通过干细胞营养物进行的器官的形成和复壮以及酒精损伤的器官的再生

摘要

营养干细胞以进行器官再生和预防酒精相关性疾病例如胎儿酒精综合征(FAS)和肝硬化的机制。已发现这些干细胞营养物正面影响皮肤、肝脏、大脑神经元、胰腺和胃肠道。胆固醇补充在暴露于酒精的斑马鱼胚胎中预防胎儿酒精谱系缺陷(FASD)。通过使用斑马鱼模型，发现酒精通过破坏至关重要的信号转导分子sonic hedgehog(Shh)的依赖于胆固醇的激活来干扰胚胎发育。对暴露于酒精的胚胎补充胆固醇恢复了所述分子通路的功能性并且预防了FASD样缺陷的发生。通过脂质化学分析和拉曼光谱法鉴定了用于诊断酒精相关性疾病的新型生物标记物。

说明书

相关申请的交叉引用

不适用

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

不适用

通过引用将以光盘提交的材料合并入本文

不适用

发明背景

发明领域

本发明总地说来涉及通过干细胞培养物进行的器官的形成和复壮 (rejuvenation)以及酒精损伤的器官再生中的突破。已发现营养干 细胞进行器官再生和预防酒精相关性疾病例如胎儿酒精综合征(FAS) 和肝硬化的新机制。已发现这些干细胞营养物正面影响皮肤、肝、大 脑神经元、胰腺和胃肠道。

相关领域的描述

孕妇对酒精的消耗可引起胎儿酒精谱系缺陷(fetal alcohol spectrum defect，FASD)，是一种先天性疾病，其特征在于一系列发 育性缺陷，包括神经的、颅面的、心脏的和四肢的畸形以及全身性 (generalized)生长迟缓。FASD仍然是重大的临床挑战和重要的社 会问题。尽管在描绘促成酒精诱导的出生缺陷的机制中已取得巨大进 步，但我们的知识空白仍然存在；例如，为什么酒精优先在特定器官 中诱导一系列缺陷以及为什么缺陷谱是可重现的和可预测的。

酒精相关性先天缺陷(alcohol related birth defect)仅在美 国每天就产生大约100个智力低于平均IQ的婴儿和许多具有畸形器官 的婴儿。在美国用于这些儿童的护理的费用维持在拨予卫生保健系统 的据估100亿美元的年度费用。胎儿酒精综合征是用于描述一系列影 响神经和心血管系统的发育性缺陷的术语。该综合征还可导致生长迟 缓、面部异常(facial abnormality)和降低的心理机能(lowered mental functioning)。

对于胎儿酒精综合症的严重度是至关重要的是消耗的酒精的量、 消耗的持续时间和妊娠的时机(timing of the pregnancy)。例如， 怀有一个月大胎儿的母亲消耗的酒精可改变大脑的发育；在4至6周， 可改变面部结构、心脏和视力。2至3个月进入胚胎发育，酒精消耗 可导致额外指或趾(digit)的生长。消耗的酒精的量同样重要。在错 误的时间既使消耗相当于一份12盎司啤酒的量可破坏信号传导通路 并导致缺陷。增加胎儿暴露的酒精量导致的综合征严重度的增加。

发明概述

胎儿酒精综合征

申请人已发现胆固醇的补充在暴露于酒精的斑马鱼胚胎中预防 了胎儿酒精谱系缺陷。通过使用斑马鱼模型，申请人已发现酒精通过 破坏称为sonic hedgehog(Shh)的至关重要的信号转导分子的依赖于 胆固醇的激活来干扰胚胎发育。对暴露于酒精的胚胎补充胆固醇恢复 了分子通路的功能性和预防了此类缺陷的发生。斑马鱼中的酒精相关 性缺陷由最低限度的酒精暴露(相当于120磅的妇女饮用一瓶12盎司 的啤洒)引起。所述发现表明即使是少量的酒精对于孕妇也可能是不 安全的，并且也显示胆固醇的补充是预防胎儿酒精缺陷的有效方法。

少量的酒精可干扰胎儿的生长，但加入的胆固醇可帮助预防大批 由于酒精暴露导致的神经和身体缺陷。胆固醇对胎儿发育(fetal development)是如此重要以至于不具有足够高的生理胆固醇水平的孕 妇，即使在不消耗酒精的情况下亦处于产生具有发育问题的婴儿的增 加的风险中。酒精(即使以少量)阻止了胆固醇协调胚胎中参与调控 细胞命运和器官发育的复杂的一系列事件的能力。鼓舞人心的是，给 暴露于酒精的斑马鱼胚胎补充胆固醇可恢复正常发育。

酒精干扰指导胎儿发育的精确地协调的生物化学信号传导通路。 胆固醇是控制组织发育的模式的单个通路所必需的，并且其易于受到 酒精作用的影响。对胎儿酒精综合征的分子基础的该新的深入了解可 具有深远的含意并且提出新的产前保健，所述产前保健可预防在怀孕 期间由酒精消耗引起的发育性缺陷

成体器官的复壮

给酗酒者补充胆固醇可帮助减缓或预防酒精性肝病，甚至慢性酒 精诱导的肝硬化(其特征在于瘢痕组织替换肝组织，从而导致肝功能 的累进丧失)的发生。该发现为确保孕妇不应当使她们的胆固醇降得 太低的当前实践提供了进一步的支持。最近的研究发现，服用称为他 汀类药物的降胆固醇药的妇女处于生育出具有发育问题的婴儿的更大 风险中。

该新概念，干细胞营养物和相关技术，对于即将来临的数年中引 领基于成体干细胞的医疗保健和临床实践也是具有重大意义的。用于 成人保健的该公开的技术将在抗衰老、器官和组织的再生以及酒精相 关性疾病的预防中具有重大影响。

干细胞营养物是具有处方和非处方适用性的食品。因而市场通常 是：

维生素补充剂

目标为特定器官的补充剂

营养食品添加剂

具有多种递送方法的处方药物

用于经历怀孕的妇女的补充剂

结合意在示例性和说明性但非限定范围的系统、工具和方法描述 和举例说明下列实施方案和其方面。在不同的实施方案中，已减少或 消除一个或多个上述问题，然而其他实施方案涉及其他的改进。除了 上述示例性方面和实施方案外，通过参考附图和通过研究下列描述， 另外的方面和实施方案将变得明了。

附图的几个示图的概述

本专利或申请文件包括至少一个彩色制作的附图。在请求和支付 必需的费用后将由官方提供具有彩色附图的本专利或专利申请出版物 的拷贝。

图1图解例证酒精对胚胎的存活和表型的剂量依赖性作用。

图2显示诱导与Hh-抑制的和胆固醇不足的胚胎的表型谱相似的 表型谱的胎儿酒精暴露的作用的复印。

图3显示酒精暴露通过减少Shh的翻译后胆固醇修饰来抑制Hh- 信号传导。

图4图解证明酒精暴露降低胚胎中的胆固醇水平。

图5显示胆固醇补充剂拯救酒精诱导的胚胎缺陷

图6显示窖蛋白-1和Shh在从大鼠肝星状细胞系HSC 8B分离的 蛋白质裂解物中分布的Western印迹分析。

图7显示证明由酒精暴露引起的窖蛋白-1中的Shh减少的免疫沉 淀测定法。

图8显示证明窖蛋白-1和Shh在肝星状细胞中的共定位的免疫组 织化学的复印。

图9显示酒精扰乱Shh与窖蛋白-1在脂质筏(lipid raft)中的共 定位以及Shh在高尔基基细胞器中的积累的Western印迹分析。

图10显示酒精破坏Shh进入ER区室和在高尔基细胞器中积累的 免疫组织化学分析。

图11证明酒精暴露破坏Shh分泌入细胞外基质。

图12显示在转基因斑马鱼的肝中特异性表达的GFP的融合荧光 图像。

图13显示thru细胞流式计量术用于从LFABP-GFP肝分离 GFP/Ptc+细胞。

图14显示FGF/HGF肝诱导培养基中的培养的GFP/Ptc+细胞。

图15显示GFP-P/Ptc+细胞整合入胆小管(bile ductular)上皮 细胞和肝细胞并且开始在预先损伤的肝中表达GFP。

图16显示酒精破坏Shh蛋白在脂质筏中的共定位。

图17显示酒精暴露在胚胎中破坏游离胆固醇/胆固醇平衡和转 运。

图18显示表征酒精和胆固醇的特征(signa ture)的拉曼位移光 谱分析。

图19显示肝星状细胞中的hedgehog活性。

图20是胆固醇衍生物组分预防发育性缺陷的图解例证。

图21显示证明胆固醇和胆固醇样分子预防酒精诱导的胚胎发育 性缺陷的复印。

参照附图的图片举例说明示例性实施方案。本文中公开的实施方 案和图片在被认为是举例说明性的而非限定性的。

发明详述

胚儿酒精综合症的胆固醇治疗

在本申请中，在原肠胚形成过程中，斑马鱼胚胎对低水平酒精的 暴露阻止了通过胆固醇进行的Sonic hedgehog的共价修饰。这导致受 损的Hh信号转导和导致与FASD极相似的永久性发育缺陷的剂量依赖 性谱。此外，用胆固醇补充暴露于酒精的胚胎拯救了Shh信号转导的 损失，并且预防胚胎发生FASD样形态缺陷。总的说来，至关重要的形 态发生素(morphogen)中的简单的翻译后修饰缺陷可促成环境诱导的 复杂先天性综合征。对FASD发病机理的该深入了解可提出用于预防这 些常见的先天性缺陷的新策略。

翻译后的蛋白质修饰在促进基因表达的信号转导调控中起着重 要的作用。通过磷酸化、乙酰化或甲基化产生的蛋白质修饰在胚胎发 生过程中帮助控制事件的适当时机(timing)和顺序；因而，这些蛋 白质的缺陷修饰可以是许多类型的先天性疾病发生的重要原因就不令 人惊奇了。不断积累的证据表明翻译后脂质修饰对于调控蛋白质功能 的重要性。一个实例是Sonic hedgehog(Shh)的胆固醇和palinitoyl 修饰，所述修饰指导该蛋白质的生物发生、细胞运输和功能性¹。

Shh是通过激活Hedgehog(Hh)信号通路在细胞增殖、分化和胚 模式形成(embryonic patterning)中起着中心作用的高度保守的胚 胎形态发生素^2，3。45kDa的Shh前体蛋白通过自动加工 (auto-processing)，然后通过将胆固醇共价连接至N末端蛋白水解 产物来经历修饰⁴。该成熟的经胆固醇修饰的蛋白质(19kDa)可被转运 至细胞膜以进行分泌⁵。分泌后，经胆固醇修饰的Shh配体可立即通过 结合至其受体Patched(Ptc)而起始信号转导。结合后，Ptc解除对信 号转导蛋白Smoothened(Smo)⁶的抑制，然后通过将它们与负调节剂 Fused的抑制剂解偶联来激活Gli转录因子⁷。Gli随后被转移至细胞 核并且调控靶基因包括Ptc⁸、Gli1⁹其本身和NkX2.2的表达¹⁰。

