一种具有防治水稻条斑病害及促生作用的生物制剂及应用

摘要

本发明涉及一种防治水稻细菌性条斑病害的生物制剂及其应用，属生物农药技术领域。该生物制剂按常规方法制备。其生产菌株为抗生素溶杆菌YFY02(Lysobacter ginsengisoli)，本发明的菌株具有以下显著特点：(1)菌落圆形，不透明稀液状，培养初期为暗黄色，培养后期为棕褐色或黑褐色，菌体长杆状；(2)该菌株抑菌能力强、抑菌谱广，能在水稻等作物叶面和魔芋、马蹄莲等作物根际定值，可以通过产生抗生素类物质来刺激水稻等作物生长，并对水稻条斑病具有明显稳定的防治效果。本发明将该菌株，通过液体或固体培养，制备成液剂或可湿性粉剂。本发明对水稻条斑病等细菌性病害具有明显稳定的防治效果，综合性状好，易于工业化生产。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种防治水稻细菌性条斑病害的生物制剂及其应用，属生物农药技术领域。

背景技术：

水稻细菌性条斑病(Xanthomonoas oryzae pv.oryzicola)简称条斑病，广泛分布于亚洲的热带和亚热带地区，国内主要分布于华南、华中、西南等地区，是我国继稻瘟病、纹枯病和白叶枯病后的第四大水稻病害，也是我国水稻上重要的检疫性病害。由于近年来感病的水稻品种特别是杂交水稻的大面积推广，南繁和种子调运等，致使该病逐步传播蔓延，病区不断扩大，现已成为我国南方稻区的主要病害之一。该病发生时，蔓延迅速，导致稻叶变黄枯死、空秕粒增多、产量下降，一般减产15％-25％，严重时可达40％-60％，该病严重的威胁着水稻生产。

目前，生产中还没有控制水稻条斑病的特效化学药剂。如我国目前防治水稻条斑病等细菌性病害的主要药剂为有机铜类杀菌剂(龙克菌、噻森铜等)和抗菌素类农药(中生菌素等)，它们在高效、经济、安全性方面均不够令人满意；同时长期大规模使用该类化学药剂，使病原菌对该类药剂产生了抗药性。另外，由于滥用化学农药，导致了化学农药在自然界和食物链中长期残留，造成了环境污染、生态平衡破坏、社会公害等严重后果。随着科学技术的发展和人民生活水平的提高，农药残留等农产品品质问题和农产品的产量问题已经成为当今我国农业发展的两大主要问题，特别是农药残留等药害问题已经引起了几乎全体国民的忧患意识。

而微生物农药具有对非靶标生物安全、毒副作用小、对环境兼容性好等特点，在控制植物病虫害方面倍受青睐。特别在人类环保意识增强的今天，采用高效、无毒、安全无残留、使用简便的微生物农药替代目前副作用大的化学农药已逐步成为世界各国的共识。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种高效、无毒、安全无残留、使用简便的防治水稻条斑病及有促生作用的生物制剂。

本发明采用的生防细菌为抗生素溶杆菌YFY02(Lysobacter ginsengisoli)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏日期：2008年3月17日；保藏号CGMCC NO：2403。

本发明的目的在于通过抗生素溶杆菌YFY02(Lysobacter ginsengisoli)的研究，开发出一种高效、无毒、安全无残留、使用简便的防治水稻条斑病的生物制剂。

抗生素溶杆菌YFY02(Lysobacter ginsengisoli)，系本发明人于2006年发现的一个国内未见报道，可用于水稻条斑病生物防治的新种。

本发明的生产菌株抗生素溶杆菌YFY02(Lysobacter ginsengisoli)，分离自云南省富源县竹园镇的玉米根际，经形态学、培养性状、常规生理生化和Biolog全自动鉴定系统测定，该生防细菌为抗生素溶杆菌(Lysobacter ginsengisoli)的一个新菌株。

