改良toll样受体5刺激活性的修饰的鞭毛蛋白

摘要

本发明公开了具有增强的toll样受体－5(下文称为“TLR5”)刺激活性的鞭毛蛋白突变体。更具体而言，本发明公开了由点突变TRL5激动剂鞭毛蛋白的某些氨基酸以增强鞭毛蛋白的TRL－刺激活性而制备的鞭毛蛋白突变体。

说明书

技术领域

本发明涉及具有增强的toll样受体-5(下文称为“TLR5”)刺激活性的鞭毛蛋白突变体，特别涉及由点突变TRL5激动剂鞭毛蛋白的某些氨基酸以增强鞭毛蛋白的TLR5刺激活性而制备的鞭毛蛋白突变体。

背景技术

鞭毛是决定细菌运动性的重要结构元件，其通常由钩状体、基体和丝状体所组成。已知鞭毛有助于游动或集群运动、细菌趋向性、病原微生物对宿主细胞的粘附和生物膜的形成。形成鞭毛丝状体的亚基蛋白被称为鞭毛蛋白，鞭毛蛋白规则地装配形成丝状体。Hayashi等公开了哺乳动物细胞中表达的TLR5可识别革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的鞭毛蛋白而激活NF-κB(Hayashi F，Smith KD，Ozinsky A，Hawn TR，Yi EC，Goodlett DR，Eng JK，Akira S，Underhill DM，AderemA：Nature 410：1099-1103，2001)。

Toll样受体(TLRs)是典型的“模式识别受体(PRRs)”，它识别存在于病原体中的“病原体相关分子模式(PAMPs)”，且不仅在哺乳动物中发现了该受体，还在昆虫和植物细胞的表面发现该受体。至今已发现十三种TLRs，这积极地引导了对TLRs激动剂的研究(Akira S，Uematsu S，Takeuchi O：Cell 124(4)：783-801，2006)。

PRRs(例如TLRs)分布在宿主细胞的表面或细胞质中，在受到多种PAMPs刺激之后，PRRs能诱导先天性免疫应答，而且调节适应性免疫应答。因而，TLR激动剂可作为适合于开发多种免疫调节剂(尤其是疫苗佐剂)的靶点。

在本文中，术语“疫苗佐剂”指在与疫苗共同给药时，可以增强、延长或加速由疫苗抗原诱导的Ag-特异性免疫应答的物质。批准用于人体的疫苗佐剂包括磷酸铝，氢氧化铝，和角鲨烯乳化剂。疫苗佐剂必须满足以下五个要求中的至少一个：1)调节共刺激分子在抗原呈递细胞表面上的表达，诱导抗原特异性T淋巴细胞应答，或免疫调控(例如调控细胞因子的分泌)；2)抗原呈递；3)诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞应答；4)靶向作用；和5)形成贮存。

理想的疫苗佐剂：1)必须是安全的；2)必须是在体内可生物降解的；3)与抗原单独给药时相比，必须显示有效的预防性或治疗性免疫应答；4)必须是经化学或生物验证的物质；5)优选在浓度低于抗原时起作用；和6)必须具有长的半衰期，以便它们可以容易地用于商业或临床应用。

目前用作疫苗佐剂或可考虑用作疫苗佐剂的物质包括：1)矿物盐，例如氢氧化铝凝胶；2)表面活性剂物质；3)细菌衍生的物质；4)细胞因子或激素；5)聚阴离子；6)聚丙烯基；7)载体；8)含病毒的活体载体；和9)赋形剂，例如矿物油脂质体。其中，目前正被活跃研究且受到很大关注的蛋白衍生的疫苗佐剂包括霍乱弧菌(Vibrio cholerae)衍生的霍乱毒素(CT)和大肠杆菌(Escherichia coli)衍生的不耐热毒素(LT)。据报导这些疫苗佐剂诱导在粘膜区和血浆中产生抗原特异性抗体，并诱导B7-2在抗原呈递细胞(APCs)表面的表达以刺激CD4+辅助T细胞的共刺激信号。但是，这些佐剂是具有高肠毒性的外毒素，因而正在进行有关降低它们的毒性和增强它们的佐剂活性的研究。

如PCT国际专利公开文本WO 2005/070455中所公开的，本发明人构建了转座子突变体文库以筛选创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的粘附和入侵因子，并分析了已丧失对宿主细胞的粘附和运动性的三个克隆的Tn侧翼区，结果本发明人鉴别了两个含56个基因的鞭毛操纵子。在这个分析过程中，发现创伤弧菌总共有六个鞭毛蛋白基因(flaA、flaB、flaF、flaC、flaD和flaE)，其中flaB基因是该鞭毛蛋白的主要组分。本发明人研究了创伤弧菌的极性鞭毛蛋白成分——鞭毛蛋白重组蛋白(FlaB)可作为针对创伤弧菌的组成疫苗的可能性，结果本发明人发现了鞭毛蛋白重组蛋白(FlaB)除具有高抗原性以外，还具有强的疫苗佐剂效力。为解释这个发现，本发明人进行了进一步的研究。结果证明了当疫苗抗原破伤风类毒素与鞭毛蛋白一起施用于试验动物鼻腔时，所述鞭毛蛋白通过将信号传递给宿主细胞的TLR5以激活免疫系统而扩大了疫苗效力，当致死剂量的破伤风毒素攻击通过施用破伤风毒素和鞭毛蛋白而免疫的小鼠时，所述鞭毛蛋白诱导了对毒素的完全的防御免疫，表明所述鞭毛蛋白具有优异的粘膜疫苗佐剂效力(Lee SE，Kim SY，JeongBC，Kim YR，Bae SJ，Ahn OS，Lee JJ，Song HC，Kim JM，Choy HE，Chung SS，Kweon MN，Rhee JH.：Infect.Immun.74：694-702，2006)。

在多种TLR激动剂中，刺激TLR5的鞭毛蛋白是一种不同于其他TLR激动剂(CpG-DNA、MLP(支原体脂肽))的蛋白质组成。因而，可以合成特性可被持续控制的重组鞭毛蛋白，此外，可以构建多种具有增强的TLR5刺激活性的重组融合蛋白。