在胚胎发生过程中，Shh在亨森氏结(Hensen′s node)、神经管 的底板、心脏间充质(cardiac mesenchyme)、早期消化道内胚层、 肢芽的后部以及在整个脊索中特异性表达。因为其为形态发生素，因 此Shh也影响其产生位置远侧的组织的发育。Shh显然是腹神经管^11，12、 前-后肢轴(anterior-posterior limb axis)¹³和腹体节¹⁴的模型形 成的至关重要的诱导信号。在人中，一个由Shh或Hh信号传导的其他 组分的突变引起的严重表型是前脑无裂畸形(HPE)¹⁵，是一种其中胎儿 前脑(前脑)不能分开以使形成两侧大脑半球的病症。HPE也是人胚胎 中和FASD的动物模型中的数个胎儿酒精谱系缺陷(FASD)^15-20中的一个 极端表现。类似地，神经管的底板中Shh的产生调控位于基板上面的 神经组分包括运动神经元的祖细胞的发育^12，21。FASD患者展示延迟的 运动发育和受损的精细运动技巧(fine-motor skill)和大运动技巧 ²²。在具有FASD的人中多至89％观察到不同程度的运动迟缓^23-25。事实 上，FASD的诊断标准包括受损的精细运动技巧²⁶。Shh也在神经嵴形 态发生中具有已证明的作用²⁷，并且FASD通常包括神经嵴源性结构中 的缺陷。很清楚，受酒精暴露影响的组织和正确发育依赖于Shh信号 转导的那些组织之间存在明显的交叠。

通过胆固醇产生的Shh的翻译后修饰⁴是个受到密切调控的过程， 该过程是正在发育的胚胎中成熟Shh配体的转运和浓度梯度的建立所 必需的²⁸。固醇和脂肪酸修饰的Shh蛋白形成可溶性的多聚体，其被 包装在微囊中用于长距离转运²⁹。最近的工作已证明取决于此类修饰 的存在或不存在，Shh蛋白质的活性和功能发生显著的变化⁵。经胆固 醇修饰的Still配体在胚胎发生的许多方面中所起的作用可解释被 干扰的胆固醇生物合成在动物发育中的一些致畸效应³⁰。相似的先天 性缺陷发生在于怀孕期饮用酒精的妇女的后代中。

胎儿对酒精的暴露的畸形形成后果是高度可变的，包括一系列称 为FASD的形态缺陷³¹。FASD的表型异常包括神经、颅面、心脏和肢体 畸形，以及全身性生长缺陷和精神发育迟缓(mental retardation) ³²。提出的由胎儿酒精暴露引起的出生缺陷谱系背后的机制包括：细胞 凋亡³³、细胞粘附缺陷³⁴、自由基的积累³⁵、生长因子的失调³⁸以及改 变的视黄酸(retinoic acid)的生物合成³⁷。一些简单和基本问题已 通过这些假说很好地解释，例如，一次或至多数次社交性饮酒怎样引 起胎儿缺陷，酒精优先性地诱导靶向一些器官和组织而不是其他器官 和组织的缺陷的原因，或FASD中看到的缺陷模式是可预测的和可重现 的原因。

酒精还可削弱脊索前板迁移³⁸和破坏Spernann′s Organizer³⁹(在 形成原肠胚中控制胚层的模式形成的信号传导中心)的形成和功能； 调控轴模式形成(axis pattern formation)的特定机制需要高度进 化保守的遗传通路，所述遗传通路牵涉转录调控线路和信号转导通路 ⁴⁰。组织原(organizer)中包含的含有Shh的小囊泡起始在发育过程 中在胚胎模式形成中起着关键作用的信号转导通路⁴¹。因此，在原肠 胚形成过程中抑制Shh信号转导的遗传或环境因子可破坏胚胎的正确 模式形成。有趣的是，在原肠胚形成³⁸过程中暴露于酒精的胚胎具有 与在Hh信号转导⁴²中具有缺陷的胚胎中发现的缺陷相似的缺陷。相似 的表型在胚胎中发生，所述胚胎在固醇的动态平衡中具有遗传缺陷例 如Smith-Lemli-Opitz综合征⁴³(SLOS)，或暴露于降胆固醇剂^44，45。 这些观察表明FASD可由Shh的胆固醇修饰的依赖于酒精的抑制引起。

许多遗传病症可导致胆固醇的生物合成、贮存以及运输的异常调 控。然而，乙醇的摄入可能远非是破坏胆固醇动态平衡的一般机制。 乙醇引起HMG-CoA还原酶活性的抑制，这导致细胞中游离胆固醇减少， 以及循环胆固醇水平降低^46-48。被灌注的大鼠肝的急性乙醇暴露导致 肝匀浆和微粒体中胆固醇耗尽⁴⁹。乙醇特异性抑制肝ACAT活性，这可 导致用于LDLS中的转运的胆固醇酯减少⁵⁰。因此，来自胚胎学、毒理 学和分子生物学的证据表明FASD背后的畸形形成机制将酒精、胆固醇 动态平衡、Shh信号传到和功能性Shh的胆固醇修饰联系在一起。

几个动物模型已用于研究FASD。对于酒精和发育研究，与昆虫和 啮齿目动物模型相比，斑马鱼模型提供了许多有利方面：斑马鱼尺寸 很小，它们具有大量的后代，并且它们具有快速的胚胎发生。该模型 已广泛用于发育生物学、遗传学、基因功能、信号转导和高通量药物 筛选的研究中。所有这些特征使其成为描述酒精诱导的出生缺陷的分 子基础的理想模型。

经显示，在斑马鱼胚胎的早期发育过程中短暂的酒精暴露引起Hh 信号转导的剂量相关性抑制并且产生一系列永久性FASD样缺陷。酒精 诱导的对Hh通路活性的抑制伴随着胆固醇动态平衡的酒精破坏和Shh 配体的胆固醇-修饰减少。用胆固醇补充暴露于酒精的胚胎拯救了Shh 信号转导的丧失，并且预防胚胎发生FASD样形态缺陷。

材料和方法

酒精、环杷明(cyclopamine)和AY-9944处理

根据之前的报导改变胚胎酒精暴露³⁸。将具有绒毛膜的胚胎暴露 于胚胎培养中的6个不同浓度的酒精(例如，0、0.25、0.5、1.0、1.5 和2.0％(v v^-1))。将密封在皮氏培养皿中的胚胎在dome期(即，受精 后(hpf)4.25小时或30％的外包期(epiboly stage))开始时暴露于酒 精6小时，并且在28.5℃下进行温育。接着立即进行酒精暴露，收 获胚胎以进行Hh通路活性、胆固醇含量或组织酒精浓度的分析。将剩 余的胚胎进行洗涤，并在无酒精的配眼镜中温育。然后在受精后1、2 或4天收获胚胎以进行存活和表型分析。环杷明(11-去氧介芬胺 (deoxojervine))是通过作为smoothened蛋白的拮抗剂来抑制Hh 信号转导通路的天然化学物质。AY9944，反式-1，4双-(2-二氯苄基氨 甲基)二氢氯化环己烷通过抑制7-脱氢胆固醇还原酶阻止胆固醇合 成。以与酒精相同的方式施用AY-9944(7.5μM，Sigma-Aldrich) 和环杷明(10.0μM，Calbiochenn)。处理后，洗涤胚胎，然后将其 在正常培养基中温育多至受精后第4天。

阿辛蓝(alcian blue)染色和免疫组织化学

如之前所述进行骨骼结构的染色⁵¹。使用下列一抗(Hybridoma Bank，1∶10)：MF20进行免疫组织化学用来染色心肌和面肌，S46用于 鉴定心室肌以及F59用于鉴定体节中的慢肌祖细胞(slow muscle progenitor)。二抗是缀合Alexa 568的山羊抗小鼠IgG_2g和缀合Alexa 488的山羊抗小鼠IgG_2g(1∶400，Molecular Probes)。固定胚胎并且 对成像。

胆固醇含量的测量

在酒精暴露后，以一式两份重复用氯仿-甲醇(2∶1)从胚胎(n≥14) 提取脂质。然后通过Arnplex Red Cholesterol Assay试剂盒 (Invitrogen)测量胆固醇含量。

组织酒精浓度的测量

在酒精暴露后，以一式三份重复将各处理组的胚胎(n＝38)集中在 一起。使用Alcohol Test试剂盒(Diagnostic Chemicals Limited) 测定经处理的胚胎中的组织酒精浓度。

RT-PCR和实时定量分析

使用RNeasy试剂盒(Qiagen)从胚胎(n＝10)提取总RNA。使用之前 描述的引物(信息列于下表)进行RT-PCR⁵²。

引物信息表

Gapdh    AY 818346  正向5′ACTCCACTCATGGCCGTTAC

         262

                    反向5′TGGTTGACTCCCATCACAAA

Shh      NM 131063  正向5′TCTCGCATTAAGTGGCTGTG

         397

                    反向5′GCTTGTAGGCGAGAGGTGTG

Ptc      NM 130988  正向5′CATCCCATTCAAGGAGAGGA

         282

                    反向5′TGAATGACCCGAGATGAACA

Gli1     NM 178296  正向5′GGGAGCGCCAATAATAATGA

         350

                    反向5′CATTGGCCTGAAGTGTTGAA

Nkx2.2   NM 131422  正向5′CGTATAGCGCCCAGTCTCTC

         219

                    反向5′AGAAAGGGTCAAGCTGCAAA

免疫印迹法

如之前所述⁵¹分离总细胞蛋白质并且使用Mem-PER(r) Eukaryotic Membrane Protein Extraction Reagent试剂盒(Pierce Biotechnology)分离细胞膜蛋白。然后通过12％Tris-HCI SDS-聚丙 烯酰胺凝胶电泳分离Laemmli缓冲液中的蛋白质(40μg)并且将其转 移至PVDF膜。封闭、洗涤膜，然后将其暴露于抗Shh(N-19，Catalog number∶sc-1194；稀释：1∶2.500)和β-肌动蛋白(1∶1.000)的一抗 (Santa Cruz Biotechnology)。使用抗山羊HRP抗体(1∶10.000， Amersham)检测信号。

GLI-荧光素酶报告分子测定法

在集中胚胎(n＝15)的重复实验中进行Gli-荧光素酶报告分子测 定法。简而言之，使用0.5nl的Gli-BS-萤火虫荧光素酶质粒(60ng nl^-1)和海肾(Renilla)荧光素酶质粒(60ng nl^-1，pRL-TK，Promega) 显微注射处于1-2细胞期的斑马鱼胚胎。通过使用Dual-Luciferase Reporter Assay系统(Promega)测定报告分子的活性。就转染率将荧 火虫荧光素酶报告分子的活性对海肾荧光素酶内部对照的活性进行标 准化。