该菌株具有以下特征：

(1)菌落圆形，不透明稀液状，培养初期为暗黄色，后期转为棕褐色或黑褐色菌落，菌体长杆状。

(2)该菌株抑菌谱广、抑菌能力强，可在水稻叶面和马铃薯、魔芋等作物的根际定殖。对一些细菌性病害有较好的抑菌效果，其中对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonoasoryzae pv.oryzicola)有显著的抑制作用，抑菌圈直径平均为14.0-26.0mm。另外，该菌株除了活菌抑菌效果较好，其代谢产物粗提物的抑菌活性也很强，对一些细菌病害都有很好的抑菌效果。

(3)具有以下生理生化特征：革兰氏染色阴性，氧化酶和过氧化氢酶阳性，硝酸盐不还原，明胶液化、淀粉和吐温80不水解，吲哚和精氨酸双水解酶和脲酶阴性。能利用葡萄糖产酸，可水解酪蛋白；常规和Biolog生理生化特征：能利用N-乙酰-D-半乳糖、N-乙酰-D-葡糖胺、D-甘露糖、a-D-葡萄糖、D-海藻糖、柠檬酸、3-羟基乙酸、a-丁酮酸、a-酮戊二酸、丙酸、琥珀酸、溴琥珀酸、丙氨酰胺、L-脯氨酸、L-苏氨酸；不能利用L-丝氨酸、L-组氨酸、阿拉伯糖、麦芽糖、密二糖、组氨酸、纤维二糖等。

(4)本发明的抗生素溶杆菌YFY02(Lysobacter ginsengisoli)菌株属于植物根围促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，简称PGPR)，是生物防治的重要因子。该菌株是一种对植物生长有促进作用并对病原菌有拮抗作用的有益细菌。PGPR的主要作用机理是：A.PGPR菌可以分泌植物促生物质，如植物激素、维生素、氨基酸、其它活性有机小分子及衍生物等，从而可以促进作物的生长。B.PGPR菌具有减轻、降低许多作物病害发生的作用。PGPR的生物病害调控机制主要是能够产生抗生素、胞外溶解酶、氰化物和铁载体，还有可能是改变根圈微环境平衡，促进作物生长。也发现一些作物接种PGPR后，有关作物病害防御的化合物水平上升，因此该菌株对病原菌有控制作用。

本发明所述的生物制剂是一种高效、无毒、安全无残留、使用简便的防治水稻条斑病等细菌性病害的生物制剂。该菌株可通过产生抗生素类物质等来刺激水稻生长，并对水稻细菌性条斑病具有高效的控病作用，可用于作物病害生物防治，同时具备了工业化生产的基本性状。

本发明按常规方法制备。即将生防菌株YFY02，通过液体或固体培养，获得包括细菌菌体培养物，通过液体发酵生产，加入润湿剂、展着剂，或与吸附载体按一定比例混合后，经过滤、浓缩、粉碎和晾干，制备成液剂或可湿性粉剂。

本发明的生物制剂的具体制备过程如下：

一、液体发酵制剂生产

1.取得抗生素溶杆菌YFY02(Lysobacter ginsengisoli)。

2.试管种培养(以下均为重量百分比)：

将抗生素溶杆菌YFY02菌株接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为1000毫升NA培养基：蛋白胨5g，蔗糖10克，酵母粉1g，牛肉浸膏3g，琼脂17-20g(培养基用)，蒸馏水(补足1000ml)。22-26℃下培养24-48h，获得试管种。

3.菌种摇床扩大培养

将斜面种子接种茄瓶斜面培养基上，培养基为NA培养基，其配方与前述试管种培养(2)相同。24-28℃下培养24-48h，获得茄瓶种子，供发酵生产用。

4.中试液体发酵生产

工艺流程如下：

试管菌种→茄瓶种子→孢子悬浮液→发酵罐(无菌空气，培养液)→发酵液→填充(轻质碳酸钙)→板框压滤机(弃去滤液)→滤饼→调浆→加入润湿剂、展着剂等→60℃烘干→粉碎→菌粉→质量检查。

