大麦成熟胚愈伤组织诱导法及所用的诱导培养基

摘要

本发明公开了一种诱导培养基及其制备方法，该诱导培养基由培养液、2，4－二氯苯氧乙酸和琼脂组成，培养液由脯氨酸、水解酪蛋白、肌醇、麦芽糖、蒸馏水和一些微量元素组成。本发明还同时公开了一种大麦成熟胚愈伤组织诱导法，包括：1)将清洗后的大麦种子去除部分胚乳，得长度为4～5mm的离体胚；2)将离体胚去壳后经灭菌和清洗处理；3)培养：将处理后的离体胚纵切成两半，切面朝下平铺于诱导培养基上；23～25℃下暗培养14～20d；得大麦成熟胚初代愈伤组织。本发明的诱导法用于诱导获得大麦成熟胚的愈伤组织。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体的说，本发明涉及大麦成熟胚初代愈伤组织的诱导方法和相应的诱导体系。

背景技术

大麦成熟胚系种子的一部分，易于操作，且取材不受季节限制，数量容易保证。这样，以成熟胚为外植体来建立高效的再生体系受到广泛重视。早在1979年，Bayliss和Dunn(1979，Plant Sci Lett 14：311-316)从大麦成熟胚成功地诱导出愈伤组织；之后，Rengel(1987，Plant Physi Bilchem 25：43-48)首次报道从大麦成熟胚诱导的愈伤组织中实现了植株再生，但再生频率很低。成熟胚诱导的初代愈伤组织是水质、柔软的非胚性愈伤组织，只有通过继代才出现一定频率(20％～30％)的乳黄色或白色、质地致密、表面上具有颗粒感的胚性愈伤组织(严华军，1996，作物学报22：59-65)。另外，Taniguchi(1991，JapBreed 41：571-579)曾对203个大麦基因型的成熟胚进行愈伤组织诱导，结果是14个品种能分化出绿芽，表明大麦成熟胚愈伤组织的再生能力具有较强的品种特异性。大麦成熟胚愈伤组织胚胎发生频率低、再生能力弱、基因型依赖性强，使得建立初代愈伤组织高效诱导体系成为必要。

迄今为止，对大麦成熟胚组织培养技术也已有一些研究，曾有人分析过培养基成分、激素、种壳、诱导方式等因素对大麦成熟胚培养的影响，并比较了部分基因型之间的差异。但总体上，大麦成熟胚培养的高效体系尚未建成，特别是对如何广谱、简便、大量、低污染获得优质初代愈伤组织尚缺乏研究。大麦颖果被稃壳紧密包被，成熟胚体积小且脆弱，这对外植体的有效剥离带来挑战；腹沟部分难以完整去壳，表面消毒效果差，诱导过程中极易造成霉菌污染；浓硫酸去壳虽简便高效，但是对成熟胚会造成较大损伤，诱导时加剧外植体发芽，显著降低出愈率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种诱导培养基及其制备方法以及一种大麦成熟胚愈伤组织的诱导法，用于诱导获得大麦成熟胚的愈伤组织。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种诱导培养基，其由培养液、2，4-二氯苯氧乙酸和琼脂组成；

所述培养液由以下含量的组分组成：

MnSO₄·4H₂O    22.3mg/L，  KNO₃          2800mg/L，

ZnSO₄·7H₂O    8.6mg/L，   (NH₄)₂SO₄     460mg/L，

H₃BO₃          6.2mg/L，   KH₂PO₄        400mg/L，

Na₂MoO₄·2H₂O  0.25mg/L，  MgSO₄·7H₂O   185mg/L，

CuSO₄·5H₂O    0.025mg/L， CaCl₂·2H₂O   165mg/L，

CoCl₂·6H₂O    0.025mg/L， 维生素B₁      0.1mg/L，

KI             0.83mg/L，  维生素B₆      0.5mg/L，

Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L，  甘氨酸        2mg/L，

FeSO₄·7H₂O    27.8mg/L，  烟酸          0.5mg/L，

脯氨酸         0.5g/L，    水解酪蛋白    0.5g/L，

肌醇           0.1g/L，    麦芽糖        60g/L，

其余为蒸馏水；

2，4-二氯苯氧乙酸∶培养液＝6mg/L；琼脂∶培养液＝0.55％的重量比。

本发明还同时提供了上述诱导培养基的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、配制培养液：

将MnSO₄·4H₂O、KNO₃、ZnSO₄·7H₂O、(NH₄)₂SO₄、H₃BO₃、KH₂PO₄、Na₂MoO₄·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O、CaCl₂·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、维生素B₁、KI、维生素B₆、Na₂-EDTA·2H₂O、甘氨酸、FeSO₄·7H₂O、烟酸、脯氨酸、水解酪蛋白、肌醇、麦芽糖和蒸馏水相混合，得培养液；