胆固醇的显微注射

在使用或不使用两种质粒的情况下用0.2nl的5μg μl^-1(10 pg)胆固醇(BioVision Inc.)显微注射处于1-2细胞期的胚胎以进行 Gli-荧光素酶报告分子测定。让胚胎发育，然后如之前所述用酒精处 理胚胎。在48hpf时，分析胚胎。

结果

酒精以剂量和时期特异性的方式产生致畸作用

选择斑马鱼模型来评估假说，因为其允许在良好界定的发育时帧 developmental time frame)中暴露于精确浓度的酒精。将斑马鱼胚 胎在发育过程中的两个不同的时间窗(time window)暴露于一系列酒 精浓度(0、0.25、0.5、1.0、1.5和2.0％v/v于胚胎培养基中)。第 一暴露窗发生在1至2细胞期至受精后(hpf)3小时，第二暴露窗发生 在囊胚晚期(late blastula stage)和原肠胚期期间的4.25和10.25 hpf之间。在第一暴露窗期间对酒精的暴露几乎是一致致命的。用最 低酒精浓度(0.25％)处理的897个来自该时帧的胚胎中少于40％存活至 48hpf。

在第二暴露窗期间暴露于酒精的胚胎比在合子期(zygote stage) 中暴露相同水平的酒精的胚胎具有好得多的存活率。在囊胚晚期，暴 露的胚胎的存活也是剂量依赖性的。例如，与在相同发育时帧中暴露 于0.25％酒精6小时的897个胚胎中超过90％的存活率相比，在该时帧 中暴露于3％的酒精的202个胚胎中有10％在48hpf存活。通过以三个 分类：(a)死亡、(b)具有异常表型的存活或(c)不具有异常表型的存活 对酒精作用评分来在48hpf进行更详细的分析。

如图1A中所示，在囊胚晚期过程中，在48hpf时的表型取决于 胚胎暴露的酒精的剂量。例如，在第二时间窗期间暴露于2％酒精的胚 胎中84％存活通过48hpf并且展示异常形态学，虽然只有2.6％的活胚 胎是表型正常的。(关于代表性缺陷的说明参见图2)。该水平的暴露 对于剩余的13％的胚胎是致命的。相反地，在第二暴露窗期间暴露于 0.25％酒精的胚胎中18％是存活的并且在48hpf时具有最低的异常； 大部分(72.3％)是活的并且具有正常表型，＜10％不能存活至48hpf 时间点。这些酒精诱导的表型的频率已表征于表1中。

表1酒精处理的胚胎中表型的频率

酒精¹   n     HPE(％)  独眼(％)^b    心脏水肿  足弓骨质    缺损的体节缩

(％)^a                              (％)      缺损(％)    短的尾巴(％)

0      147   0        0            0         0           0

0.25   116   0.86     0.86         0.86      1.724       1.72

0.5    123   1.62     0            9.76      1.626       1.63

1.0    115   6.96     10.43        17.39     17.39       17.39

1.5    92    28.26    27.17        28.26     33.70       40.22

2.0    110   59.09    57.27        66.36     57.27       60.00

a.胚胎培养基中的酒精浓度v/v(％)，在dome/30％外包期(4.3 hpf)处理胚胎6小时，就HPE、独眼和心脏水肿在48hpf时分析表型。 通过阿辛蓝染色在受精后第4天分析有缺陷的弓骨(arch bone)和缩 短的尾巴。

b.独眼表型包括完全和部分独眼(其具有分离的但间距更靠近 的眼睛)。

如图2中所示的，胎儿酒精暴露诱导与Hh-抑制的和胆固醇不足 的胚胎的表型谱相似的表型谱。(a)不断增加的酒精暴露引起颅至尾 (cranial-to-caudal)的缺陷，包括2天的胚胎中的全身性生长迟缓， (b)酒精诱导HPE、独眼、心包水肿(箭头)和U-形体节，(c)4天大小 的未处理的(野生型，Wt)、暴露于酒精的(2％)、经环杷明处理的(Cyc， Io i，M)和AY-9944-处理(7.5uM)的胚胎的并列(Side-by-side) 比较显示共有发育畸形，包括HPE和独眼、颅面骨(craniofacial bone) (阿辛蓝)/肌肉(箭头，MF20，红色)的发育不良以及心脏管不能成环 (loop)(空心箭头，nryocardium，MF20(红色)，心室肌S46(绿色 /黄色))。

为了确保在我们的模型中看到的酒精诱导的形态学缺陷不仅仅 反映对超生理浓度(supraphysiologic concentration)的酒精的暴 露，申请人在酒精暴露后测量了胎儿组织中的酒精浓度。，斑马鱼胚 胎的组织酒精浓度相应于暴露的胚胎培养基中的酒精浓度 0.25-2.0％，范围是0.71-7.4mM或0.003-0.034g dl^-1(图1B)。 可通过消耗一次或至多数社交饮酒在人类的血液中达到这些酒精浓 度。如图1中所示，将胚胎(n＞64)暴露于浓度不断增加的酒精中，然 后在48hpf时对其进行评估。将胚胎评分为活的/正常、活的/异常或 死亡。这三个分类表示为各股(cohort)中胚胎总数的百分数。斑马 鱼的组织酒精浓度与酒精暴露的水平相关。通常，酒精浓度在 0.71-7.4mM或0.003-0.034g dl^-1的范围内。误差棒(Error bar) 表示三个实验(n＝38条鱼/组)的1标准误差(s.e.m.)。

由胎儿酒精暴露诱导的形态缺陷概括了因HH信号转导缺陷 导致的发育异常

斑马鱼胚胎中的酒精诱导的缺陷概括了在胎儿酒精暴露后在其 他物种中发生的酒精诱导的缺陷。在原肠胚形成过程中以剂量依赖性 的方式进行6小时的短暂酒精暴露导致随后的永久性表形异常，然而 只观察到胚胎的死亡率的适度增加(图1A)。在48hpf时，累积的 颅至尾(cranial-to-caudal)表型在原肠胚形成过程中短暂地暴露于 酒精的胚中非常明显(图2)。

这些胚胎生长迟缓(图2A)，并且展示剂量依赖性的表型谱，包括 神经、颅面、心脏和体轴的缺陷。暴露于高酒精浓度的胚胎具有明显 的HPE、独眼(完全或部分的)、心包水肿、U形体节和严重地按透视法 缩短的(foreshortened)尾巴(图2A和2B)。在原肠(胚)形成过程中 经酒精处理的胚胎和用环杷明、Hh信号传导的特异性抑制剂或 AY-9944(胆固醇生物合成和转运的抑制剂)短暂处理的胚胎之间进行 的比较显示：来自所有3组的胚胎都具有HPE和部分独眼，以及颅面 和肌肉发育不良并且心脏管不能成环(图2C)。这些观察支持有缺陷的 Shh信号传导在FASD的发病机理中的作用并且与酒精通过干扰已切割 的19kDa蛋白质的胆固醇修饰来抑制Shh活性的可能性相符。

酒精破坏SHH通路活性而不显著改变SHH蛋白的表达，但确实减 少经胆固醇修饰的SHH的水平

为了对此进行进一步研究，直接通过检查发育中的胚胎来测量 Shh信号转导活性，所述胚胎在1-2细胞期用Shh应答的、Gli-BS荧 光素酶报告分子构建体进行显微注射⁵³。在酒精暴露后，荧光素酶的 活性(图3A)和Shh调控的基因例如Ptc、Gli1和Nkx2.2(图3B)的表 达都以剂量相关的方式减少。实时定量PCR分析确认了存在关于Shh 靶基因表达的酒精诱导的抑制的阈值。虽然对非常低的酒精浓度 (0.25％)的暴露没有引起Ptc或Gli1的表达的显著变化，但在这些条 件下Nkx2.2的表达减少大约50％。响应0.5％酒精处理，这三个Shh 靶基因的表达下降1.3至1.9倍，1.0至2.0％范围的酒精浓度引起这 些基因的表达下降5至17倍(图3C)。与通过RT-PCR获得的结果相 反，实时定量PCR显示，当将胚胎暴露于高于1.0％的酒精浓度时Shh 的转录减少。值得注意的是，尽管来自完整细胞裂解物(细胞溶质的和 膜的)的Shh蛋白的水平相对稳定，但发生Shh信号传导的抑制。然而， Shh信号传导的抑制与来自从FASD胚胎分离的细胞膜蛋白级分的Shh 的进行性丢失相关(图3D)。鉴于Shh必须由胆固醇共价修饰而锚定 在质膜中，这些结果表明在酒精处理的胚胎中可使Shh的胆固醇修饰 削减。

酒精暴露通过减少Shh的翻译后胆固醇修饰来抑制Hh信号传导。 (a)如图3中所看到的，Hh应答性Gli-荧光素酶活性(通过海肾荧光素 酶进行标准化的)在暴露于酒精中的胚胎中以剂量相关性的方式减少。 误差棒标示4个重复实验的1s.e.m，(b)酒精暴露后，Shh和其靶基因 Ptc、Gli1和Nkx2.2以及GAPDH管家基因的基因表达水平的RT-PCR 分析，(c)通过实时RT-PCR进行的Shh和其靶基因的半定量表达分析， 将数据对GAPDH的内部对照进行标准化。(d)来自暴露于酒精的胚胎的 Shh蛋白的总级分(细胞溶质的和膜的)和膜级分的Western印迹分 析。β-肌动蛋白用作上样对照。

酒精处理改变胆固醇的动态平衡和减少的胆固醇酯含量

如图3中所示，在囊胚晚期中进行的酒精暴露引起膜结合的Shh 的剂量依赖性减少。鉴于胆固醇对Shh的脂化作用驱动其膜定位，这 些结果也表明酒精暴露减少了胆固醇脂的形成。申请人通过测量完整 胚胎提取物中的胆固醇水平测试了酒精暴露在原肠胚形成过程中是否 削减总的固醇动态平衡。酒精暴露以与剂量相关性的方式导致胚胎的 总胆固醇含量减少(图4)。如图4中所看到的，酒精暴露减少了胚胎 中的胆固醇水平。暴露于酒精的胚胎中的总胆固醇和胆固醇酯水平以 剂量相关性方式减少。误差棒表示1s.d。这主要归因于总胆固醇酯 的减少，该总胆固醇酯的减少与经胆固醇修饰的Shh蛋白和Shh信号 传导活性的剂量依赖性减少(图2A和2B)相伴并且与酒精诱导的形态 缺陷的剂量依赖性获得相关：(图2C)剂量越高，则缺陷越严重和范 围越大。与AY-9944降低胆固醇和产生相似的缺陷的证据一起，我们 的发现表明酒精干扰胆固醇动态平衡以及胆固醇贮存的耗尽导致削减 的Shh的胆固醇修饰，从而导致减少的Shh信号传导，这引起了FASD 样表型。