根据对鞭毛蛋白三维结构的研究结果，在鞭毛蛋白单体中极性氨基酸残基和带电荷氨基酸残基与在其它单体中那些极性氨基酸残基和带电荷氨基酸残基反应，致使发生单体之间的轴向相互作用而形成聚合体，从而形成鞭毛蛋白的特征性丝状体结构(Yonekura K，Maki-Yonekura S，Namba K：Complete atomic model of the bacterial flagellar filament by electroncryomicroscopy.Nature.2003 424(6949)：643-50；Samatey FA，Imada K，Nagashima S，Vonderviszt F，Kumasaka T，Yamamoto M，Namba K：Structure ofthe bacterial flagellar protofilament和implications for a switch for supercoiling.Nature.2001 410(6826)：331-7)。根据Smith等的研究，TLR5不识别丝状体类型的鞭毛蛋白聚合体，但识别鞭毛蛋白单体(Smith KD，Andersen-Nissen E，Hayashi F，Strobe K，Bergman MA，Barrett SL，Cookson BT，Aderem A.Toll-likereceptor 5 recognizes a conserved site on flagellin required for protofilamentformation和bacterial motility.Nat Immunol.2003 4(12)：1247-53)。

在目前临床应用中使用的预防性和治疗性疫苗(传染病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和癌症的疫苗)中观察到的共同问题是这些疫苗缺乏有效的可特异性地扩大相关应答的疫苗佐剂。因而，强烈地需要开发更安全和更有效力的疫苗佐剂。

发明内容

相应地，本发明人通过改变预期参与轴向相互作用的氨基酸残基而制备了创伤弧菌鞭毛蛋白基因flaB的重组鞭毛蛋白突变体，该突变体可以抑制在鞭毛蛋白单体之间的轴向相互作用中涉及的极性电荷反应，且已经发现制备的鞭毛蛋白突变体与现有的(野生型)鞭毛蛋白相比具有显著增强的TLR5刺激活性，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的是提供具有增强的TLR5刺激活性的鞭毛蛋白突变体。

本发明的另一目的是提供含有至少一种所述鞭毛蛋白突变体作为活性成分的疫苗佐剂。

为实现上述目的，本发明提供了用于抑制在TLR5激动剂鞭毛蛋白中鞭毛蛋白单体之间相互作用的鞭毛蛋白突变体。

本发明还提供含有至少一种所述鞭毛蛋白突变体作为活性成分的疫苗佐剂。

在本发明中，通过提供与现有鞭毛蛋白相比具有增强的TLR5刺激活性的鞭毛蛋白突变体开发了改良的鞭毛蛋白疫苗佐剂，已发现该改良的鞭毛蛋白疫苗佐剂通过刺激TLR5显示出有效的粘膜疫苗佐剂效力，如PCT国际专利公开文本No.WO 2005/070455中所公开的。根据本发明的鞭毛蛋白突变体将被应用于治疗传染病，自身免疫性疾病，过敏性疾病等等，此外在抗癌治疗中，所述鞭毛蛋白突变体将提供连接基础研究和临床研究的重要环节。因而，本发明的鞭毛蛋白突变体应用到多种疫苗制剂中会创造很高的增值价值。

附图说明

图1显示了沙门氏菌(Salmonella)鞭毛蛋白St-FliC、大肠杆菌鞭毛蛋白Ec-FliC和创伤弧菌鞭毛蛋白Vv-FlaB之间的氨基酸同源性的比较，其中框中的序列为各菌株的鞭毛蛋白结构域(Samatey FA，等人.，Structure of thebacterial flagellar protofilament和implications for a switch for supercoiling.Nature.2001 410(6826)：331-7)。

图2是显示在构建本发明的鞭毛蛋白突变体过程中，在创伤弧菌鞭毛蛋白基因flaB上诱导定点突变的策略的示意图(Samatey FA，等人，Structure ofthe bacterial flagellar protofilament和implications for a switch for supercoiling.Nature.2001 410(6826)：331-7)。

图3和4显示本发明的重组鞭毛蛋白突变体对水溶液中的鞭毛蛋白聚合的影响。

图5和6是显示本发明鞭毛蛋白突变体的TLR刺激活性的测量结果的图表。

具体实施方式

下文将更为详细地描述本发明。

本发明涉及鞭毛蛋白突变体，该鞭毛蛋白突变体是通过点突变TLR5激动剂鞭毛蛋白的某些氨基酸而制备，以使鞭毛蛋白突变抑制鞭毛蛋白单体的多聚合作用，因而该鞭毛蛋白突变体表现出增强的TLR5刺激活性。

本发明涉及：SEQ ID NO：2所示的鞭毛蛋白突变体(D70A)，其是通过将野生型创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB上第70位的天冬氨酸(D70)定点诱变成丙氨酸(A)而制备的，据分析所述鞭毛蛋白FlaB参与了TLR5激动剂鞭毛蛋白中鞭毛蛋白单体之间的轴向相互作用；SEQ ID NO：4所示的鞭毛蛋白突变体(R93A)，其是通过将第93位上的精氨酸(R93)定点诱变成丙氨酸(A)而制备的；SEQ ID NO：6所示的鞭毛蛋白突变体(L97W)，其是通过将第97位上的亮氨酸(L97)定点诱变成色氨酸(W)而制备的；SEQ ID NO：8所示的鞭毛蛋白突变体(N101A)，其是通过将第101位上的天冬酰胺(N101)定点诱变成丙氨酸(A)而制备的；SEQ ID NO：10所示的鞭毛蛋白突变体(S103W)，其是通过将第103位上的丝氨酸(S103)定点诱变成色氨酸(W)而制备的；SEQ ID NO：12所示的鞭毛蛋白突变体(E108A)，其是通过将第108位上的谷氨酸(E108)定点诱变成丙氨酸(A)而制备的；SEQ ID NO：14所示的鞭毛蛋白突变体(N135D)，其是通过将第135位上的天冬酰胺(N135)定点诱变成天冬氨酸(D)而制备的；SEQ ID NO：16所示的鞭毛蛋白突变体(A151W)，其是通过将第151位上的丙氨酸(A151)定点诱变成色氨酸(W)而制备的；SEQ ID NO：18所示的鞭毛蛋白突变体(N153W)，其是通过将第153位上的天冬酰胺(N153)定点诱变成色氨酸(W)而制备的；和SEQ IDNO：20所示的鞭毛蛋白突变体(V291W)，其是通过将第291位上的缬氨酸(V291)定点诱变成色氨酸(W)而制备的。此外，在鞭毛蛋白突变体之中，具有两个或多个氨基酸取代的鞭毛蛋白突变体也在本发明的范围之内，其实例可包括SEQ ID NO：44所示的鞭毛蛋白突变体(D70A/N135D)，其是通过将野生型创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB第70位上的天冬氨酸(D70)定点诱变成丙氨酸(A)并将第135位上的天冬酰胺(N135)定点诱变成天冬氨酸(D)而制备的，但本发明的范围不限于此。