培养液中各组分的含量如下：

MnSO₄·4H₂O    22.3mg/L，    KNO₃         2800mg/L，

ZnSO₄·7H₂O    8.6mg/L，     (NH₄)₂SO₄    460mg/L，

H₃BO₃          6.2mg/L，     KH₂PO₄       400mg/L，

Na₂MoO₄·2H₂O  0.25mg/L，    MgSO₄·7H₂O  185mg/L，

CuSO₄·5H₂O    0.025mg/L，   CaCl₂·2H₂O  165mg/L，

CoCl₂·6H₂O    0.025mg/L，   维生素B₁     0.1mg/L，

KI              0.83mg/L，  维生素B₆     0.5mg/L，

Na₂-EDTA·2H₂O  37.3mg/L，  甘氨酸       2mg/L，

FeSO₄·7H₂O     27.8mg/L，  烟酸         0.5mg/L，

脯氨酸          0.5g/L，    水解酪蛋白   0.5g/L，

肌醇            0.1g/L，    麦芽糖       60g/L，

其余为蒸馏水；

2)、在每L培养液中加入2，4-二氯苯氧乙酸6mg，调节pH为5.8；然后加入琼脂固化，琼脂与培养液的重量比＝0.55％；最后在1.1个大气压、121℃条件下灭菌20min，得诱导培养基。

本发明还同时提供了利用上述诱导培养基进行的大麦成熟胚愈伤组织诱导法，依次进行以下步骤：

1)、将清洗后的大麦种子去除部分胚乳，得长度为4～5mm的离体胚；

2)、将离体胚去壳后经灭菌和清洗处理；

3)、培养：

将上述上述步骤2)处理后的离体胚纵切成两半，切面朝下平铺于诱导培养基上；23～25℃下暗培养14～20d；得大麦成熟胚初代愈伤组织。

作为本发明的大麦成熟胚愈伤组织诱导法的改进：步骤2)中的灭菌为：先将手剥去壳后的离体胚用体积浓度75％乙醇振荡25～35s，去除乙醇后，接着再用体积浓度15％次氯酸钠溶液静置15～25min；得灭菌离体胚；步骤2)中的清洗为：将灭菌离体胚用无菌水清洗2遍，采用颠倒试管的方式，每次3min。

本发明的大麦成熟胚愈伤组织诱导法，步骤1)具体为：将种子用纱布包住，流水冲洗0.5～1h后，去除部分胚乳，即用解剖刀切去种子近芒端5～6mm的组织，从而仅保留胚端4～5mm的部分，即得到长度为4～5mm的离体胚。

本发明的大麦成熟胚愈伤组织诱导法，将清洗后的大麦种子去除部分胚乳，仅保留体积较小的离体胚，相对传统的大麦整粒干种子去壳，能使手剥去壳更易操作且去壳充分；传统的表面消毒采用50％次氯酸钠处理30min，本发明中由于离体胚去壳充分，可大幅度降低次氯酸钠表面消毒的浓度和时间，15％次氯酸钠处理15～20min，即可有效控制污染，同时减小次氯酸钠对成熟胚的损伤，从而能提高出愈率。切去胚乳后，外植体在培养基上出愈反应加快，诱导2～3d后即可明显观察到胚根和幼芽伸长，外植体开始愈伤；而传统方法需要诱导5～7d后才能观察到愈伤组织形成；通过比较多个基因型的出愈差异，发现本发明能使实验进程加快；采用本发明的诱导培养基和诱导方法能有助于抑制离体胚发芽，从而促进初代愈伤组织的形成。