具体发酵生产过程如下：

1.茄瓶斜面种子液的制备

将已培养好的茄瓶斜面上的菌苔，用灭菌水洗下，制备细菌悬浮液。

2.接种

采用茄瓶种子，将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐，操作严格，避免污染。升压时罐压不能超过1.5/平方厘米。

3.液体发酵生产

(1)发酵罐培养基：黄豆粉2％，葡萄糖0.3％，蛋白胨0.2％，淀粉3％、碳酸钙0.2％，鱼粉0.5％，花生油0.1％，硫酸铵0.05％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，磷酸氢二钾0.03％，消泡剂0.01％，NaOH600g。灭菌前pH8.5。

(2)灭菌：锅炉的总蒸汽压应在4-5公斤/平方厘米，以保证各管道的蒸汽压力。管道、空气过滤器、发酵罐及培养基的灭菌，均按生产工艺标准进行。

(3)发酵条件的控制

罐温：发酵罐的罐温均控制在25-32℃，通过插入培养基的温度计测量，以夹层内通入冷却水或热水的方法进行调节。

罐压：发酵罐的罐压控制在0.5/平方厘米，通过无菌空气入口和废气排放口进行调节。

搅拌：发酵罐的搅拌速度为200转/分钟。(空气流量：种子罐的空气流量控制在1∶0.5-0.8，对种子的生长发育有利，进入发酵罐后，通气量加大到1∶1。)

抽样检查：每2小时自取样管取样1次，测定pH，并涂片以结晶紫染色镜检菌体形态、有无杂菌的污染等，发酵罐放罐时镜检计数，并用培养基平板方法进行活菌的计数。

培养周期：发酵罐的培养周期约为36-48小时，当培养基中的菌数不再增加时即可停止培养，立即放罐。

液体发酵制剂：经平板计数测定含菌量，含菌量达180亿CFU/ml，供田间防治病害用。

二、固体生物制剂的生产

首先进行生防细菌的液体发酵生产。然后经加入填充剂、板框过滤、打浆、干燥、粉碎，制成可湿性粉剂，供实验用。

具体过程如下：

1.进行生防细菌的液体发酵生产(同前述一相同)。

2.具体加入填充剂：将发酵液压入贮罐，根据以下计算公式加入硅藻土(轻质碳酸钙)作为填充剂，加入后搅拌30分钟。

3.填充剂硅藻土(轻质碳酸钙)的加入量(公斤)＝〖发酵液菌数(亿/毫升)×放罐体积(升)×收率〗/成品菌数-发酵液中的残存物(公斤)。

4.板框过滤：用2公斤/平方厘米的压力，将物料由贮罐压入板框，通过7号滤布过滤，压力应随时调节，使滤液中的含菌量不超过0.2亿/毫升。

5.打浆：将滤饼卸入打浆罐，按加入碳酸钙量的8％加入浓乳100号，或按3％加入SDS，加入适量的滤液均匀搅拌30分钟。

6.干燥：在温度60℃以下的烘干房内通风干燥至含水量5％-8％。

7.粉碎：粉碎时出料温度不能超过60℃，以防止菌体失活。

8.成品质量指标测定：含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照国家企业标准(Q/KWL02-2003)进行，含菌量18亿/克，其余各项指标均符合标准。

具体实施方式：

本发明的生物制剂主要防治对象为水稻条斑病等细菌性病害。本制剂可通过浸种、喷雾等方式施用。本发明的生物制剂已在云南昆明市郊、楚雄州元谋县、曲靖富源县和红河州蒙自县等地的温室和田间小区进行了防效试验，证明了该生物制剂防效显著、稳定，可以有效地控制水稻条斑病，对水稻条斑病的防治效果达到60.24％-67.70％。

本生防制剂可以与其他的杀细菌农药、植物生长调节剂混合使用，但必须保证所混药剂对本发明采用的抗生素溶杆菌菌YFY02(Lysobacter ginsengisoli)无副作用。