酒精暴露减少胚胎中的胆固醇水平。暴露于酒精的胚胎中总胆固 醇和胆固醇酯水平以剂量相关性方式减少。

胆固醇的补充拯救由酒精引起的HH信号传导缺陷 并且预防胎儿酒精诱导的发育性缺陷

为了确认FASD的该潜在的分子机制的重要性，申请人在暴露于 酒精的胚胎中进行拯救实验。将补充的胆固醇、Gli-BS-荧火虫荧光素 酶质粒和海肾荧光素酶质粒共同显微注射入处于1-2细胞期的胚胎， 然后在原肠胚形成过程中用不同的酒精浓度处理所述胚胎。

随后的研究显示Gli-BS报告分子活性在补充了胆固醇的胚胎中 所有剂量的酒精暴露上得到保持(图5A)。为了确定Shh活性的恢复是 否导致依赖于Hh的细胞分化的拯救，申请人使用特异性鉴定此类祖细 胞的F59抗体研究体节⁴²中的慢肌祖(slow muscle pioneer，MP)细胞 ⁵⁴。在未处理的胚胎中，在48hpf时，申请人观察到MP纤维的经组织 的V形模式，每体节对大约20根纤维。5％DMSO(溶解胆固醇的媒介物) 的显微注射对斑马鱼的发育没有不良作用。相反，暴露于酒精的胚胎 在此时具有紊乱的的、弥散的MP纤维模式。补充有胆固醇的、暴露于 酒精的胚胎具有与未处理的野生型胚胎相似数目和模式的MP纤维(图 5B)。此外，大部分(94.8％)补充有胆固醇的、暴露于酒精的胚胎(n＝58) 总体上表现正常，与83.3％的具有FASD样表型(图5C)的暴露于酒精 的、未进行补充的胚胎(n＝96)不同。因此，胆固醇的补充拯救了酒精 抑制的Shh信号传导，并且在分子、细胞和发育水平上预防了酒精诱 导的缺陷。

胆固醇的补充拯救了酒精诱导的缺陷。(a)在使用胆固醇补充的 暴露于酒精的胚中，拯救Hh应答性Gli-BS-荧光素酶报告分子活性(通 过海肾荧光素酶进行标准化的)。误差棒表示11个重复实验的1 s.e.m。(b)显示未处理的胚胎(Wt)、暴露于酒精的胚胎(2％)以及补充 有胆固醇(10pg)的、暴露于酒精(2％)的胚胎。慢肌纤维(绿色)的 F59染色。(c)在48hpf时的斑马鱼胚的侧面图显示补充有胆固醇的、 暴露于酒精的胚胎的形态拯救。

讨论

在许多之前的研究中，研究者已使用斑马鱼来测定对发育的酒精 相关性作用^55-59。申请人通过使用该模型来扩展这些研究，从而鉴定 了新的分子机制，所述分子机制可能促成酒精的致畸效应，即酒精诱 导的对Sbh的胆固醇修饰的抑制，其随后抑制Shh信号转导；该通路 的抑制似乎在FASD发病机理的发生中起着关键作用。

由于斑马鱼缺乏胎盘和在子宫外发育，并且在胚胎中的乙醇脱氢 酶^60，61在暴露于酒精时(即从4至10hpf)未表达，因而，通过乙醇 的氧化产生的代谢产物不可能是诱导的表型的主要原因。即使在非常 低的组织浓度，酒精(而非来自母体来源或胚胎的酒精代谢产物)可 直接引起发育性缺陷。

直接测量测定了在我们的实验条件下胎儿组织中的从0.71至 7.4mM或0.003至0.034g dl^-1的酒精浓度范围。这些酒精浓度比在 小鼠中诱导FASD的血液酒精水平⁶²低大约5.9至123倍；这些浓度也 比诱导细胞凋亡⁶³和视黄酸不足³⁷或对生长因子具有拮抗效应³⁶的酒 精浓度低4.2至153倍。因此，相对低的胎儿组织酒精浓度也可诱导 FASD样缺陷。在消耗一次12盎司的啤酒后，在55-kg女性中获得该 范围内的血液酒精浓度。这可解释酒精是造成人先天性缺陷的最普遍 的致畸因子的原因，并且表明在怀孕期间不存在安全的酒精消耗水平。

胎儿酒精暴露削减了hedgehog胆固醇修饰和信号传导。斑马鱼 中由酒精诱导的形态学表型概括了在其他物种中看到的FASD的缺陷。 例如，也在具有FASD的人胚胎中报导了相似的缺陷^23，64，84％的小头 畸形(microcephaly)、25％的眼问题、29％的心脏发育性缺陷、关于 躯干肌肉和骨骼的不同问题包括58％的松弛肌肉(slack muscle)、 20％的吞咽/喂养问题、9％的臀部畸形、30％的鸡胸(pidgeon chest)、 7％的漏斗胸(concave chest)以及44％的spinal dimple。FASD患者 还具有颅面异常例如面部异常(95％)、过小牙(16％)、裂腭(7％)和总体 生长迟缓(98％)。因此，申请人已在斑马鱼胚胎中观察到的与乙醇相关 的发育性缺陷似乎恰好与在具有FAS的人中观察到的发育性缺陷相吻 合。

在此处和其他地方呈现的证据^39，65一致证明胎儿酒精暴露抑制 Shh应答基因的转录。值得注意的是，申请人发现斑马鱼胚胎组织中 的总Shh蛋白水平未受到任何受试酒精暴露的显著改变。然而，经处 理的胚胎展示FASD样表型和不成对的Hh信号转导，这表明有缺陷的 Shh信号传导在由酒精诱导的形态缺陷中是至关重要的因素。此外， 申请人现已显示Shh信号转导中的缺陷是由于Shh的翻译后胆固醇修 饰的破坏引起的。这些发现有助于解释单独的Shh mRNA过度表达与拯 救酒精诱导的形态缺陷或Shh应答基因的表达的减少不一致的原因 ^38，65。

在本文中，申请人观察到补充简单的化学物质胆固醇拯救了酒精 抑制的Hh信号转导和预防胚胎产生FASD样形态缺陷。最近，显示固 醇通过Smo直接激活Shh信号传导通路。胆固醇或某些氧代固醇 (oxyterol)用作Smo拮抗剂⁶⁶。该证据表明胆固醇还可直接刺激Smo 以起始Shh信号转导，绕开所述通路并且拯救酒精诱导的依赖于Shh 的发育。有趣地，确定拯救暴露于酒精的胚胎的相同胆固醇补充策略 是否可以保护胚胎免受由其他环境因子(所述因子在Shh信号转导中 诱导与胆固醇相关的缺陷)引起的畸形形成性。

成熟的Shh肽是双重脂质修饰的，其在其C端具有胆固醇部分⁴并且在N端的Cys-24上具有棕榈酸酯附着⁶⁷。N末端脂质是诱导腹前 脑神经元(ventral forebrain neuron)的分化所必需的⁶⁸。相反地， 在N-脂质不存在的情况下，包含C末端脂质的Shh足以诱导小鼠指 (趾)加倍⁶⁹。已产生其中Shh缺乏胆固醇修饰、缺乏棕榈酰化或缺 乏两种类型的脂质修饰的小鼠突变体。这些突变体的功能分析清楚地 表明两种类型的脂质修饰是在早期发育过程中调节Shh形态发生素梯 度的范围和形状所必需的^70，71。关于未来的方向，仍然要确定胆固醇 修饰中的酒精诱导的缺陷是否影响N末端棕榈酰化或脂质筏中Shh的 细胞运输，或是否影响Shh对Ptc的结合亲和力或甚至Shh的梯度形 状和含量。

总的说来，申请人已显示关键的形态发生素的简单的翻译后修饰 缺陷导致复杂的先天性疾病。对FASD的分子基础的该新的了解具有深 远的含意，并且提出可预防FASD发育性缺陷的新型产前干预。

窖蛋白-1与SHH结合从而形成蛋白质复合物

申请人已观察到酒精暴露导致有缺陷的Shh-胆固醇修饰和消减 与质膜结合的Shh的增加，这表明酒精引起该配体的细胞内转运中的 缺陷(Li，2007)。为了获得关于Shh在细胞内分布的详细信息，和作 为针对确定Shh细胞内运输背后的机制的第一步骤，申请人使用非离 子型去污剂蛋白质提取法和密度梯度超速离心来分级 (fractionalize)和分离细胞蛋白质。在超速离心后，申请人从最低 密度(在离心管的顶部)至最高密度(在管的底部)收集了17个单独的 梯度级分(各级分包含500μl)。脂质筏蛋白质的分布主要局限在级 分4至11，如通过与脂质筏结合的蛋白质窖蛋白-1的存在所显示的(图 6A，最下部的图框)。申请人还发现Shh的分布局限在级分6至17； Shh与窖蛋白-1共定位在通过密度梯度超速离心产生的级分6至11 中(图6A，最上方的图框)。

图6显示窖蛋白-1和Shh在从大鼠肝星状细胞系HSC 8B(A)分 离的蛋白质裂解物的密度梯度超速离心级分中的分布的代表性 western印迹分析。免疫沉淀测定法显示Shh和窖蛋白-1在物理上相 互作用，从而形成蛋白质复合物(B，C)。将等量的细胞裂解物用于免 疫沉淀测定，然后使用抗窖蛋白-1抗体(B，最上方的图框，泳道2) 或抗Shh抗体(C最上方的图框，泳道2)通过Western印迹分析来确认 靶蛋白质的表达水平。在抗窖蛋白-1抗体和抗Shh抗体的免疫沉淀中 但未在IgG阴性对照沉淀(泳道1，中间和最下方的B和C)中检测到 窖蛋白-1(B，中间的图框和B最下的图框)和Shh(B最下方的图框和C 中间的图框)。

Shh和窖蛋白-1在密度梯度中的物理共定位可暗示着这两种蛋白 质具有相似的物理特征或它们在功能上相互作用，然而，这不一定表 示它们之间的直接的物理相互作用。因为窖蛋白-1在蛋白质和胆固醇 转运和运输中起着重要作用，因而窖蛋白-1和Shh之间的直接相互作 用具有诱人的可能性。为了确立这些蛋白质是否物理上相互作用以形 成蛋白质复合物，申请人对从大鼠肝星状细胞系HSC8B(其表达高水 平的Shh)分离的总蛋白质进行了一系列免疫沉淀测定。为了确定这 两种蛋白质之间是否存在直接的物理相互作用，申请人在HSC8B细胞 裂解物的免疫沉淀测定中使用抗窖蛋白-1抗体，然后使用抗窖蛋白-1 和抗Shh抗体进行Western印迹分析。申请人使用抗窖蛋白-1抗体验 证沉淀的蛋白质的等量上样(图6A，最上方的图框)。如所预期的，抗 窖蛋白-1抗体沉淀22kDa的窖蛋白-1蛋白(图6B，中间的图框，泳 道2)。此外，其沉淀成熟的20kDa的Shh配体(图6B，最下方的图 框，泳道2)，从而表明窖蛋白-1在物理上与Shh结合。在阴性对照中， IgG抗体不能沉淀窖蛋白-1或Shh(图6，泳道1，中间或最下方的图 框)。此外，申请人通过在HSC8B细胞裂解物的免疫沉淀测定中使用抗 Shh抗体来验证这两种蛋白质之间的相互作用。用于本实验的条件平 行于用于之前的免疫沉淀测定的条件；在该情况下，使用抗Shh抗体 验证相等的蛋白质上样(图6C，最上方的图框)。申请人发现Shh(图 6C，中间的图框)和窖蛋白-1(图6C，最下方的图框)两者都被抗 Shh抗体从HSC8B细胞裂解物免疫沉淀出来。抗Shh和抗窖蛋白-1抗 体各自从HSC8B细胞裂解物中共沉淀窖蛋白-1和Shh的事实强有力地 表明窖蛋白-1与Shh相互作用，从而在该产生Shh的细胞系中形成蛋 白质复合物。

