCR均设立标准曲线作为批次间参照，并依据标准曲线设立CT值阈值。每样本均做3个平行复管，取其平均值分析，每个PCR测定中都包括阴性(水)对照。为防止污染，所有反应均在专区的清洁实验台进行，模板添加和引物添加不在同区操作。为防止引物二聚体和非特异性扩增，所有反应均在冰上操作。

获得的各样本hsa-mir-210表达量均由标准曲线转换为相对定量值，目标基因表达量/持家基因U 6表达量进行标准归一化处理。最终获得比值进行比较和统计分析。通过2^-ΔΔCt法计算hsa-mir-210在妊娠高血压综合症患者血浆当中的相对表达量，妊高症患者血浆中hsa-mir-210的表达平均水平均为健康人表达水平的倍数，健康人外周血中的hsa-mir-210量视为1。

实施例3：健康孕妇与妊高症孕妇相比血浆中mir-210含量的比较

将采集的所有妊高症孕妇血浆中has-mir-210与健康孕妇血浆中的has-mir-210作比较，采用t检验，结果P＜0.05，认为妊高症孕妇血浆中has-mir-210的平均含量高于健康孕妇。(见图1)

实施例4：三种不同病情的妊高症孕妇血浆中mir-210的含量比较

我们选择了3类不同病情发展情况的妊高症孕妇：妊娠高血压孕妇、轻度先兆子痫孕妇、重度先兆子痫孕妇。分别对这3种类型病人血浆中的hsa-mir-210进行检测，与健康人群血浆中hsa-mir-210比较后发现，妊高症孕妇血浆中hsa-mir-210含量高于健康人群，约是健康人群的3倍左右。病情发展到轻度先兆子痫时，血浆当中hsa-mir-210的含量随之升高，约是健康人群的5倍左右(P＜0.05)。当发展成为重度后，hsa-mir-210含量最高，但平均含量约是健康人群的7倍左右(P＜0.05)(见图2)。

SEQUENCE LISTING

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>用于妊娠高血压综合症检测的hsa-mir-210试剂盒及检测方法

<130>说明书，权利要求书

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcagcc gct    53

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

acgatgctgt gcgtgtgac                                          19

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gtgcagggtc cgaggt                                             16

<210>4

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<400>4

cugugcgugu gacagcggcu ga                                      22