本发明的生防细菌制剂一般在作物播种或病害始发期施用。方法是播种前，采用发酵制剂与种球或种子浸(拌)种后，晾干施入土壤中，或在病害始发期将本制剂通过喷雾施用。对水稻细菌性条斑病害发生严重地区可在作物生长过程中追施1至2次。

本发明对水稻条斑病等细菌病害具有明显稳定的防病效果，而且对水稻等作物有很好的促生作用。该菌株YFY02不仅活菌控病、促生效果较好，其代谢产物粗提物的离体抑菌效果也较突出，该菌株综合性状较好，易于工业化生产。

下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例一：生物制剂(YFY02)对水稻细菌性条斑病的药效试验

(一)生防菌株的离体抑菌试验

1.供试材料：

1.1供试菌株抗生素溶杆菌菌株YFY02(Lysobacter ginsengisoli)。

1.2供试病原菌

细菌：水稻细菌性条斑病菌(Xathomonas oryzae pv.oryzicola)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、烟草野火病菌(P.syringae pv.tabaci)和红掌细菌性疫病(Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae)，以上病原细菌由本实验室提供。

1.3供试试剂和培养基

乙酸乙酯、丙酮、甲醇、石油醚等，均为分析纯。R₂A培养基(酵母提取物0.50g；阮间质蛋白胨0.50g；酸水解酪蛋白0.50g；葡萄糖0.50g；可溶性淀粉0.50g；丙酮酸钠0.30g；磷酸氢钾0.30g；七水硫酸镁0.05g；蒸馏水1000.00mL，pH7.2)、PDA培养基(马铃薯200g，琼脂15g，葡萄糖15g，水1000mL)、NA培养基(蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蔗糖10g，琼脂17g，水1000mL，pH7.0)。

2.试验方法

2.1代谢产物粗提物的制备

在装400mL已灭菌的R₂A液体培养基的800mL锥形瓶中接种抗生素溶杆菌YFY02，在25℃条件下培养12天终止发酵。将发酵液离心20min(12,000rpm/min)收集上清液，于上清液中加入等体积乙酸乙酯萃取3次。有机溶媒层用5％NaHCO₃和水洗，再用无水NA₂SO₄脱水，减压浓缩，获得代谢产物粗提物。

2.2代谢产物粗提物对病原细菌的离体抑菌力测定

采用管碟法，用丙酮将乙酸乙酯提取物稀释至5000μg/mL。各浓度重复3次，测量抑菌圈大小。

表1  不同浓度粗提物对不同病原细菌的抑菌圈平均直径

注：抑菌圈平均直径为接种后第2d观察结果。

抗生素溶杆菌YFY02代谢产物粗提物对4种病原细菌的抑制状况见表1，表1表明，代谢产物粗提物对4种细菌都有明显的抑制作用，对水稻细菌性条斑病的抑菌效果最强，在浓度为2mg/mL时，抑菌圈直径达到3.5cm，在浓度为0.25mg/mL时，抑菌直径仍大于1.5cm；对水稻白叶枯病菌的抑制作用次之，在浓度为2mg/mL时，抑菌圈直径为3.1cm，在浓度为0.25mg/mL时，抑菌直径仍大于1.0cm；对红掌细菌性疫病菌的抑制作用中等，在浓度为2mg/mL时，抑菌圈直径为2.6cm，在浓度为0.25mg/mL时，抑菌直径仍大于0.7cm；对烟草野火病菌的抑制作用较差，在浓度为2mg/mL时，抑菌圈直径为2.0cm，在浓度为0.25mg/mL时，就没有抑菌作用。