酒精特异性减少窖蛋白-1/SHH复合物在脂质筏中的形成

观察到Shh直接与脂质筏蛋白窖蛋白-1的相互作用，从而产生了 关于之前的工作的有趣问题，在所述之前的工作中，申请人显示酒精 的暴露不影响总的Shh水平，但相反地通过引起细胞质膜上经胆固醇 修饰的、成熟的Shh配体的浓度的剂量依赖性减少来导致有缺陷的Hh 信号转导(Li，2007)。为了确定与质膜结合的Shh配体的这种减少是 否与脂质筏微域(lipid raft microdomain)中窖蛋白-1和Shh之间 的相互作用特异性地相关，申请人研究了酒精暴露对窖蛋白-1和Shh 在密度梯度级分中的共定位的影响。首先，如图6中所示，通过密度 梯度超速离心分级通过抗非离子型去垢剂的细胞提取术分离的细胞蛋 白质。如通过窖蛋白-1的存在所指示的，与脂质筏结合的蛋白质存在 于级分4至11中(图6A，中间的图框和图9A，第二图框)；申请人特 别地将包含脂质筏结合的蛋白质的级分(级分7-9)用于使用抗窖蛋白 -1抗体的免疫沉淀测定。在蛋白质提取和密度梯度超速离心之前，将 HSC8B细胞暴露于不同浓度的酒精(0、0.3、0.5、0.6和0.8％w/v， 相应于0、55、81、109和136mM)以2小时。将来自密度梯度的级分 7至9集中并用于免疫沉淀测定法。

通过使用抗窖蛋白-1抗体的Western印迹分析验证用于这些测 定法的蛋白质的等量上样(图7A)。在这些免疫沉淀测定法中，申请人 测定了在包含窖蛋白-1的脂质筏级分(级分7-9)中发现的Shh的量以 酒精的剂量依赖性的方式减少(图7C)；酒精处理不影响脂质筏级分 中窖蛋白-1的量(图7B)。用于阴性对照免疫测定法的IgG抗体不沉淀 窖蛋白-1或Shh。在图7中，免疫沉淀测定法证明酒精暴露减少位于 脂质筏级分中的窖蛋白-1/Shh复合物中的Shh的量。通过使用抗非离 子型去垢剂的蛋白质提取术，然后进行蔗糖梯度离心，从用不同酒精 浓度(酒精浓度w/v：0.3％、0.5％、0.6％和0.8％，进行2小时)处理 的HSC 8B细胞和从未处理的细胞中分离脂质筏和它们的结合的蛋白 质。抗窖蛋白-1抗体用于从脂质筏制剂免疫沉淀蛋白质；通过使用抗 窖蛋白-1抗体(A)的Western印迹分析确保蛋白质的量相等，并使用 抗窖蛋白-1(B)或抗Shh抗体(C)探测免疫沉淀。脂质筏中窖蛋白-1蛋 白的量不受酒精暴露的影响(B)；然而，酒精暴露以剂量依赖性方式减 少与窖蛋白～1结合的Shh的量(C)。

我们还使用免疫组织化学评估酒精对窖蛋白-1/Shh复合物形成 的作用。在图8中，免疫组织化学揭示了窖蛋白-1和Shh的共定位。 在未处理的肝星状细胞中，窖蛋白-1(A，绿色)和Shh(B，红色)在细胞 质，特别地在细胞质膜(C，黄色，由箭头标示)中共定位。当将细胞 暴露于0.6％(w/v)酒精以30分钟时，Shh水平不受影响；然而，与窖 蛋白-1在质膜上共定位的Shh的量显著减少。使用抗窖蛋白-1抗体(图 8A，绿色)和抗Shh抗体(图8B，红色)双标记的HSC 8B细胞揭示Shh 和窖蛋白-1在细胞质，特别地在质膜(图8C，由箭头标示的黄色)中的 点状的、黑白混合式的(salt-and-pepper)共定位分布。HSC 8B细 胞对0.4％(w/v)(图8D-F)和0.8％(w/v)(图8G-I)酒精暴露30 分钟在窖蛋白-1(图8D和8G，绿色)或Shh(图8E和8H，红色)水 平上不产生显著的变化；然而，点状共定位的颗粒的量以酒精剂量依 赖性方式显著减少，在高酒精浓度(图8F和8I，黄色)下几乎从细 胞质膜消失。生物化学和免疫组织化学分析都指示窖蛋白-1和Shh形 成了蛋白质复合物，以及显示该复合物在质膜中的脂质筏区域累积。 酒精暴露破坏窖蛋白-1/Shh复合物的形成，从而导致Shh在质膜，特 别地在脂质筏结构中的水平减少。这些观察表明酒精暴露引起Shh配 体的分泌和转运的缺陷。

酒精暴露引起SHH至ER内的有缺陷的转运并且 导致在高尔基体区室中的积累

为了开始描绘酒精对产生配体的细胞中的Shh转运的有害作用背 后的详细分子机制，申请人首先将Shh在通过密度梯度超速离心分级 的细胞蛋白质之间的分布与脂质筏(窖蛋白-1)以及高尔基体和ER区 室的标记物的分布相比较。

在图9中，酒精破坏Shh与窖蛋白-1在脂质筏中的共定位，并且 引起Shh在高尔基细胞器中积累。为了帮助分析Shh的分布，通过密 度梯度超速离心分级分离细胞蛋白质；将其分布与脂质筏蛋白质(窖蛋 白-1)、ER和高尔基体区室的标记物的分布相比较。在未处理的细胞 中，Western印迹分析表明Shh蛋白位于密度梯度级分7至17中(图 4A，最上方的图框)；如通过窖蛋白-1的存在所指示的，级分7至11 包含脂质筏级分(图4A，中间的图框)；如通过高尔基体的标记物的存 在所指示的，级分12至17相应于高尔基体/ER区室(图4A，第三图 框)。在暴露于0.8％w/v酒精以30分钟的HSC 8B细胞中，Shh的分 布移出窖蛋白-1/脂质筏和光滑ER级分，并且被限制至密度梯度级分 12至17，所述级分相应于与高尔基体结合的蛋白质和粗面ER级分(图 4B，最上方的图框)。

在从未暴露于酒精的细胞分离的蛋白质提取物中，Western印迹 分析显示Shh广泛地分布在从级分7至17的密度梯度中(图9A，最 上方的图框)；在这些提取物中，与脂质筏结合的蛋白质分布在级分 7至11中，如通过窖蛋白-1(图9A，第二图框)的存在所指示的。与 高尔基体结合的蛋白质存在于级分12至17(图9A，第三图框)中；并 且与内质网结合的蛋白质位于6至9和16以及17(图9A，最下方的 图框)的级分中，如通过特定的高尔基体/ER标记物的存在所证明的。 在从暴露于0.6％酒精(w/v，109mM)以30分钟的HSC 8B细胞分离的 蛋白质提取物中，Shh的密度梯度分布限制在级分12至17中(图9B， 最上方的图框)；这些级分包含与高尔基体和粗面ER(图9B，第三图框) 结合的蛋白质，从而表明酒精暴露使Shh的分布移出包含脂质筏的级 分(图9B，中间的图框)和光滑ER区室级分(图9B，最下方的图框)。

在图10中，显示酒精破坏Shh进入ER区室并且引起Shh在高尔 基细胞器中积累。制备细胞以用于通过使用抗Shh抗体和抗ER或抗高 尔基体的标记物的抗体或两者共染色进行的免疫组织化学分析。在未 处理的细胞中，ER的标记物(PID)(A，绿色)和Shh(B，红色)以点 状颗粒(C，黄色)的形式共定位在细胞质中。然而，在暴露于0.6％(w/v) 酒精以1小时的细胞中，虽然ER标记物(D，绿色)和Shh(E，红色) 的表达水平未改变，但未检测到Shh的点状、极性的分布模式；取而 代之，申请人观察到Shh(E和F)的扩散的均匀分布。G-I：无酒精暴 露；J-L：0.6％(W/V)的酒精暴露以1小时。H和K：抗Shh抗体染色 (红色)；G和J：抗高尔基体的标记物抗体染色(绿色)和I，L：融 合的相应图像(黄色)。酒精处理不影响Shh的表达水平或其在高尔基 体区室中的分布。

为了进一步阐明酒精暴露引起的Shh分泌中的缺陷，申请人使用 共聚焦显微镜检查用抗Shh抗体和抗高尔基体或ER区室的标记物的抗 体染色的细胞。在未处理的细胞中，ER标记物(使用抗PID抗体鉴定 的)(图10A，绿色)和Shh(图10B，红色)以点状颗粒(图10C，黄 色)的形式共定位在细胞质中；然而，当将HSC 8B细胞暴露于0.6％(w/v) 酒精以1小时时，虽然ER标记物(图10D，绿色)和Shh(图10E，红色) 水平未受到显著影响，但不是点状的极性分布模式，申请人观察到Shh 的扩散的均匀分布模式(图10F)。在相同实验条件下，申请人通过重 叠相应的图像(图10I和10J，绿色)来确定Shh(图10E和10K，红 色)和高尔基体的标记物(图10G和10L，黄色)是否共定位，并且发现 酒精处理不显著改变Shh在高尔基体区室中的分布。因而，Shh在高 尔体中积累而不特定地进入光滑ER区室的观察表明由酒精暴露引起 的Shh转运中的主要缺陷发生在高尔体与光滑ER区室之间的运输中。 之前，申请人证明酒精暴露抑制通过胆固醇进行的对Shh的翻译后修 饰，减少了与细胞膜结合的成熟Shh配体的量，从而在我们的斑马鱼 模型中导致一系列缺陷，其表型模拟在患有胎儿酒精综合征的患者中 观察到的缺陷(Li，2007)。在本研究中，申请人已更详细地研究了对 Hedgehog信号转导的酒精抑制背后的机制。申请人已确定酒精暴露通 过抑制Shh与窖蛋白-1形成复合物的能力而导致Shh配体的有缺陷的 细胞内转运，从而阻止了其至脂质筏区域中的质膜的转移。