本文中术语“鞭毛蛋白”指构成决定细菌运动性的鞭毛的单个分子。

本发明所提供的鞭毛蛋白突变体具有显著增强的TLR5刺激活性，而这个现象是由于所述鞭毛蛋白突变体与现有鞭毛蛋白突变体相比较显著地降低了鞭毛蛋白的多聚合作用，从而抑制鞭毛蛋白聚合。

相应地，根据本发明制备的具有显著增强的TLR5刺激活性的鞭毛蛋白突变体可提供更有效的TLR激动剂以取代现有的鞭毛蛋白，从而提供与现有的鞭毛蛋白相比具有增强的效力的疫苗佐剂。

证明本发明的鞭毛蛋白突变体具有增强的TLR5刺激活性的方法包括以下步骤：

1)制备SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的鞭毛蛋白突变体；

2)确认鞭毛蛋白突变体抑制在水溶液中鞭毛蛋白的聚合；和

3)确认在大肠杆菌中诱导的各重组鞭毛蛋白突变体的TLR5激活作用。

实施例

下文中将参照实施例和测试实施例更为详细地描述本发明。但应该理解的是，这些实施例和测试实施例仅是举例说明本发明，而不是限制本发明的范围。

本发明所用菌株和质粒的特征在下表1中总结。在实施例和测试实施例中显示了每种鞭毛蛋白突变体的制备方法和各鞭毛蛋白突变体的具体特性。

【表1】

  菌株或质粒  特征  来源  大肠杆菌  DH5α  F recA1；限制性阴性  本实验室  ER2566  F-λ-fhuA2[lon]ompT lacZ::T7gene1 gal  sulA11  (mcrC-mrr)114::IS10R(mcr-73::miniTn10-TetS)2  R(zgb-210::Tn10)(TetS)endA1[dcm]  New England  Biolab  BL21(DE3)  F-ompT hsdS_B(r_B-m_B-)gal dcm(DE3)  Novagen  质粒  pCR2.1  TOPO  PCR TA克隆载体，Amp^R，Km^R  Invitrogen  pTYB12  IMPACT(内含肽介导的以亲和几丁质结合标  签纯化)表达载体，Amp^R  New England  Biolab

各菌株的培养和保存

以下实施例和测试实施例所用的大肠杆菌在Luria Bertani培养基(DifcoCo.)中培养。该培养菌株于30％甘油中保存在-80℃冰箱。

实施例1：通过定点诱变制备重组鞭毛蛋白突变体

根据以前报导的沙门氏菌鞭毛蛋白三维结构的分析数据(Yonekura K，Maki-Yonekura S，Namba K：Complete atomic model of the bacterial flagellarfilament by electron cryomicroscopy.Nature.2003424(6949)：643-50；SamateyFA，Imada K，Nagashima S，Vonderviszt F，Kumasaka T，Yamamoto M，Namba K：Structure of the bacterial flagellar protofilament和implications for a switch forsupercoiling.Nature.2001410(6826)：331-7)，和本发明人进行的生物信息学分析，创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB单体之间轴向相互作用所需要的氨基酸残基如下。即分别为参与了轴向相互作用的各单体的上亚基(upper subunit)第70位的天冬氨酸(D70)、上亚基第135位的天冬酰胺(D135)、和上亚基第153位的丙氨酸(A151)，通过分别与各单体的下亚基(lower subunit)第100位的天冬酰胺(N100)、下亚基第108位的谷氨酸(E108)、下亚基第93位的精氨酸(R93)和下亚基第292位的丙氨酸(A292)的极性电荷反应而形成多聚体。即在以下氨基酸残基之间发生极性电荷反应：上鞭毛蛋白D70与下鞭毛蛋白N100；上鞭毛蛋白N135与下鞭毛蛋白E107；上鞭毛蛋白A151与下鞭毛蛋白R93；和上鞭毛蛋白N153与下鞭毛蛋白A292。

在本发明中，通过对据分析参与鞭毛蛋白亚基之间轴向相互作用的以下氨基酸残基进行定点诱变而制备以下鞭毛蛋白突变体：SEQ ID NO：2所示的鞭毛蛋白突变体(D70A)，其是通过将第70位上的天冬氨酸(D70)定点诱变成丙氨酸(A)而制备的；SEQ ID NO：4所示的鞭毛蛋白突变体(R93A)，其是通过将第93位上的精氨酸(R93)定点诱变成丙氨酸(A)而制备的；SEQ ID NO：8所示的鞭毛蛋白突变体(N101A)，其是通过将第101位上的天冬酰胺(N101)定点诱变成丙氨酸(A)而制备的；SEQ ID NO：12所示的鞭毛蛋白突变体(E108A)，其是通过将第108位上的谷氨酸(E108)定点诱变成丙氨酸(A)而制备的；SEQ ID NO：14所示的鞭毛蛋白突变体(N135D)，其是通过将第135位上的天冬酰胺(N135)定点诱变成天冬氨酸(D)而制备的；SEQ ID NO：16所示的鞭毛蛋白突变体(A151W)，其是通过将第151位上的丙氨酸(A151)定点诱变成色氨酸(W)而制备的；和SEQ ID NO：18所示的鞭毛蛋白突变体(N153W)，其是通过将第153位上的天冬酰胺(N153)定点诱变成色氨酸(W)而制备的。然而，据分析参与了鞭毛蛋白单体之间的轴向相互作用的第292位上的丙氨酸(A292)不用于构建突变体，因为即使在该氨基酸残基被突变后轴向相互作用也不会发生改变。

此外，通过对推测参与鞭毛蛋白单体之间的轴向相互作用的以下氨基酸残基进行定点诱变来制备以下突变体：SEQ ID NO：6所示的鞭毛蛋白突变体(L97W)，其是通过将第97位上的亮氨酸(L97)定点诱变成色氨酸(W)而制备的；SEQ ID NO：10所示的鞭毛蛋白突变体(S103W)，其是通过将第103位上的丝氨酸(S103)定点诱变成色氨酸(W)而制备的；和SEQ ID NO：20所示的鞭毛蛋白突变体(V291W)，其是通过将第291位上的缬氨酸(V291)定点诱变成色氨酸(W)而制备的。

