一种同时识别氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的分子印迹聚合物的制备方法

摘要

本发明涉及到一种能同时识别氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的分子印迹聚合物的制备方法，属于生物工程技术领域。具体为：首先将功能单体、交联剂加入到致孔剂中，混合均匀后，加热，然后加入模板分子甲砜霉素和引发剂，进一步将混合溶液超声脱气，氮气或抽真空状态下密封，进行聚合反应；聚合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛，通过索氏萃取和固相萃取小柱的联用方法，用有机溶剂洗脱除去模板分子，直到通过高效液相色谱－质谱检测不到模板分子为止；最后将除去模板分子的聚合物，真空干燥，得到分子印迹聚合物。本发明制得的聚合物可同时应用于食品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素抗生素检测的前处理，实现对氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的特异选择性分离和高效富集。

说明书

技术领域

本发明涉及到分子印迹聚合物的制备方法，具体的说，是涉及一种同时识别氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的分子印迹聚合物的制备方法。

背景技术

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)、甲砜霉素(Thiamphenicol，TAP)和氟甲砜霉素(Floramphenicol，FF)同属于氯霉素类抗生素，氯霉素由于其苯环上带硝基，分解半衰期较长，而且具有严重的毒副作用，因此，动物性食品和水产品中的氯霉素残留对人类健康构成了巨大威胁，目前，已被禁止在动物源性食品中使用，其最高残留限量为0.1μg/kg。甲砜霉素和氟甲砜霉素由于毒性较氯霉素小，作为氯霉素的替代药物被广泛使用，但是随着研究的进展发现甲砜霉素和氟甲砜霉素其毒副作用依然存在，其最高残留限量标准一般为50～100μg/kg。因此，为保证动物性食品的食用安全，建立准确可靠地定性检测方法十分重要。目前，同时检测氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的方法较少，主要有高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱-质谱(GC-MS)法和液相色谱-质谱(LC-MS/LC-MS/MS)法等；这些方法存在样品前处理过程复杂、价格昂贵、分析速度慢等缺点，因此，加强对氯霉素类抗生素违禁药物残留检测，尤其是进行多残留成份的检测，迫切需要新型、高选择性、制备简便、具有专一识别某一类抗生素的填料基质。基于分子识别理论的分子印迹技术(Molecularly imprinting technique，MIT)是一种模拟抗体-抗原相互作用，可获得在空间和结合位点上与某一或某一类分子相匹配的聚合物的技术，获得的分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)由于具有较好的选择性和较高的机械强度，可用作固相萃取和液相色谱柱的填料，与传统的固相萃取填料相比，能够从复杂样品中选择性分离和富集目标分子或者是与结构相似的化合物，具有高特异性与高选择性、制备简单、稳定性好和可重复使用等优点。经对现有技术的文献检索发现，目前分子印迹技术已开始应用于食品中氯霉素的检测中。但是，目前关于氯霉素类抗生素的分子印迹聚合物的研究主要是基于氯霉素这一单一目标化合物的特异性分离设计的，而且经过常规的洗脱处理不能完全从聚合物中除去模板分子，在随后进行的固相萃取各个步骤，包括上样、淋洗、洗脱等操作中常常发现模板分子的渗漏现象，对痕量物质的检测来说，增加了系统误差，直接影响了分子印迹固相萃取技术的广泛应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种能同时有效识别氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的分子印迹聚合物的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该同时识别氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)、将功能单体、交联剂加入到致孔剂中，在40～50℃条件下加热，然后加入模板分子混合均匀，得到混合溶液；

(2)、向步骤(1)得到的混合溶液中加入引发剂，超声波脱气5～10min；然后通氮气10～15min，抽真空或氮气状态下密封；

(3)、在温度为60～70℃的条件下热引发聚合，反应时间为36～48h；

(4)、聚合反应结束后，将获得的聚合物取出研磨、筛分，通过有机溶剂去除模板分子；

(5)、将除去了模板分子的聚合物真空干燥，得到能同时识别氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的分子印迹聚合物；

其中，所述的模板分子为甲砜霉素，所述的致孔剂为乙腈，所述的交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)或乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)；所述的功能单体为甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯、甲基丙烯酸或三氟甲基丙烯酸；

所述模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比为1∶1～8∶25；且致孔剂与交联剂的体积比为1∶6～14。

较好的，步骤(4)中研磨、筛分后得到颗粒的平均粒径为40～60μm。

步骤(4)中去除模板分子所采用的方法可以是索氏萃取和固相萃取柱洗脱联合使用。

所述的索氏萃取和固相萃取柱洗脱所用的溶剂可以分别为甲醇与甲酸的混合溶液和甲醇，其中所述的甲醇和甲酸的混合溶液中甲醇与甲酸的体积比为9∶1。

所述的真空干燥温度可以为45～50℃，干燥时间为8h。

与现有技术相比较，本发明以甲砜霉素作为模板分子，通过选择合适的目标分析物作为模板分子并建立合适的洗脱程序制得能同时识别、分离氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的分子印迹聚合物，并解决了分子印迹聚合物通常存在的模板渗漏等问题，获得的分子印迹聚合物可用于对氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的特异选择性分离和高效富集。该分子印迹聚合物不仅对氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素具有较强的识别能力，而且对三种物质具有较高的选择性和灵敏度，可用于生物及环境样品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的分离、富集和纯化。该分子印迹聚合物将为氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留的检测提供优良的前处理材料，结合已有检测方法，如ELISA、HPLC、HPLC/GC-MS等，可显著提高三种物质残留的检测灵敏度和检测效率，具有较大的推广应用价值。同时，本发明所提供的分子印迹聚合物可作为固相萃取和液相色谱柱的填料，实现对氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的分离、纯化和富集。