酒精暴露破坏SHH的分泌

酒精暴露抑制高尔基体中的Shh进入光滑ER，从而，预防在脂质 筏区域形成Shh/窖蛋白-1蛋白质复合物，这导致Shh配体至质膜的有 缺陷的转运，并且导致Shh在高尔基体区室中积累。申请人推论：Shh 的有缺陷的细胞内转运可导致Shh配体至细胞外基质的分泌减少。为 了验证该假说，申请人专注于酒精暴露对Shh在培养的产生Shh的细 胞系HSC 8B的培养基中的积累的作用。申请人使用两个独立的方法： Western印迹分析和Elisa测定法就Shh配体的含量分析从HSC 8B培 养基收集的蛋白质。当HSC 8B细胞在培养皿中的密度达到75％的汇合 时，申请人用含有血清替代物和不同浓度的酒精(0、0.15、0.3、0.6 和0.8％w/v，相应于0、25、55、109和136mM)的新鲜培养基更换培 养基。将培养物再温育另外3个小时，然后收获培养基并且对其进行 浓缩以进行蛋白质分离。如图11A中所显示的，培养基中积累的蛋白 质的Western印迹分析表明酒精以剂量依赖性的方式抑制Shh的分泌； Elisa测定法显示相似的结果。详细地，HSC 8B细胞对0.3％、0.6％和 0.8％(55、109和136mM)酒精浓度的暴露相应于Shh分泌的1.2、4.2 和5.5倍的减少(图11B)。我们的结果描绘了对hedgehog信号转导 通路的酒精抑制的分子机制，其中酒精抑制对Shh的胆固醇修饰，这 阻碍了Shh对窖蛋白-1的结合，阻止了其进入光滑ER，并破坏其随后 至脂质筏区域的质膜的转运，从而导致减少的Shh至细胞外基质内的 分泌。

用作干细胞营养物的胆固醇

胆固醇和其衍生物是用于在胚胎和成体组织中维持依赖于 Hedgehog(Hh)的干细胞的生理功能的营养物。Hedgehog配体和受体 在肝中表达。Hh-应答细胞存在于胚胎早期，但极少存在于成体的正常 肝中。

具有经标记的成熟肝细胞的转基因斑马鱼

转基因斑马鱼(LFABP-GFP)在成熟的肝细胞和胆管细胞 (cholangiocyte)中表达GFP。转基因斑马鱼LFABP-GFP是用于寻找 肝干细胞的模型。在该转基因品系中，所有成熟肝细胞和胆管细胞都 通过用肝脂肪酸结合蛋白(LFABP)启动子驱动表达来用GFP蛋白标记。

在图11中，酒精暴露破坏Shh至细胞外基质内的分泌。收集来 自培养的HSC 8B细胞系的培养基，然后对其进行浓缩以用于Western 印迹分析(A)和Elisa测定法(B)。对不同酒精浓度(0.15％、0.3％、0.6％ 和0.8％V/V，相应于25、81、109和136mM)暴露以3小时可以以 剂量依赖性方式抑制Shh的分泌。^*表示p＜0.05。

在图12中，融合的荧光图像显示GFP在肝中特异性表达。a).2.5 天的胚胎，b，c)8个月大的成年鱼。对成体肝切片的免疫染色验证了 GFP与位于成体肝细胞和胆管细胞中的内源LFABP表达相似。d)使用 GFP抗体进行染色的野生型肝。e、f)使用GFP(e)和LFABP(f)抗体 染色的转基因肝。

这些细胞中的GFP表达在胚胎第2天被起始(图12)并且在整个完 整的生命期(life span)中得到维持。如图12B和12C中所显示的， 可在荧光显微镜下在活的成体斑马鱼(6.5个月)中清楚地观察到GFP 标记的肝脏。可在通过手术从鱼取出的完整肝脏(血管除外)中看到 高水平的GFP表达。通过使用抗GFP抗体，肝切片的免疫组织学分析 揭示这些鱼中的成熟肝细胞和胆管细胞表达GFP；此外，该GFP表达 模式概括了在肝细胞和胆管细胞中但不在非实质细胞 (nonparenchyma)中表达的LFABP的内源表达模式(图12E和12F)。 荧光激活细胞分选术(FACS)用于将肝细胞分成2个群体。GFP阳性群 体包含成熟的肝干细胞和胆管细胞。假定的肝干细胞位于GFP阴性级 分中。因为GFP受特定的基因(LFABP)启动子控制，因而GFP表达限 制在已分化的肝细胞和胆管细胞中。

该独特的特征提供了用于监测GFP阴性细胞是否在离体移植模型 中分化成GFP阳性细胞的理想方式。当将GFP阴性/Ptc阳性细胞移植 入野生型鱼中时，GFP阳性细胞在受体肝中的出现表明一些供体细胞 已分化，成为成熟的肝细胞或胆管细胞或两者。因此，其还允许动态 监测移植的细胞在受体鱼中的分化过程。

转基因斑马鱼

在转基因斑马鱼中，包含0.05％的成体肝细胞群体的非实质细胞 Ptc阳性细胞(GFP-/Ptc+)在形态学上与成熟的肝细胞不同。Ptc阳性 (Ptc+)细胞分离自转基因肝细胞群体的GFP阴性(GFP-)级分。首先， 灌流LFABP-GFP肝脏，然后将FACS用于从GFP+细胞分选GFP-细胞两 次。其次，用抗Ptc抗体对GFP-级分进行免疫染色，然后用缀合有罗 丹明荧光染料的二抗(图13A)进行温育。因此，通过另一轮FACS分 离GFP-/Ptc+细胞(其不具有绿色荧光/高红色荧光)。

在图13中，流式细胞分选术(cell cytometry)用于从LFABP-GFP 肝中分离GFP-/Ptc+细胞(A)。通过实时定量RT-PCR进行的基因表达 分析显示Ptc-抗体分选的GFP-细胞富含Ptc和Aldh2但非Shh的转录 物(B)。

概括地说，GFP-/Ptc+细胞包含大约0.05％的完整肝细胞群体。与 直径大约12-18μm的成熟肝细胞相比，GFP-/Ptc+细胞较小，具有大 约4-6μm的直径。实时定量RT-PCR分析(图13B)确认了这些细胞表 达高水产的Ptc mRNA，比成熟肝细胞高27倍。另一个干细胞标记基 因Aldh2富含于GFP-/Ptc+细胞(比GFP+成熟的肝细胞和胆管细胞中的 表达水平高20倍)。

GFP-/PTC+细胞在体外分化成GPF+细胞

在FGF/HGF肝诱导培养基中，培养的GFP-/Ptc+细胞表达GFP并 且分化成肝细胞样形态。不同的培养时间已示于a)1小时；b)5天；和 c，d)14天。

GFP-/Ptc+细胞(图14A)在通常的培养基中难以培养；在培养的前 两周中无细胞分裂发生，并且细胞逐渐死亡。在尝试几种不同的培养 条件后，发现这些细胞在于28.5℃下温育的涂铺胶原蛋白IV和层粘 连蛋白的培养皿中生长旺盛。配制包含100ng/ml FGF1、20ng/ml FGF4 和50ng/ml HGF的肝细胞诱导培养基。在该培养基中，GFP-/Ptc+细 胞开始表达GFP，表明细胞已分化成肝细胞或胆管细胞或两者。

在培养这些细胞进行5天后，细胞开始表达GFP并且转化如同肝 细胞(图14B)。在培养14天后，形成集落，其中集落中心的细胞表达 GFP(图14C)；GFP阴性细胞的区带，7-9个细胞宽，围绕GFP阳性细 胞。处于集落边缘的这些GFP阴性细胞在经历另外2-3天后变成GFP 阳性，而新的GFP阴性细胞出现(或迁移)，从而在集落的边缘形成 新的GFP阴性细胞区带(图14C和14D)。

GFP-/PTC+细胞在预先损伤的肝中增殖并且 分化成胆小管上皮细胞和肝细胞

在图15中，GFP-/Ptc+细胞整合入胆小管上皮细胞和肝细胞中并 且在移植入野生型受体鱼后开始在预先损伤的肝中表达GFP。移植后1 个月受体鱼(A-B)和肝(C，D)的荧光图像。E-H)。移植后一周(E，H) 和一个月受体肝切片上的GFP抗体免疫染色。I-L)使用GFP抗体在一 个月的受体肝切片上进行GFP蛋白的免疫荧光。I.DAPI核染色，J.内 源GFP，K.GFP抗体染色；L.I-K的融合。

为了确定这些尺寸较小的GFP-/Ptc+细胞是否是多能肝干细胞， 通过将它们移植入野生型斑马鱼和青鳉(medaka)来研究这些细胞的 命运。在移植细胞的前一天，用衣霉素(蛋白质翻译抑制剂)注射受 体斑马鱼以诱导大范围的肝损伤和肝细胞死亡。将100个供体细胞 (GFP-/Ptc+)腹膜内注射入受体野生型鱼。在移植后一周，当在荧光显 微镜下检查时，在受体鱼中观察到GFP表达。所述受体肝的冷冻切片 显示GFP阳性细胞已经重新注入(repopulate)肝。此外，GFP单克 隆抗体染色揭示供体细胞正在经历非常快速的增殖和分化成胆管上皮 细胞以及一些分化成肝细胞(图15E和15F)。在移植后一个月，恢复 的肝包含许多GFP阳性(图15L)肝细胞(10％)，其为移植的GFP-/Ptc+ 供体细胞的后代(图15G和15H)。这清楚地说明，如在细胞培养中看 到的，当移植入具有之前损伤的肝的成年斑马鱼时，Ptc阳性非实质 细胞可分化成肝细胞样和胆管细胞样细胞。这些结果提供了测试本方 案的总体假说：即Hh信号传导可在成体肝中调控干细胞的自我更新、 扩展和分化的坚实基础。

酒精破坏SHH配体与脂质筏的结合， 抑制SHH蛋白的分泌和转运。

酒精破坏Shh蛋白(红色)和脂质筏(绿色)的共定位(黄色) 并且导致如图16中看到的Shh的转运和分泌缺陷。A-C是无酒精处理 的对照；D-E用0.25％(V/V)酒精处理5分钟；G-I用1.0％酒精处理1 小时。脂质筏在A、D和G的共聚焦图像中通过绿色荧光标记；Shh蛋 白在B、E和H中通过红色荧光显示。融合的图像是C、F和I，其中 黄色信号表示Shh和脂质筏的共定位。

为了仔细分析酒精诱导的hedgehog信号传导缺陷的详细机制， 监测Shh蛋白在细胞中的转运(图16)。选择来自成体大鼠肝的肝星状 细胞系HSC8B作为研究Shh运输和脂质筏的共定位的动力学变化的模 型。用Vybrant Lipid Raft Labeling试剂盒(Molecular Probe， Catalog number V34403)标记脂质筏。该标记系统在肝细胞中提供了 方便的、可靠的和极其明亮的脂质筏的荧光标记。