首先，为了获得用于定点诱变的DNA模板，采用SEQ ID NO：21所示的PCR引物FlaB-V5(5′-gcggccgcatggcagtgaatgtaaatgtaaatacaaac-3′；划线部分：用于克隆的NotI限制性内切酶识别位点)和SEQ ID NO：22所示的PCR引物FlaB-V4(5′-cccggggcctagtagacttagcgctga-3′；划线部分：用于克隆的SmaI限制性内切酶识别位点)，通过PCR扩增含有flaB基因ORF的1，142-bp DNA片段。用引物FlaB-V5和FlaB-V4在以下条件下进行PCR扩增：95℃起始变性1分钟，然后95℃30秒变性、70℃退火30秒和72℃延伸1分钟进行30个循环，然后在72℃最后延伸10分钟。扩增的flaB DNA片段被克隆到PCR 2.1-TOPO克隆载体(Invitrogen Co.)中，制得的载体称为“pCMM270”。pCMM270质粒作为DNA模板用于后续的定点诱变。

用于构建创伤弧菌鞭毛蛋白基因flaB定点突变体的PCR条件和克隆的质粒在下面表2中总结。

【表2】

  突变位  点  引物(SEQ ID NO)  PCR  退火温  度 pCR2.1-TOP O克隆的名称  pTYB12克隆  的名称  D70A  FlaB-SD1(SEQ ID NO：23)  5′-gtacgtaacgccaacgcaggtatctcaatc-3′  FlaB-SD2(SEQ ID NO：24)  5′-gattgagatacctgcgttggcgttacgtac-3′  63℃  pCMM272  pCMM276  R93A  FlaB-SD13-2(SEQ ID NO：25)  5′-catcctacaacgtatggctgacctatctctacaatc-3′  FlaB-SD14-2(SEQ ID NO：26)  5′-gattgtagagataggtcagccatacgttgtaggatg-3′  63℃  pCMM281  pCMM291  L97W  FlaB-SD17(SEQ ID NO：27)  5′-gcgtgacctatcttggcaatccgcgaacgg-3′  FlaB-SD18(SEQ ID NO：28)  5′-ccgttcgcggattgccaagataggtcacgc-3′  66℃  pCMM282  pCMM292  N101A  FlaB-SD9-3(SEQ ID NO：29)  5′-ctacaatccgcggccggctcaaactcaaaatc-3′  FlaB-SD10-3(SEQ ID NO：30)  5′-gattttgagtttgagccggccgcggattgtag-3′  64℃  pCMM283  pCMM293  S103W  FlaB-SD15(SEQ ID NO：31)  5′-caatccgcgaacggctggaactcaaaatcag-3′  FlaB-SD16(SEQ ID NO：32)  5′-ctgattttgagttccagccgttcgcggattg-3′  63℃  pCMM284  pCMM294  E108A  FlaB-SD11(SEQ ID NO：33)  5′-caaactcaaaatcagcgcgcgtggcgattc-3′  FlaB-SD12(SEQ ID NO：34)  5′-gaatcgccacgcgcgctgattttgagtttg-3′  63℃  pCMM285  pCMM295  N135D  FlaB-SD3(SEQ ID NO：35)  5′-cgtcttttggtggtgacaagctgctaaacg-3′  FlaB-SD4(SEQ ID NO：36)  5′-cgtttagcagcttgtcaccaccaaaagacg-3′  63℃  pCMM273  pCMM277  A151W  FlaB-SD5(SEQ ID NO：37)  5′-gcaatgcaaattggttgggataacggtgaagcg-3′  FlaB-SD6(SEQ ID NO：38)  5′-cgcttcaccgttatcccaaccaatttgcattgc-3′  63℃  pCMM286  pCMM296  N153W  FlaB-SD7(SEQ ID NO：39)  5′-caaattggtgcggattggggtgaagcggtcatg-3′  FlaB-SD8(SEQ ID NO：40)  5′-catgaccgcttcaccccaatccgcaccaatttg-3′  67℃  pCMM287  pCMM297  V291W  FlaB-SD19(SEQ ID NO：41)  5′-gcgcaagagtcgtgggcgattgtggatgcg-3′  FlaB-SD20(SEQ ID NO：42)  5′-cgcatccacaatcgcccacgactcttgcgc-3′  67℃  pCMM288  pCMM298  D70A/N  135D  FlaB-SD1(SEQ ID NO：23)  5′-gtacgtaacgccaacgcaggtatctcaatc-3′  FlaB-SD2(SEQ ID NO：23)  5′-gattgagatacctgcgttggcgttacgtac-3′  63℃  pCMM274  pCMM278

为了构建每个定点突变体flaB DNAs(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)，采用如上表2所示的各引物对、以pCMM270作为PCR模板、和使用保真Pfu聚合酶(Stratagene Co.)按供应商的说明进行PCR反应来合成突变链。在以下条件下进行各PCR反应：95℃起始变性45秒，然后95℃变性45秒、在表2所示温度下退火1分钟和68℃延伸10分钟进行16个循环，之然后在68℃最后延伸10分钟。将SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17和19的各扩增的定点突变flaB DNAs克隆到PCR 2.1-TOPO克隆载体中，得到的载体称为“pCMM272”、“pCMM281”、“pCMM282”、“pCMM283”、“pCMM284”、“pCMM285”、“pCMM273”、“pCMM286”、“pCMM287”和“pCMM288”(表2)。

为制备SEQ ID NO：44所示的D70A/N135D双定点突变鞭毛蛋白D70A/N135D，以含flaB DNA的pCMM273作为模板进行PCR反应。用SEQID NO：23所示的PCR引物FlaB-SD1、SEQ ID NO：24所示的PCR引物FlaB-SD2和保真Pfu聚合酶(Stratagene Co.)按供应商的说明进行PCR来合成突变链(D70A)。在以下条件下进行PCR反应：95℃起始变性45秒，然后95℃变性45秒、在63℃退火1分钟和68℃延伸10分钟进行16个循环，然后在68℃最后延伸10分钟。SEQ ID NO：43所示的扩增的D70A/N135D双定点突变flaB DNA称为“pCMM274”。