(二)生物制剂对水稻条斑病的温室盆栽控病试验

1、实验材料与方法

1.1、供试菌剂：生防菌抗生素溶杆菌YFY02液剂

1.2、供试作物：水稻

1.3、防治对象：水稻细菌性条斑病

1.4.实验地点：云南省农业大学植保学院实验大棚，盆栽种植高感水稻条斑病品种黄壳糯，每处理设3个重复。

1.5病原菌和生防菌剂的制备：

水稻条斑病菌菌悬液的制备：供试菌株于接种前3d活化，将水稻条斑病菌菌株细10移植到NA平板上培养36～48h(28℃)，将病原菌从固体培养基上用无菌水洗下制成菌悬液，在摇床上摇匀，用分光光度计在600nm波长下调OD值到0.5，菌悬液浓度相当于3×10⁸CFU/mL，供接种用。

生防菌剂的制备：将抗生素溶杆菌YFY02接种于装有300mL NB液体培养基的三角瓶中，在摇床中(180rpm，25℃)震荡培养3d，用分光光度计在600nm波长下调OD值到0.5，菌悬液浓度相当于3×10⁸CFU/mL。

1.6接种方法：

先将生防菌抗生素溶杆菌YFY02液剂喷雾接种在水稻叶片上(孕穗期)，接种量为100ml/盆，设纯菌CK(仅接水稻细菌性条斑病菌)，每个处理设3次重复，早、晚各喷一次并保温保湿2天。2天后，将配好的水稻条斑病菌细10喷雾接种到喷过生防菌YFY02的水稻上，早、晚各喷一次并保温保湿2天。21天后调查，调查病叶数，病叶级值、总叶数，计算发病率、病情指数。

调查记载和病情分级标准如下：

0级：无病斑。

1级：病斑面积占叶面积的10％以下。

3级：病斑面积占叶面积的11％～25％。

5级：病斑面积占叶面积的26％～45％。

7级：病斑面积占叶面积的46％～65％。

9级：病斑面积占叶面积的65％以上。

病情指数＝∑[各级病株(叶)数×该病级值]×100/调查总株叶数×最高病级数值

病叶率＝调查发病叶数/调查的总叶数×100％

相对防效＝(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数

2.试验结果与分析

通过大棚的盆栽防效试验，从表2可以看出：施用生防菌YFY02生物制剂对水稻条斑病防治效果明显，防治效果达到66.23％。与对照及生产中常用的防治细菌性病害的抗菌素类农药(中生菌素)相比，施用生物制剂YFY02的各个处理的发病率和病情指数都有显著降低，该生物制剂的防效显著，显示了该菌株潜在的应用开发前景。

表2  大棚生防菌YFY02盆栽测试结果(21d)

(三)生物制剂对水稻条斑病的田间控病试验

1、实验材料与方法

1.1、供试药剂：生防菌抗生素溶杆菌YFY02液剂

1.2、供试作物：水稻

1.3、防治对象：水稻细菌性条斑病

1.4.实验地点：云南省楚雄州元谋县水稻试验田，肥力中等，种植感水稻条斑病品种川丰七号，小区为单行区，面积30平方米，每处理设3个重复，随机排列，共9个小区，四周设保护行，按优质水稻栽培措施规范化管理。

1.5病原菌和生防菌剂的制备：

水稻条斑病菌菌悬液的制备：供试菌株于接种前3d活化，将水稻条斑病菌菌株细10移植到NA平板上培养36～48h(28℃)，将病原菌从固体培养基上用无菌水洗下制成菌悬液，在摇床上摇匀，用分光光度计在600nm波长下调OD值到0.5，菌悬液浓度相当于3×10⁸CFU/mL，供接种用。

生防菌剂的制备：将抗生素溶杆菌YFY02接种于装有300mL NB液体培养基的三角瓶中，在摇床中(180rpm，25℃)震荡培养3d，用分光光度计在600nm波长下调OD值到0.5，菌悬液浓度相当于3×10⁸CFU/mL。