脂质筏是不溶于去垢剂的、富含鞘脂类和胆固醇的膜微区，该微 区在质膜中形成侧面组装结构(lateral assembly)。其使用从霍乱 弧菌(Vibrio cholerae)分泌的并且可特异性结合脂质筏的组成脂质 的细菌毒蛋白-霍乱毒素亚基B(CT-B)的天然亲和力。Vybrant Lipid Raft Labeling试剂盒提供了用于在体内使用明亮的和极其耐光的 ALEXA FLUOR染料荧光标记脂质筏的至关重要的试剂。活细胞首先用 霍乱毒素亚基B(CT-B)的绿色荧光Alexa Fluor 488(或其他颜色染料) 缀合物标记。该CT-B缀合物结合质膜神经节苷脂GM1的五糖链，其选 择性地分配入脂质筏。然后将特异性识别CT-B的抗体用于将CT-B标 记的脂质筏交联入质膜上的不同斑片(patch)，这可通过荧光显微镜 容易地显现。当用浓度为0.25％v/v的酒精处理肝星状细胞恰好5分 钟时，Shh(红色)和脂质筏(绿色)的共定位被破坏(与无酒精处理的相 比，存在较少的黄色)，当酒精浓度增加至1％进行1小时时，Shh蛋白 表达水平不受影响，但几乎所有的Shh蛋白积累在肝星状细胞的内部， 不与脂质筏或细胞膜结合。

因而已发现酒精病理学机制的底线：酒精抑制Hedgehog蛋白的 胆固醇化，在脂锚定蛋白(lipid anchor)不存在的情况下，Shh蛋 白不能与脂质筏结合并且不能分泌；因而这些转运缺陷导致该形态发 生素梯度异常，该异常导致发育问题例如胎儿酒精综合征以及肝硬化。

此外，在许多器官的成体干细胞中，已证明Hedgehog通路在参 与组织再生和修复中起着主要作用。这些干细胞发现于脑、皮肤和消 化系统中。酒精中毒加速衰老过程并且诱导肝损伤，甚至肝硬化。假 设胆固醇和胆固醇衍生物可在维持干细胞功能和预防酒精性衰老疾病 例如肝硬化中起着关键作用。

研究总结

1.基于申请人之前对Ptc-lacZ转基因小鼠所做的工作，申请人 注意到在肝细胞分化过程中，Ptc阳性细胞的数目在胚胎第11天后在 小鼠中显著减少。在成年小鼠中，所有成熟肝细胞缺乏Ptc表达，但 非常少的表达阳性Ptc的细胞位于胆管基板(bile ductular plate) 附近。通过使用蔗糖梯度离心，申请人在肝细胞群体的非实质细胞级 分中发现Ptc阳性细胞。更重要地，可在病理刺激下诱导Ptc阳性细 胞增殖和分化。胆管连接导致Ptc阳性细胞的增殖的显著增加；此外， 这些细胞中的一些是椭圆形细胞(oval cell)谱系的祖先细胞。这些 结果强有力地表明细胞膜蛋白Hh受体Ptc可用于从成体肝中鉴定和分 离静止的成体肝干细胞。

2.鉴于病理刺激诱导Ptc阳性细胞增殖和分化，从成体肝中分 离Ptc阳性细胞。通过使用独特的转基因斑马鱼模型，从成体肝细胞 群体的非实质细胞级分中纯化Ptc阳性细胞。当移植入具有之前损伤 的肝的成体斑马鱼时，这些相对小的Ptc阳性非实质细胞可被诱导分 化成肝细胞和胆管细胞。

3.肝再生是修复损伤的肝(包括长期消耗酒精损伤的肝)所必 需的。不断积累的证据表明酒精诱导的缺陷的病理学机制可牵涉削减 的Hh信号传导。胎儿酒精施用导致与在具有Hh信号传导缺陷或胆固 醇代谢缺陷的动物中看到相似的异常。Hh信号传导控制器官或组织的 发育，其也为胎儿酒精综合征中最易受伤害的靶。在斑马鱼中，申请 人发现酒精可通过破坏胆固醇的动态平衡、在斑马鱼胚胎和大鼠成体 肝细胞中削减胆固醇-Shh修饰和Shh转运来抑制Hh信号传导。补充 的胆固醇拯救了Shh的胆固醇修饰，恢复Hh信号传导并预防酒精诱导 的发育性缺陷。

用于通过脂质化学分析和拉曼光谱诊断酒精相关性疾病 的生物标记物的鉴定

酒精的消耗在上升，特别地在女性中。总地来说，其对胎儿发育 的影响比归因于可卡因、海洛因或大麻的影响更有害。在美国，FAS 是神经发育迟缓和先天性缺陷的首要原因，甚至超过脊柱裂和唐氏综 合征。在美国每年出生大约50,000个具有酒精相关性缺陷的孩子。虽 然有胎教和普通公众的意识，5个怀孕妇女中有一个据认为在怀孕期 间消耗酒精。此外，也报告消耗酒精的妇女中45％直至怀孕的第四周 后才知道她们怀孕了。因此，与酒精相关的出生缺陷的花费据估计每 年97亿美元。虽然关于FAS的大量的研究工作仍在继续，但除了已证 明的事实：酒精对发育中的胎儿是有害的外，几乎未获得结论性的证 据。

检测孕妇当中酒精的使用是针对预防酒精相关性出生缺陷的重 要步骤。由于对母亲使用酒精的报告不足以及在严重的FAS缺陷不存 在的情况下鉴定暴露于酒精的新生儿通常是非常困难的，因此可检测 怀孕期间使用酒精的生物标记物可有助于对怀孕母亲和受影响的婴儿 进行早期鉴定和干预。更重要地，在6岁前对受影响的儿童进行的早 期干预可减少在以后的人生中反社会行为的发生。

我们的观察表明了酒精通过改变胆固醇新陈代谢而产生的致畸 作用的新机制。即使在极低的酒精暴露浓度，申请人观察到斑马鱼胚 胎中胆固醇酯水平和胆固醇酯对总胆固醇的比率的一致并显著的减 小。此外，申请人还发现Hedgehog通路中削减的信号传导，所述通路 在易于受到产前酒精暴露伤害的许多器官和结构的胚胎发育中起着至 关重要的作用。这种改变的信号传导似乎归因于Hedgehog配体的胆固 醇修饰的缺陷。为了在哺乳动物中验证我们的发现，申请人已长期饲 养小鼠酒精饮食并且在胆固醇动态平衡中发现相似的异常。这些机制 研究(mechanistic study)提供了坚实的指征：集中于游离脂肪酸和 胆固醇的代谢特征分析将产生关于酒精暴露的新的成套生物标记物。

基于我们之前的数据，我们的目的是鉴定生物标记物标志，其通 过通过临床试验化学地或通过拉曼光谱法物理地指纹识别代谢中间产 物(例如胆固醇)来检测母体和产前酒精暴露。

拉曼光谱：当光通过物质时，大部分光子继续沿着它们最初的方 向前进，但少部分分散在其他方向上。由于振动而散射的光称为拉曼 散射或拉曼效应。入射光子和拉曼散射光子之间的能量差等于散射分 子的振动的能量。散射光的强度对能量差的曲线是拉曼光谱。拉曼光 谱的本体和强度的测量可特异性地鉴定复杂系统中的分子和它们的浓 度。这是拉曼分光镜的物理化学基础。

酒精处理减少胆固醇酯含量和胆固醇转运

我们的研究数据(图3)表明囊胚晚期中的酒精暴露引起与膜结合 的Shh的剂量依赖性减少。鉴于胆固醇对Shh的酯化驱动其膜定位， 这些结果暗示着酒精暴露减少胆固醇酯的形成。为了筛选该可能性， 申请人测量了完整胚胎提取物中的胆固醇酯含量，所述胚胎提取物在 囊胚晚期中暴露于不同剂量的酒精以3小时。申请人然后通过测量完 整胚胎提取物中的胆固醇水平来测试酒精暴露是否在原肠胚形成过程 中损坏总的固醇动态平衡。酒精暴露以剂量相关性的方式导致胚胎的 总胆固醇含量的减少(图4)。这主要归因于胆固醇酯的减少，与游 离胆固醇的减少几乎无关。

这些倾向也在从长期施用酒精的小鼠模型收集的数据中看到。通 过比较两个对照组，血浆中胆固醇酯对总胆固醇的比率在酒精处理的 组中显著减少(p＜0.001)(图17A)。在图17中，酒精暴露破坏胚胎中 的游离胆固醇/胆固醇酯的平衡和转运。A.长期酒精饲养减少了胆固 醇酯对总胆固醇的比率。B.菲律宾毒素染色显示胚胎体(embryo body)中游离胆固醇的显著减少；油红O染色鉴定了胆固醇酯在胚卵 黄中显著减少。

所有母体游离胆固醇储存在胚卵黄中。当进行酯化反应后，则胆 固醇酯可从胚卵黄转运至胚体。为了研究在酒精处理的胚胎中是否存 在胆固醇的酯化和转运缺陷，申请人还使用两种能够区分游离胆固醇 和胆固醇酯的化学物质测定胚胎体和胚卵黄之间的游离胆固醇和胆固 醇酯的分布。荧光分子菲律宾毒素可以选择性结合游离胆固醇，但不 结合胆固醇酯；另一方面，油红O的染色鉴定中性脂质分子例如胆固 醇酯，但不鉴定极性的游离胆固醇。首先，申请人通过整体固定原位 菲律宾毒素染色定量分析游离胆固醇。菲律宾毒素-游离胆固醇染色的 原位定量密度分析显示游离胆固醇在暴露于酒精的胚胎中差异性地减 少，在胚胎体中显示胆固醇浓度的大量减少，但在胚卵黄中未显示大 量减少。第二，油红O染色揭示胚卵黄中胆固醇脂的显著减少，而在 胚体中其浓度变化很小或无变化(图17B)。不同形式胆固醇的浓度的 差异空间变化表明酒精对胆固醇酯化的抑制可导致从胚卵黄至胚胎体 (组织)的有缺陷的胆固醇转运，从而在胚胎组织中导致血胆固醇过 少(hypocholesteromia)，和从而有缺陷的Shh胆固醇修饰。

通过拉曼光谱进行的酒精相关性生物标记的非侵入性检测

申请人已开发了“多模多路多波长(Multimodal multiplex multi-wavelength)”拉曼光谱法。该系统获得了独特的高光学通量 和荧光排斥(fluorescence rejection)以检测组织中的酒精以及跟 踪酒精暴露诱导的胆固醇标志(signature)的变化。传感器是获得组 织中酒精的拉曼光谱的空间编码的检测光学器件和频谱编码的激发源 的组合(图18A)。

图18就拉曼光谱体内表征了暴露于酒精的胚胎中的酒精和胆固 醇标志：编码孔多波长拉曼光谱法(Coded-aperture multi-wavelength Raman spectroscopy)(A)，其体外检测酒精的灵 敏度可达到低至0.01％(B)。用酒精(3％)、Tomaxifin(5uM)或AY9944 (7.5uM)处理的胚胎中的胆固醇的拉曼标志的变化(C)。