以限制性内切酶NotI和SmaI消化SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17和19的含有定点突变flaB基因(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)的各DNA片段，然后克隆到以相同限制性内切酶消化的pTYB12质粒(NewEngland Biolabs)中。得到的质粒分别称为“pCMM276”、“pCMM291”、“pCMM292”、“pCMM293”、“pCMM293”、“pCMM294”、“pCMM295”、“pCMM277”、“pCMM296”、“pCMM297”、“pCMM298”和“pCMM278”。这些质粒被电转化进大肠杆菌ER2566中，并向其中添加0.5mM的5-溴-吲哚-3-氯-异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以诱导突变鞭毛蛋白基因的表达。使用1，4-二硫苏糖醇(1，4-DTT)和几丁质磁珠柱按供应商的说明从内含肽融合蛋白中获得点突变鞭毛蛋白(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)。使用之前，使用AffinityPak^TM Detoxi Gel^TM内毒素消除凝胶(Pirece)去除在分离的点突变蛋白中含有的内毒素。使用Superdex 120柱(AKTA-Prime，Amersham)对分离的重组蛋白进行凝胶过滤，从而纯化高纯度的SEQ IDNO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20和44所示的重组鞭毛蛋白突变体。

测试实施例1：重组鞭毛蛋白突变体的产生和其在水溶液中的生物化学特性

为了制备重组鞭毛蛋白突变体，SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和43所示的编码鞭毛蛋白突变体的每个基因都被克隆到pTYB12质粒中，然后将质粒转染到大肠杆菌ER2566中。在培养基中添加0.3mMIPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)以诱导重组鞭毛蛋白突变体的产生，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和天然凝胶电泳来分析得到的蛋白。分析结果如图3和4所示。

图3和4显示了野生型鞭毛蛋白(FlaB)和突变鞭毛蛋白FlaB的SDS-PAGE分析结果，图中显示SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44的点突变鞭毛蛋白(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)和野生型鞭毛蛋白(FlaB)都在41.5kDa处有主要条带。在天然凝胶电泳结果中，可以观察到野生型FlaB蛋白形成了巨大的多聚体，使得大部分蛋白保留在浓缩胶中，而进入分离胶中的一些FlaB蛋白分布在66kDa和140kDa之间。然而，本发明的点突变鞭毛蛋白(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)形成了大约140kDa的多聚体。上述结果表明野生型FlaB蛋白在水溶液中形成了巨大的多聚体，但本发明的点突变鞭毛蛋白突变体(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)形成的多聚体小于野生型鞭毛蛋白形成的多聚体。因此，可以确定SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的本发明鞭毛蛋白突变体(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)抑制了鞭毛蛋白的聚合。

测试实施例2：鞭毛蛋白突变体的TLR5刺激活性

为了测量参与TLR5-介导信号的NF-κB的转录活性，以确定野生型FlaB和SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的本发明鞭毛蛋白突变体的TLR5刺激活性，按1x10⁵细胞/孔的密度将293T细胞分种在24孔板的每个孔中并培养过夜。然后，使用FuGENE6(Roche)将可使转录活性被观测到的报告质粒NF-κB-Luc(由Jeong-Mok Kim教授，Instituteof Biomedical Science，Hanyang University College of Medicine，韩国提供)、克隆TLR5基因的p3xFlag-hTLR5质粒(由Dr.Steven B.Mizel，Departments ofMicrobiology and Immunology，Wake Forest University School of Medicine，USA提供)和β-半乳糖苷表达质粒(Clontech)同时导入细胞中。细胞再培养24小时之后，更换新鲜培养液，并以实施例1分离的SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的鞭毛蛋白突变体(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)处理细胞18-24小时。然后，通过用发光计(Berthold)测量荧光素酶活性来检测细胞中NF-κB的转录，测量结果在图5和6中显示。如图5和6所示，以20ng/ml野生型FlaB蛋白处理的组与仅以磷酸缓冲液处理的对照组相比，TLR5介导NF-κB转录活性增强了约6.6倍。而以20ng/ml的每各重组鞭毛蛋白FlaB突变体(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)处理的组与仅以磷酸缓冲液处理的对照组相比，TLR5介导的NF-κB转录活性分别增强了约24.6倍、14倍、25倍、22.6倍、23.7倍、21倍、21.7倍、22.5倍、24.5倍、16.6倍和14.9倍。

序列表文本

SEQ ID NO：1和2是鞭毛蛋白突变体(D70A)的基因和氨基酸序列，该鞭毛蛋白突变体是通过将创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB第70位上的天冬氨酸(D70)定点诱变成丙氨酸(A)而制备的。

SEQ ID NO：3和4是鞭毛蛋白突变体(R93A)的基因和氨基酸序列，该鞭毛蛋白突变体是通过将创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB第93位上的精氨酸(R93)定点诱变成丙氨酸(A)而制备的。

SEQ ID NO：5和6是鞭毛蛋白突变体(L97W)的基因和氨基酸序列，该鞭毛蛋白突变体是通过将创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB第97位上的亮氨酸(L97)定点诱变成色氨酸(W)而制备的。

SEQ ID NO：7和8是鞭毛蛋白突变体(N101A)的基因和氨基酸序列，该鞭毛蛋白突变体是通过将创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB第101位上的天冬酰胺(N101)定点诱变成丙氨酸(A)而制备的。

SEQ ID NO：9和10是鞭毛蛋白突变体(S103W)的基因和氨基酸序列，该鞭毛蛋白突变体是通过将创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB第103位上的丝氨酸(S103)定点诱变成色氨酸(W)而制备的。

SEQ ID NO：11和12是鞭毛蛋白突变体(E108A)的基因和氨基酸序列，该鞭毛蛋白突变体是通过将创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB第108位上的谷氨酸(E108)定点诱变成丙氨酸(A)而制备的。

SEQ ID NO：13和14是鞭毛蛋白突变体(N135D)的基因和氨基酸序列，该鞭毛蛋白突变体是通过将创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB第135位上的天冬酰胺(N135)定点诱变成天冬氨酸(D)而制备的。

SEQ ID NO：15和16是鞭毛蛋白突变体(A151W)的基因和氨基酸序列，该鞭毛蛋白突变体是通过将创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB第151位上的丙氨酸(A151)定点诱变成色氨酸(W)而制备的。

SEQ ID NO：17和18是鞭毛蛋白突变体(N153W)的基因和氨基酸序列，该鞭毛蛋白突变体是通过将创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB第153位上的天冬酰胺(N153)定点诱变成色氨酸(W)而制备的。

SEQ ID NO：19和20是鞭毛蛋白突变体(V291W)的基因和氨基酸序列，该鞭毛蛋白突变体是通过将创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB第291位上的缬氨酸(V291)定点突变成色氨酸(W)而制备的。

SEQ ID NO：21-42是用于SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的鞭毛蛋白突变体的引物序列。