附图说明

图1为本发明实施例1中制得的多孔分子印迹聚合物；

图2为本发明实施例1中制得的多孔分子印迹聚合物的表面电镜扫描图；

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

将功能单体甲基丙烯酸(MAA)1mmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)25mmol，混合均匀后，40℃加热2min，然后加入模板分子甲砜霉素1mmol通入氮气10～15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超声脱气5～10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60℃下反应36h；聚合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇∶甲酸酸(v/v 9/1)、甲醇通过索氏萃取除去模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇∶甲酸(v/v9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模板分子的聚合物，45℃真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为40～60μm。

实施例2

将功能单体甲基丙烯酸(MAA)8mmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)25mmol，混合均匀后，50℃加热2min，然后加入模板分子甲砜霉素1mmol通入氮气10～15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超声脱气5～10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60℃下反应36h；聚合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇∶甲酸酸(v/v 9/1)、甲醇通过索氏萃取除去模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇∶甲酸(v/v9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模板分子的聚合物，45℃真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为40～60μm。

实施例3

将功能单体甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯(DEAEM)1mmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)25mmol，混合均匀后，40℃加热2min，然后加入模板分子甲砜霉素1mmol通入氮气10～15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超声脱气5～10min，氮气状态或抽真空状态下密封。70℃下反应36h；聚合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇∶甲酸酸(v/v 9/1)、甲醇通过索氏萃取除去模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇∶甲酸(v/v 9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模板分子的聚合物，45℃真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为40～60μm。

实施例4

将功能单体甲基丙烯酸(MAA)1mmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)25mmol，混合均匀后，40℃加热2min，然后加入模板分子甲砜霉素1mmol通入氮气10～15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超声脱气5～10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60℃下反应48h；聚合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇∶甲酸酸(v/v 9/1)、甲醇通过索氏萃取除去模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇∶甲酸(v/v9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模板分子的聚合物，50℃真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为40～60μm。

实施例5

将功能单体甲基丙烯酸(MAA)6mmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)25mmol，混合均匀后，40℃加热2min，然后加入模板分子甲砜霉素1mmol通入氮气10～15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超声脱气5～10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60℃下反应48h；聚合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇∶甲酸酸(v/v 9/1)、甲醇通过索氏萃取除去模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇∶甲酸(v/v9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模板分子的聚合物，50℃真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为40～60μm。

实施例6

将功能单体甲基丙烯酸(MAA)6mmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)25mmol，混合均匀后，45℃加热2min，然后加入模板分子甲砜霉素1mmol通入氮气10～15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超声脱气5～10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60℃下反应48h；聚合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇∶甲酸酸(v/v 9/1)、甲醇通过索氏萃取除去模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇∶甲酸(v/v9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模板分子的聚合物，50℃真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为40～60μm。

实施例7

将功能单体甲基丙烯酸(MAA)6mmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)25mmol，混合均匀后，45℃加热2min，然后加入模板分子甲砜霉素1mmol通入氮气10～15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超声脱气5～10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60℃下反应48h；聚合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇∶甲酸酸(v/v 9/1)、甲醇通过索氏萃取除去模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇∶甲酸(v/v 9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模板分子的聚合物，50℃真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为40～60μm。

实施例8

将功能单体三氟甲基丙烯酸(TFMAA)1mmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)25mmol，混合均匀后，50℃加热2min，然后加入模板分子甲砜霉素1mmol通入氮气10～15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超声脱气5～10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60℃下反应36h；聚合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇∶甲酸酸(v/v 9/1)、甲醇通过索氏萃取除去模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇∶甲酸(v/v 9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模板分子的聚合物，45℃真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为40～60μm。

实施例9

将功能单体三氟甲基丙烯酸(TFMAA)8mmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)25mmol，混合均匀后，50℃加热2min，然后加入模板分子甲砜霉素1mmol通入氮气10～15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超声脱气5～10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60℃下反应36h；聚合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇∶甲酸酸(v/v 9/1)、甲醇通过索氏萃取除去模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇∶甲酸(v/v 9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模板分子的聚合物，45℃真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为40～60μm。

测试

将实施例1制备的分子印迹聚合物制成固相萃取小柱后，将加标样品经固相萃取小柱分离纯化后，以LC-MS/MS检测，应用到鱼、虾样品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的检测结果。实施例2至实施例9的测试结果基本相同。