绘图显示酒精的测量基本谱组成幅值(measurement principle spectral component amplitude)和浓度之间的关系。对于大约10％ 至0.01％的组织酒精浓度，所测量的结果在精确性上是优良的(图 18B)。申请人已将拉曼系统用于测试斑马鱼胚胎中的胆固醇。已发现 胆固醇拉曼光谱的标志变化，在拉曼光谱区域1600-1000cm^-1中其与胚 胎对酒精的暴露相关(图18C)。该酒精拉曼光谱的显著变化是围绕 1470和围绕1300cm^-1的峰强度的增加，其中胆固醇峰在酒精的影响 下明显降低。另一个重要的差异是1000至1200cm^-1的精细拉曼特征， 其中可在经酒精处理的胚胎中检测到清楚的峰。通过与其他两个已知 的胆固醇动态平衡抑制剂：Tomxafin(抑制胆固醇酯化)和AY9944(抑 制胆固醇生物合成)相比较，胆固醇拉曼光谱的该变化也是独特的。这 两种药物相关性拉曼光谱的标志也对诊断和监控由这些药物引起的胆 固醇缺陷具有深远的临床影响。

胆固醇衍生物组分拯救大鼠星状细胞中的酒精抑制的 HEDGEHOG信号转导活性

胆固醇衍生物组分拯救大鼠肝星状细胞中的酒精抑制的 Hedgehog信号传导活性。肝星状细胞，也称为Ito细胞，发现于肝的 窦周间隙(窦状隙(sinusoid)和肝细胞之间的小区域)中。星状细胞 是参与肝纤维化的主要细胞类型，所述肝纤维化是响应肝损伤的瘢痕 组织形成。在正常肝中，星状细胞被描述为以静止状态存在。静止的 星状细胞代表了5-8％的肝细胞的总数。不同的环境因素和疾病引起的 肝损伤(例如酒精暴露)可被激活。激活的星状细胞负责分泌胶原瘢 痕组织(纤维化)，这可导致肝硬化。

以一式两份的大鼠肝星状细胞系8H的实验进行Gli-荧光素酶报 告分子测定法。简而言之，将5H细胞培养在补充有10％胎牛血清和青 霉素以及链霉素(100U/ml)的DMEM培养基中。在40-50％的汇合时， 通过使用FuGENE 6转染剂(Roche Applied Science)用Gli-BS-荧火 虫荧光素酶质粒(60ng nl^-1)和海肾荧光素酶质粒(60ng nl^-1，pRL-TK， Promega)(浓度比10∶1)转染细胞。24小时后，用含有不同浓度的酒 精的培养基更换培养基。2小时后，向不同的药物(20α-OHC、 22(S)-OHC、25-OHC和胆固醇)中加入培养基。16小时后，在冰冷的 PBS中洗涤细胞3次，然后通过Dual/Luciferase Reporter Assay System(Promega)进行测定。就转染效率将荧火虫荧光素酶报告分子的 活性对海肾荧光素酶内部对照的活性进行标准化。

当与无酒精处理组(A0)比较时，酒精处理(0.25、0.5、0.75 和1.0％v/v)减少Hedgehog信号传导的活性，如通过肝星状细胞中Gli 结合位点来源的荧光素酶的活性所测量的。在酒精暴露2至3小时后， 加入胆固醇以及其他固醇样组分可将Hedgehog通路功能拯救回与无 酒精暴露组相似的正常水平(表II)。这些受试化学物质和它们的浓度 范围描述于下列表中。

表II

胆固醇和其他胆固醇相似组分恢复酒精处理的肝星状细胞中的 HEDGEHOG信号转导活性

组分                浓度范围      优选的浓度

胆固醇              1-50μM       1-20μM

25-羟基胆固醇       0.1-100μM    5-15μM

22(S)-羟基胆固醇    0.1-100μM    1-5μM

20α-羟基胆固醇     0.1-100μM    1-5μM

角鲨烯              0.1-100μM    1-10μM

胆固醇衍生物组分在斑马鱼胚胎中预防酒精诱导的发育性缺陷

胆固醇和胆固醇样组分拯救组织培养系统中的经酒精处理的大 鼠肝星状细胞中的hedgehog活性。为了测试也在动物模型中起作用的 拯救能力，在1-2细胞期用0.2nl的胆固醇和胆固醇衍生物向斑马鱼 胚胎中显微注射胆固醇和胆固醇样组分(浓度范围列于上面的表II 中)。让胚胎发育4.3个小时，然后如前面所述用酒精处理6小时。 在72hpf时，分析胚胎。

结论

如图21中所看到的，胆固醇和胆固醇样分子预防酒精诱导的胚 胎发育性缺陷。A0：无酒精暴露；A2：2％V/V酒精暴露。Chol：胆固 醇；20a OHC：22α-羟基胆固醇；22-OHC：22-羟基胆固醇；25-OHC：25- 羟基胆固醇和角鲨烯。

当从受精后4.3小时开始用2.0％酒精处理斑马鱼胚胎时，其引起 发育性缺陷，例如前脑平截(forebrain truncation)、独眼和生长 迟缓。这些酒精(2％)处理的胚胎中只有15％在总体形态上发育相对正 常。另一方面，用胆固醇和胆固醇样组分补充这些2％酒精暴露的胚胎， 大体正常发育的胚胎的百分数显著增加，达到大约80％(参见图20和 21)。在图20和21中，显示胆固醇和胆固醇样分子预防酒精诱导的胚 胎发育性缺陷。A0：无酒精暴露；A2：2％V/V酒精暴露。Chol：胆固醇； 20a OHC：22α-羟基胆固醇；22-OHC：22-羟基胆固醇；25-OHC：25- 羟基胆固醇和角鲨烯。

成体组织的胆固醇处理

使用的胆固醇的类型

胆固醇是在所有身体组织的细胞膜中和在所有动物的血浆中转 运中发现的固醇(类固醇和醇的组合)和脂质。

1.胆固醇的化学名称是10，13-二甲基-17-(6-甲基庚基-2- 基)-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-十二氢-1H-环戊烷[a]菲 (phernanthren)-3-醇。

化学式是C₂₇H₄₆O。

如下说明胆固醇的化学结构。

分子量是386.65g/mol。

II.20-羟基胆固醇

III.名称：5-胆石烯-3b，22-二醇(22-羟基胆固醇)

通用名：

符号：

化学式：C₂₇H₄₆O₂分子量(平均)：402.653

IV.名称：5-胆石烯-3b，25-二醇(25-羟基胆固醇)

通用名：

符号：

化学式：C₂₇H₄₆O₂分子量(平均)：402.653

V.角鲨烯

名称：2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，20，24，28，22-二十四碳己 烯

通用名：角鲨烯/菠菜烯/鲨烯

符号：

化学式：C₃₀H₅₀分子量(平均)：410.718

Sigma公司生产这些胆固醇类，它们中的大部分用于研究目的。 迄今已测试了这些分子中的4种分子，它们具有胆固醇结构的相似性。

干细胞营养物

常规胆固醇和其他4种(上面)中的一种的组合对用于支持良好 的t-细胞营养的非处方补充剂是安全的。迄今为止，胆固醇和其他4 种受试形式具有维持干细胞的功能的能力，所述功能依赖于鱼胚胎和 培养的肝细胞系中的hedgehog信号传导。这些功能拯救了由环境因素 (例如酒精和他汀类药物)诱导的发育性缺陷，并且通过提高细胞存 活能力、增殖和再生能力来发挥作用：干细胞营养。

营养补充剂(NUTRIENT SUPPLEMENT)和药物

总的来说，胆固醇是我们身体中的天然分子，我们以每天基础量 从食物中摄入胆固醇。胆固醇(甚至胆固醇样物质)可作为营养物在 市场上销售。所有这些组分也具有巨大的潜力被开发为新药。

这些胆固醇化合物可以与降胆固醇产品例如LIPITOR(其显示许 多副作用)发生冲突。LIPITOR的主要用途是当其超过220mg/dl时降 低胆固醇。将胆固醇降至非常低的水平将损害干细胞和相关的组织再 生和衰老。增加的胆固醇食物疗法的可能副作用可以是血液和组织中 的高胆固醇水平。其他胆固醇样分子可具有在体内产生过多干细胞的 机会，从而其可具有产生肿瘤的高概率。

肝的处理

肝损伤的胆固醇处理为肝星状细胞提供了更高的hedgehog活性。 口服丸剂胆固醇形式应当是最常见和方便的方式。肌肉或静脉注射可 用于特殊的情况。

其他医学病症的处理

本文中列出了一些可用OTC或处方胆固醇处理的医学病症：

化学治疗和放射治疗后的癌症患者；

他汀类药物将胆固醇降得太低；

骨髓移植；

干细胞移植治疗

衰老患者具有营养问题，

丧失记忆

抑郁和压力

怀孕

怀孕时饮用酒精

骨髓的处理

本文中显示胆固醇治疗阻止了总体上整个胚胎的发育性缺陷，但 对于骨髓缺陷的益处没有直接的证据。外源性补充胆固醇是常用的方 法，口服、皮肤递送以及通过肌肉或静脉注射递送。如本文中所报导 的通过注射递送胆固醇。关于骨髓功效的数据仍然缺乏。已证明 Hedgehog信号传导如何通过维持或拯救hedgehog信号传导活性来作 用于骨髓干细胞的过程。OTC或处方胆固醇处理可帮助的一些医疗状 况如下：

进行骨髓移植的白血病患者；

化学治疗或放射治疗后的其他癌症患者；

具有血液干细胞问题的儿童。

脑中的神经元

在斑马鱼中，实验室研究显示胆固醇是如何在总本上预防整个胚 胎的发育性缺陷的，特别是对于前脑和神经管以及神经管缺陷。外源 性补充胆固醇是常用方法，口服、皮肤递送以及肌肉或静脉注射。我 们关于前脑和眼缺陷的数据以及它们的拯救方法呈现在公开的论文 中。

我们显示对于鱼和大鼠肝细胞系上的hedgehog信号传导的个体 胆固醇功能的剂量范围。这些观察显示功效顺序为25-OHC、 22(S)-OHC、胆固醇、20α-OHC和然后角鲨烯(使用常规的胆固醇)。 OTC或处方胆固醇处理可帮助的一些医疗状况是大脑损伤，大部分慢 性脑衰老和疾病。

其他器官

可使用本发明的胆固醇和胆固醇样治疗处理帮助的其他身体器 官是：

皮肤

胰腺

消化道

虽然上面论述了许多示例性方面和实施方案，但本领域技术人员 将认识到某些修饰、扩展(permeation)和添加以及其亚组合。因此 在下文中引入的下列所附的权利要求意欲包括所有此类修饰、扩展、 添加和亚组合(其都在它们真正的精神和范围之内)。