本发明可用于构建大麦成熟胚高效再生体系，该体系可用于比较不同基因型的组培特性差异，进而筛选性状优异的基因型用于构建大麦成熟胚转化体系。利用转基因技术，可研究转基因大麦植株与对照植株在相同遗传背景下，环境效应对植株生理生化、代谢途径方面的影响。尤其可在控制的逆境胁迫(盐害，高温，低温，湿害，重金属)下，研究与胁迫耐性基因在特定环境条件下的表达模式，并利用转基因技术创造新的优质抗逆大麦基因型，从而推动大麦遗传育种进展。

综上所述，本发明所创建的诱导体系能高效获得成熟胚初代愈伤组织，从而促进大麦成熟胚转化、再生体系的构建，推动大麦基因工程研究进展。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明实施例2中两个大麦品种早熟3号和黄金希望(Golden promise)诱导6d的愈伤情况图；

A为早熟3号，B为黄金希望(Golden promise)；

图2为本发明实施例4中早熟3号初代愈伤组织经历继代、胚胎发生、分化、再生各个过程，建成根和叶，最终发育成完整小苗(Bar＝1cm)的图；

A为早熟3号非胚性愈伤组织，B为早熟3号胚性愈伤组织，

C为早熟3号小苗，          D为早熟3号再生苗。

具体实施方式

以下通过实施例进一步对本发明进行描述：

实施例1、一种诱导培养基，该诱导培养基由培养液、2，4-二氯苯氧乙酸和琼脂组成，其制备方法为依次进行以下步骤：

1)、配制培养液：

培养液由以下含量的组分组成：

MnSO₄·4H₂O    22.3mg/L，   KNO₃         2800mg/L，

ZnSO₄·7H₂O    8.6mg/L，    (NH₄)₂SO₄    460mg/L，

H₃BO₃          6.2mg/L，    KH₂PO₄       400mg/L，

Na₂MoO₄·2H₂O     0.25mg/L，     MgSO₄·7H₂O   185mg/L，

CuSO₄·5H₂O       0.025mg/L，    CaCl₂·2H₂O   165mg/L，

CoCl₂·6H₂O       0.025mg/L，    维生素B₁      0.1mg/L，

KI                0.83mg/L，     维生素B₆      0.5mg/L，

Na₂-EDTA·2H₂O    37.3mg/L，     甘氨酸        2mg/L，

FeSO₄·7H₂O       27.8mg/L，     烟酸          0.5mg/L，

脯氨酸            0.5g/L，       水解酪蛋白    0.5g/L，

肌醇              0.1g/L，       麦芽糖        60g/L，

其余为蒸馏水；

将上述组分加以混合即可得培养液。

2)、在每L培养液中加入2，4-二氯苯氧乙酸6mg，利用氢氧化钠调节pH为5.8；然后分装到锥形瓶中，加入琼脂固化，琼脂与培养液的重量比＝0.55％；最后在1.1个大气压、121℃条件下灭菌20min，得诱导培养基。

实施例2、一种大麦成熟胚愈伤组织诱导法，利用实施例1现场制作而得的诱导培养基，以“早熟3号”和“黄金希望”作为2个品种的大麦种子(该大麦种子为上一年收获，并贮存于4℃冰箱，且为健康、饱满的成熟种子)，对这2种大麦种子分别的依次进行以下步骤：

1)、在超净台上，将20～25mL诱导培养基装入已灭菌的直径9cm的培养皿中，冷却凝固。

2)、将上述大麦种子用纱布包住后放入锥形瓶中流水冲洗1h，在吸水纸上用解剖刀切除种子的部分胚乳，即用解剖刀切去种子近芒端5～6mm的组织，从而仅保留胚端4～5mm的部分，得到长度为4～5mm的离体胚。

然后将离体胚用手剥去外壳后放入10mL离心管(已事先灭菌)中，一般每个10mL离心管中放入15～20个去壳离体胚。

在超净台上，先向离心管内倒入75％(v/v)乙醇振荡处理30s；倒去乙醇后，再用新鲜配制的15％次氯酸钠(v/v)静置灭菌处理15min；得灭菌离体胚。

在超净台上，用无菌水清洗上述灭菌离体胚2次，每次3min。

3)、将步骤2)所得的清洗后离体胚在无菌滤纸上吸干水分，用解剖刀将其切成两半(沿颖果腹沟切成两半)，得外植体，将外植体切面朝下平铺于诱导培养基上，每皿设置20～25个外植体。