1.6接种方法：

先将生防菌抗生素溶杆菌YFY02液剂喷雾接种在水稻叶片上(孕穗期)，设纯菌CK(仅接水稻细菌性条斑病菌)，每个处理设3次重复，早、晚各喷一次并保温保湿2天。2天后，将配好的水稻条斑病菌细10喷雾接种到喷过生防菌YFY02的水稻上，早、晚各喷一次并保温保湿2天。21天后调查，调查病叶数，病叶级值、总叶数，计算发病率、病情指数。

病情分级标准：

0级：无病斑。

1级：病斑面积占叶面积的10％以下。

3级：病斑面积占叶面积的11％～25％。

5级：病斑面积占叶面积的26％～45％。

7级：病斑面积占叶面积的46％～65％。

9级：病斑面积占叶面积的65％以上。

病情指数＝∑[各级病株(叶)数×该病级值]×100/调查总株叶数×最高病级数值

病叶率＝调查发病叶数/调查的总叶数×100％

相对防效＝(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数

2.试验结果与分析

通过在元谋县进行的田间试验，从表3可以看出：施用生防菌YFY02生物制剂对水稻条斑病防治效果明显，防治效果达到62.40％。与对照及生产中常用的防治细菌性病害的抗菌素类农药(中生菌素)相比，施用生物制剂YFY02的各个处理的发病率和病情指数都比农药和对照发病减轻。将两次防效试验结合，都说明生物制剂YFY02对水稻条斑病有很好的防治效果，并且此防效试验具有可重复性。以上田间试验，进一步说明该生物制剂YFY02对水稻条斑病具有稳定、较好的防治效果，也具备了生产上大量推广的基本条件。

表3  元谋县试验田生防菌YFY02测试结果(21d)

实施例二：生防菌株YFY02处理对水稻幼苗的促生作用

1、处理菌液的制备及处理方法：

先将生防菌转接在NA培养基活化，然后划线扩大培养36-48h(28℃)，将生防菌从固体培养基上用无菌水洗下制成菌悬液，在摇床上摇匀，用分光光度计在600nm波长下调0D值到0.5，菌悬液浓度相当于(3×10⁸CFU/ml)，将OD值为0.5的YFY02生防菌液按10倍(3×10⁷cfu/mL)、100倍(3×10⁶cfu/mL)、200(1.5×10⁶cfu/mL)倍、500(6×10⁵cfu/mL)倍、1000(3×10⁵cfu/mL)倍的浓度梯度稀释后分别作浸种处理。浸种48h，每12h更换处理液1次。水稻材料采用黄壳糯。清水为对照。每个处理3次重复，每个重复30粒种子。水稻培养采用常规方法：30℃浸种48h和催芽12h后，将种子放于垫有两层发芽纸的培养皿(直径为100mm，纸用水浸湿)，28℃光照培养，10d调查促生效果。

2、测定指标与方法：

苗高和根长：用直尺测量各处理幼苗和根的长度，其中根以最长的一根为测量对象，以每一处理的所有参试幼苗的平均值作为苗高和根长(cm)。

根数：统计所有长度大于1cm的根的条数，最后同样取每一处理的所有参试幼苗的平均值。

干重：将幼苗与根分开用吸水纸包好，105℃烘箱中杀青，80℃下烘24h，干燥器中冷却至室温后用0.001g天平称重，其重量除以幼苗数即为干重(mg)。

3、菌株处理对水稻幼苗生长的促进作用

试验结果表明(表4)：生防菌YFY02处理对水稻幼苗的生长具有很好的促进作用。在用菌液进行浸种处理中发现，菌液浓度为200(1.5×10⁶cfu/mL)倍液为最优处理，它对水稻苗期生长的促进作用最为明显，苗高等五项测定指标均显著高于对照和其它处理。但10倍、50倍稀释液浸种却抑制了幼苗的生长，各项指标均显著低于对照。本试验采用了菌液稀释10倍、50倍、200倍、500倍和1000倍五个浓度作浸种处理，结果显示，200倍稀释液的促生效果普遍优于其他浓度。

表4  菌株处理对水稻幼苗的生长促进作用