SEQ ID NO：43和44是鞭毛蛋白突变体(D70A/N135D)的基因和氨基酸序列，该鞭毛蛋白突变体通过将创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB第70位上的天冬氨酸(D70)定点突变成丙氨酸(A)并将创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB第135位上的天冬酰胺(N135)定点诱变成天冬氨酸(D)而制备的。

序列表

<110>全南大学校产学协力团(INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY)

<120>改良toll样受体5刺激活性的修饰的鞭毛蛋白

<150>KR10-2007-0013846

<151>2007-02-09

<150>KR10-2008-0011330

<151>2008-02-04

<160>44

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>1134

<212>DNA

<213>创伤弧菌D70A FlaB基因

<400>1

atggcagtga atgtaaatac aaacgtagca gcaatgacag cacagcgtta cctgaataac    60

gcaaacagcg cacaacaaac ttcgatggag cgtctgtctt caggtttcaa aatcaacagt    120

gcaaaagatg acgcagccgg tctgcaaatc tctaaccgct tgaacgtaca aagtcgcggt    180

ctagacgttg cggtacgtaa cgccaacgca ggtatctcaa tcgcacaaac cgcagaaggt    240

gcgatgaacg agaccaccaa catcctacaa cgtatgcgtg acctatctct acaatccgcg    300

aacggctcaa actcaaaatc agagcgcgtg gcgattcaag aagaagtgac agcattgaat    360

gacgagctaa accgtattgc agaaaccacg tcttttggtg gtaacaagct gctaaacggt    420

acttacggca cgaaagcaat gcaaattggt gcggataacg gtgaagcggt catgctttca    480

ctgaaagaca tgcgctctga caacgtgatg atgggcggcg tgagctacca agctgaagaa    540

ggcaaagaca agaactggaa tgtggccgca ggcgacaacg acttgacgat tgcactgaca    600

gacagctttg gtaacgagca agagatcgaa atcaacgcga aagcgggtga tgacatcgaa    660

gagctagcga cgtacatcaa cggtcaaact gaccttgtaa aagcgtcagt gggtgaaggc    720

ggcaagctac agatctttgc tggtaacaac aaagttcaag gtgaaattgc tttctcaggt    780

agcctagctg gtgaacttgg cctaggcgaa ggcaaaaacg tcacggtaga cacgattgac    840

gtgacaaccg tacaaggtgc gcaagagtcg gtagcgattg tggatgcggc actgaaatac    900

gtagacagcc accgtgcaga gctgggtgca ttccagaacc gtttcaacca tgcaatcagc    960

aacttggaca acatcaacga aaacgtgaac gcgtcgaaga gccgaatcaa agataccgac    1020

ttcgcgaaag aaacgactca gttgaccaag acacaaattc tatcgcaagc atcaagttcc    1080

attcttgcgc aagcgaaaca agcgccaaac tcagcgctaa gtctactagg ctaa          1134

<210>2

<211>377

<212>PRT

<213>创伤弧菌D70A FlaB氨基酸

<400>2

Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr Ala Gln Arg

  1               5                  10                  15

Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met Glu Arg Leu

             20                  25                  30

Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

         35                  40                  45

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala

     50                  55                  60

Val Arg Asn Ala Asn Ala Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu Gly

 65                  70                  75                  80

Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

                 85                  90                  95

Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg Val Ala Ile

            100                 105                 110

Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

        115                 120                 125

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

    130                 135                 140

Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr

                165                 170                 175

Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp

            180                 185                 190

Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu

        195                 200                 205

Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

    210                 215                 220

Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly

225                 230                 235                 240

Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile

                245                 250                 255

Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys

            260                 265                 270

Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His

    290                 295                 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln

            340                 345                 350

Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

        355                 360                 365

Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly

    370                 375

<210>3

<211>1134

<212>DNA

<213>创伤弧菌R93A FlaB基因

<400>3

atggcagtga atgtaaatac aaacgtagca gcaatgacag cacagcgtta cctgaataac    60

gcaaacagcg cacaacaaac ttcgatggag cgtctgtctt caggtttcaa aatcaacagt    120

gcaaaagatg acgcagccgg tctgcaaatc tctaaccgct tgaacgtaca aagtcgcggt    180

ctagacgttg cggtacgtaa cgccaacgac ggtatctcaa tcgcacaaac cgcagaaggt    240

gcgatgaacg agaccaccaa catcctacaa cgtatggctg acctatctct acaatccgcg    300

aacggctcaa actcaaaatc agagcgcgtg gcgattcaag aagaagtgac agcattgaat    360

gacgagctaa accgtattgc agaaaccacg tcttttggtg gtaacaagct gctaaacggt    420

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ctgaaagaca tgcgctctga caacgtgatg atgggcggcg tgagctacca agctgaagaa    540

ggcaaagaca agaactggaa tgtggccgca ggcgacaacg acttgacgat tgcactgaca    600

gacagctttg gtaacgagca agagatcgaa atcaacgcga aagcgggtga tgacatcgaa    660

gagctagcga cgtacatcaa cggtcaaact gaccttgtaa aagcgtcagt gggtgaaggc    720

ggcaagctac agatctttgc tggtaacaac aaagttcaag gtgaaattgc tttctcaggt    780

agcctagctg gtgaacttgg cctaggcgaa ggcaaaaacg tcacggtaga cacgattgac    840

gtgacaaccg tacaaggtgc gcaagagtcg gtagcgattg tggatgcggc actgaaatac    900

gtagacagcc accgtgcaga gctgggtgca ttccagaacc gtttcaacca tgcaatcagc    960

aacttggaca acatcaacga aaacgtgaac gcgtcgaaga gccgaatcaa agataccgac    1020

ttcgcgaaag aaacgactca gttgaccaag acacaaattc tatcgcaagc atcaagttcc    1080

attcttgcgc aagcgaaaca agcgccaaac tcagcgctaa gtctactagg ctaa          1134

<210>4

<211>377

<212>PRT

<213>创伤弧菌R93A FlaB氨基酸

<400>4

Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr Ala Gln Arg

  1               5                  10                  15

Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met Glu Arg Leu

             20                  25                  30

Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

         35                  40                  45

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala

     50                  55                  60

Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu Gly

 65                  70                  75                  80

Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Ala Asp Leu Ser

                 85                  90                  95

Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg Val Ala Ile

            100                 105                 110

Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

        115                 120                 125

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

    130                 135                 140

Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr

                165                 170                 175

Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp

            180                 185                 190

Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu

        195                 200                 205

Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

    210                 215                 220

Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly

225                 230                 235                 240

Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile

                245                 250                 255

Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys

            260                 265                 270

Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His

    290                 295                 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln

            340                 345                 350

Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

        355                 360                 365

Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly

    370                 375

<210>5

<211>1134

<212>DNA

<213>创伤弧菌L97W FlaB基因

<400>5

atggcagtga atgtaaatac aaacgtagca gcaatgacag cacagcgtta cctgaataac    60

gcaaacagcg cacaacaaac ttcgatggag cgtctgtctt caggtttcaa aatcaacagt    120

gcaaaagatg acgcagccgg tctgcaaatc tctaaccgct tgaacgtaca aagtcgcggt    180

ctagacgttg cggtacgtaa cgccaacgac ggtatctcaa tcgcacaaac cgcagaaggt    240

gcgatgaacg agaccaccaa catcctacaa cgtatgcgtg acctatcttg gcaatccgcg    300

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gacgagctaa accgtattgc agaaaccacg tcttttggtg gtaacaagct gctaaacggt    420

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<210>6

<211>377

<212>PRT

<213>创伤弧菌L97W FlaB氨基酸

<400>6

Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr Ala Gln Arg

  1               5                  10                  15

Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met Glu Arg Leu

             20                  25                  30

Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

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Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala

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Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu Gly

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Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

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Trp Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg Val Ala Ile

            100                 105                 110

Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

        115                 120                 125

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

    130                 135                 140

Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

14                 515                 0155                 160

Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr

                165                 170                 175

Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp

            180                 185                 190

Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu

        195                 200                 205

Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

    210                 215                 220

Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly

225                 230                 235                 240

Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile

                245                 250                 255

Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys

            260                 265                 270

Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His

    290                 295                 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln

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Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

        355                 360                 365

Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly

    370                 375

<210>7

<211>1134

<212>DNA

<213>创伤弧菌N101A FlaB基因

<400>7

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ttcgcgaaag aaacgactca gttgaccaag acacaaattc tatcgcaagc atcaagttcc    1080

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<210>8

<211>377

<212>PRT

<213>创伤弧菌N101A FlaB氨基酸

<400>8

Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr Ala Gln Arg

  1               5                  10                  15

Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met Glu Arg Leu

             20                  25                  30

Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

         35                  40                  45

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala

     50                  55                  60

Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu Gly

 65                  70                  75                  80

Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

                 85                  90                  95

Leu Gln Ser Ala Ala Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg Val Ala Ile

            100                 105                 110

Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

        115                 120                 125

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

    130                 135                 140

Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr

                165                 170                 175

Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp

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Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu

        195                 200                 205

Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

    210                 215                 220

Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly

225                 230                 235                 240

Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile

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Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys

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Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His

    290                 295                 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln

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Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

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Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly

    370                 375

<210>9

<211>1134

<212>DNA

<213>创伤弧菌S103W FlaB基因

<400>9

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<210>10

<211>377

<212>PRT

<213>创伤弧菌S103W FlaB氨基酸

<400>10

Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr Ala Gln Arg

  1               5                  10                  15

Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met Glu Arg Leu

             20                  25                  30

Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

         35                  40                  45

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala

     50                  55                  60

Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu Gly

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Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

                 85                  90                  95

Leu Gln Ser Ala Asn Gly Trp Asn Ser Lys Ser Glu Arg Val Ala Ile

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Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

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Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

    130                 135                 140

Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

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Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr

                165                 170                 175

Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp

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Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu

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Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly

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Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile

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Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys

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Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His

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Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln

            340                 345                 350

Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

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Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly

    370                 375

<210>11

<211>1134

<212>DNA

<213>创伤弧菌E108A FlaB基因

<400>11

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gcaaacagcg cacaacaaac ttcgatggag cgtctgtctt caggtttcaa aatcaacagt    120

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gcgatgaacg agaccaccaa catcctacaa cgtatgcgtg acctatctct acaatccgcg    300

aacggctcaa actcaaaatc agcgcgcgtg gcgattcaag aagaagtgac agcattgaat    360

gacgagctaa accgtattgc agaaaccacg tcttttggtg gtaacaagct gctaaacggt    420

acttacggca cgaaagcaat gcaaattggt gcggataacg gtgaagcggt catgctttca    480

ctgaaagaca tgcgctctga caacgtgatg atgggcggcg tgagctacca agctgaagaa    540

ggcaaagaca agaactggaa tgtggccgca ggcgacaacg acttgacgat tgcactgaca    600

gacagctttg gtaacgagca agagatcgaa atcaacgcga aagcgggtga tgacatcgaa    660

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<210>12

<211>377

<212>PRT

<213>创伤弧菌E108A FlaB氨基酸

<400>12

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Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

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Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Ala Arg Val Ala Ile

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Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

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Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

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Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

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Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr

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Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp

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Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu

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Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

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Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly

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Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile

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Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys

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Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His

    290                 295                 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln

            340                 345                 350

Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

        355                 360                 365

Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly

    370                 375

<210>13

<211>1134

<212>DNA

<213>创伤弧菌N135D FlaB基因

<400>13

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<210>14

<211>377

<212>PRT

<213>创伤弧菌N135D FlaB氨基酸

<400>14

Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr Ala Gln Arg

  1               5                  10                  15

Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met Glu Arg Leu

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Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

         35                  40                  45

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala

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Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu Gly

 65                  70                  75                  80

Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

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Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg Val Ala Ile

            100                 105                 110

Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

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Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asp Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

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Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr

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Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp

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Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu

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Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

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Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly

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Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile

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Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys

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Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His

    290                 295                 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln

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Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

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Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly

    370                 375

<210>15

<211>1134

<212>DNA

<213>创伤弧菌A151W FlaB基因

<400>15

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<210>16

<211>377

<212>PRT

<213>创伤弧菌A151W FlaB氨基酸

<400>16

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Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met Glu Arg Leu

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Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

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Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala

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Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg Val Ala Ile

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Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

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Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

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Lys Ala Met Gln Ile Gly Trp Asp Asn Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

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Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr

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Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp

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Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu

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Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

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Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly

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Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile

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Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys

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Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His

    290                 295                 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln

            340                 345                 350

Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

        355                 360                 365

Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly

    370                 375

<210>17

<211>1134

<212>DNA

<213>创伤弧菌N153W FlaB基因

<400>17

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ctagacgttg cggtacgtaa cgccaacgac ggtatctcaa tcgcacaaac cgcagaaggt    240

gcgatgaacg agaccaccaa catcctacaa cgtatgcgtg acctatctct acaatccgcg    300

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<210>18

<211>377

<212>PRT

<213>创伤弧菌N153W FlaB氨基酸

<400>18

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Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

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Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala

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Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu Gly