23℃下暗培养20d后，分离得大麦成熟胚初代愈伤组织。大麦成熟胚初代愈伤组织是在外植体上形成的湿润、柔软、表明光滑的愈伤组织。

在培养过程中，诱导2d后，明显观察到离体胚幼芽和幼根伸长，3d后初代愈伤组织开始生长，并随诱导时间变成逐渐增殖。如图1所示，为培养6d后两大麦品种的成熟胚出愈表现。统计显示品种早熟3号(图1A)和黄金希望(Golden promise)(图1B)的初代愈伤组织诱导率(出愈率)分别高达78.5％和83.0％，污染率为0。

实施例3、发明人选用不同批次(各50批)的“早熟3号”和“黄金希望”(该大麦种子也同样为上一年收获，并贮存于4℃冰箱，且为健康、饱满的成熟种子)重复进行实施例2各50次，结果如下：

“早熟3号”：最低出愈率为73.6％，最高出愈率为89.4％；平均为78.4％。

“黄金希望”：最低出愈率为80.9％，最高出愈率为90.8％；平均为83.7％。

对比实验1、依照文献记载，在选用当年收获的健康、饱满的成熟种子的前提下，“早熟3号”诱导法(严华军，1996，作物学报22：59-65)能达到的出愈率为71.6％，“黄金希望”诱导法(Sharma V K，2005，J EXP BOT 56：1913-1922)能达到的出愈率为72.5±11％。

为了充分证明本发明的优点所在，发明人将实施例3所选用的相同批次(各50批)的上一年收获的“早熟3号”和“黄金希望”分别对应的按照上述2种现有方法进行诱导处理，结果如下：

“早熟3号”：最低出愈率为58.4％，最高出愈率为69.5％；平均为63.1％。

“黄金希望”：最低出愈率为61.5％，最高出愈率为74.6％；平均为68.7％。

实施例4、利用实施例2所得的“早熟3号”初代愈伤组织，构建大麦成熟胚培养再生体系(参考Sharma V K，2005，J EXP BOT 56：1913-1922)：

切下实施例2所得的“早熟三号”初代愈伤组织，转入继代培养；继代培养在25℃黑暗生化培养箱中进行。继代2～3周后发现个体大小明显变大，结构致密化(图2A)。进而转入胚性愈伤组织诱导培养基，胚胎发生培养在黑暗25℃下进行一周；然后2～3周低光照条件下(20～30μE m^-2s^-1)，25℃，16/8小时(光照/黑暗)；胚胎发生4周以后发现愈伤组织颜色变为乳黄色或白色，表面干燥致密并有瘤状突起，具有较强的分化再生能力，个别已经开始分化形成根和芽原基(图2B)；5～6周后(中间有1次胚性继代)，带或者不带绿色结构、带或不带芽原基胚性愈伤组织均转入分化培养基进行低光照培养，再生2～3周，低光照条件同上；20d以后出现绿点并有初生根和叶形成(图2C)，大部分胚性愈伤组织转变成芽/小苗，没有分化出绿点的愈伤组织，继续进行胚胎发生，每两周继代；分化培养35～40d，根和叶初步建成；为了诱导强壮的根系，由胚状体再生而来发育良好的芽/小苗(长3～4cm)转入生根培养基，生根培养在高光照强度下(60～80μE m^-2s^-1)，25℃，16/8小时(光照/黑暗)，培养2～3周(图2D)。为检验正常生长和生产力，可将生根良好的植株，每基因型10株移栽到土壤中并在温室条件下生长，冬性品种植株先进行春化，5～7个月后可收获成熟的种子。

通过此实施例，说明本发明所诱导的初代愈伤组织可成功应用于大麦成熟胚再生体系的构建，进一步证明本发明的有效性。利用大麦成熟胚简易、高效的诱导获得初代愈伤组织，将极大得推动成熟胚转化、再生体系的构建和应用。

对比实验2、以早熟3号为例，参照郭晓琳(2005，植物遗传资源学报，6：418-422)诱导方法，即大麦干种子去壳，以50％次氯酸钠表面消毒30min后，将种子纵切后诱导，早熟3号平均出愈率为51.1％，诱导一周后芽长＞1cm的外植体占诱导总数的45.7％；而本发明诱导早熟3号一周后，平均出愈率为78.4％，芽长＞1cm的外植体仅占诱导总数的17.4％，证明用本发明的诱导培养基和诱导方法能有助于抑制离体胚发芽。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。