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Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg Val Ala Ile

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Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

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Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

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Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Trp Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

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Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr

                165                 170                 175

Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp

            180                 185                 190

Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu

        195                 200                 205

Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

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Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly

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Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile

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Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys

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Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His

    290                 295                 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln

            340                 345                 350

Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

        355                 360                 365

Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly

    370                 375

<210>19

<211>1134

<212>DNA

<213>创伤弧菌V291W FlaB基因

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<210>20

<211>377

<212>PRT

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Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met Glu Arg Leu

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Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala

     50                  55                  60

Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu Gly

 65                  70                  75                  80

Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

                 85                  90                  95

Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg Val Ala Ile

            100                 105                 110

Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

        115                 120                 125

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

    130                 135                 140

Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr

                165                 170                 175

Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp

            180                 185                 190

Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu

        195                 200                 205

Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

    210                 215                 220

Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly

225                 230                 235                 240

Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile

                245                 250                 255

Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys

            260                 265                 270

Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Glu Ser Trp Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His

    290                 295                 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln

            340                 345                 350

Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

        355                 360                 365

Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly

    370                 375

<210>21

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-V5引物

<400>21

gcggccgcat ggcagtgaat gtaaatgtaa atacaaac    38

<210>22

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-V4引物

<400>22

cccggggcct agtagactta gcgctga            27

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD1引物

<400>23

gtacgtaacg ccaacgcagg tatctcaatc          30

<210>24

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD2引物

<400>24

gattgagata cctgcgttgg cgttacgtac           30

<210>25

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD13-2引物

<400>25

catcctacaa cgtatggctg acctatctct acaatc    36

<210>26

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD14-2引物

<400>26

gattgtagag ataggtcagc catacgttgt aggatg    36

<210>27

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD17引物

<400>27

gcgtgaccta tcttggcaat ccgcgaacgg           30

<210>28

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD18引物

<400>28

ccgttcgcgg attgccaaga taggtcacgc           30

<210>29

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD9-3引物

<400>29

ctacaatccg cggccggctc aaactcaaaa tc        32

<210>30

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD10-3引物

<400>30

gattttgagt ttgagccggc cgcggattgt ag    32

<210>31

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD15引物

<400>31

caatccgcga acggctggaa ctcaaaatca g     31

<210>32

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD16引物

<400>32

ctgattttga gttccagccg ttcgcggatt g     31

<210>33

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD11引物

<400>33

caaactcaaa atcagcgcgc gtggcgattc       30

<210>34

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD12引物

<400>34

gaatcgccac gcgcgctgat tttgagtttg     30

<210>35

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD3引物

<400>35

cgtcttttgg tggtgacaag ctgctaaacg     30

<210>36

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD4引物

<400>36

cgtttagcag cttgtcacca ccaaaagacg      30

<210>37

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD5引物

<400>37

gcaatgcaaa ttggttggga taacggtgaa gcg    33

<210>38

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD6引物

<400>38

cgcttcaccg ttatcccaac caatttgcat tgc    33

<210>39

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD7引物

<400>39

caaattggtg cggattgggg tgaagcggtc atg    33

<210>40

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD8引物

<400>40

catgaccgct tcaccccaat ccgcaccaat ttg    33

<210>41

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD19引物

<400>41

gcgcaagagt cgtgggcgat tgtggatgcg        30

<210>42

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FlaB-SD20引物

<400>42

cgcatccaca atcgcccacg actcttgcgc                                     30

<210>43

<211>1134

<212>DNA

<213>创伤弧菌D70A/N135D FlaB基因

<400>43

atggcagtga atgtaaatac aaacgtagca gcaatgacag cacagcgtta cctgaataac    60

gcaaacagcg cacaacaaac ttcgatggag cgtctgtctt caggtttcaa aatcaacagt    120

gcaaaagatg acgcagccgg tctgcaaatc tctaaccgct tgaacgtaca aagtcgcggt    180

ctagacgttg cggtacgtaa cgccaacgca ggtatctcaa tcgcacaaac cgcagaaggt    240

gcgatgaacg agaccaccaa catcctacaa cgtatgcgtg acctatctct acaatccgcg    300

aacggctcaa actcaaaatc agagcgcgtg gcgattcaag aagaagtgac agcattgaat    360

gacgagctaa accgtattgc agaaaccacg tcttttggtg gtgacaagct gctaaacggt    420

acttacggca cgaaagcaat gcaaattggt gcggataacg gtgaagcggt catgctttca    480

ctgaaagaca tgcgctctga caacgtgatg atgggcggcg tgagctacca agctgaagaa    540

ggcaaagaca agaactggaa tgtggccgca ggcgacaacg acttgacgat tgcactgaca    600

gacagctttg gtaacgagca agagatcgaa atcaacgcga aagcgggtga tgacatcgaa    660

gagctagcga cgtacatcaa cggtcaaact gaccttgtaa aagcgtcagt gggtgaaggc    720

ggcaagctac agatctttgc tggtaacaac aaagttcaag gtgaaattgc tttctcaggt    780

agcctagctg gtgaacttgg cctaggcgaa ggcaaaaacg tcacggtaga cacgattgac    840

gtgacaaccg tacaaggtgc gcaagagtcg gtagcgattg tggatgcggc actgaaatac    900

gtagacagcc accgtgcaga gctgggtgca ttccagaacc gtttcaacca tgcaatcagc    960

aacttggaca acatcaacga aaacgtgaac gcgtcgaaga gccgaatcaa agataccgac    1020

ttcgcgaaag aaacgactca gttgaccaag acacaaattc tatcgcaagc atcaagttcc    1080

attcttgcgc aagcgaaaca agcgccaaac tcagcgctaa gtctactagg ctaa          1134

<210>44

<211>377

<212>PRT

<213>创伤弧菌D70A/N135D FlaB氨基酸

<400>44

Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr Ala Gln Arg

  1               5                  10                  15

Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met Glu Arg Leu

             20                  25                  30

Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

         35                  40                  45

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala

     50                  55                  60

Val Arg Asn Ala Asn Ala Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu Gly

 65                  70                  75                  80

Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

                 85                  90                  95

Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg Val Ala Ile

            100                 105                 110

Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

        115                 120                 125

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asp Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

    130                 135                 140

Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr

                165                 170                 175

Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp

            180                 185                 190

Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu

        195                 200                 205

Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

    210                 215                 220

Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly

225                 230                 235                 240

Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile

                245                 250                 255

Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys

            260                 265                 270

Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His

    290                 295                 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln

            340                 345                 350

Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

        355                 360                 365

Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly

    370                 375