通过在中空载体的表面培养产生纤维素的微生物并提供氧气水平至少为35％的气体来制备中空纤维素管的方法

摘要

本发明涉及一种改进的由微生物产生的中空纤维素管的制备方法，以及由该方法制备得到的中空纤维素管。该方法的特征在于：在中空载体的外表面培养产生纤维素的微生物，并在所述中空载体的内表面提供含氧气体，所述含氧气体所具有的氧气水平高于大气氧。本发明的中空微生物纤维素管的特征在于机械性能得到改进，并且可在外科手术操作中用来替换或修复体内中空器官例如尿道、输尿管、气管、消化道、淋巴管或血管。

说明书

技术领域

本发明涉及一种经改进的由微生物产生的中空纤维素管的制备方 法，以及通过该方法制备得到的中空纤维素管。本发明的这种中空微生 物纤维素管可用作体内中空器官如输尿管、气管、消化道、淋巴管或血 管等的替代品。

背景技术

例如从JP 3 165 774 A1中已经公知，由微生物产生的纤维素(下文 称为“微生物纤维素”)可用作外科手术应用中的生物材料，例如作为腹 壁、皮肤、皮下组织、器官、消化道、食道、气管和尿道以及软骨组织和 去脂整形术的组织植入物。另外，(例如由JP 8 126 697 A2、EP 186 495 A2、JP 63 205 109 A1、JP 3 165 774 A1)已知在微生物纤维素的产生过 程中针对其相应应用可将其塑造成专门的形状，例如薄片形、棒形、圆柱 形和条形等。

另外，从JP 3 272 772 A2和EP 396 344 A2获知，可将具有一定形 状的生物材料用作微腔血管替代品，由此可在可透过氧气的中空支持物(例 如玻璃纸、特氟龙、硅、陶瓷材料、无纺布、纤维)上培养形成血管假体。 所述产生中空微生物纤维素的方法包括：在可透过氧气的中空支持物的内 表面和/或外表面上培养合成纤维素的微生物，所述支持物由玻璃纸、特氟 龙、硅、陶瓷材料制成，或者分别由无纺材料和纺织材料制成。将所述可 透过氧气的中空支持物插入到培养溶液中。将合成纤维素的微生物和培养 基加到中空支持物的内侧和/或外侧。在将氧气(或液体)也加入所述中空 支持物的内侧和/或外侧的条件下进行培养。在中空支持物的表面形成了浓 度为0.01-20mm的凝胶状纤维素。

在EP 396 344 A2中描述的另一种产生中空微生物纤维素的方法是利 用两个具有不同直径的玻璃管进行制备的方法。将一个玻璃管插入另一个 之中，并在两个玻璃管之间的空间对微生物进行为期30天的培养。结果得 到了中空圆柱形的微生物纤维素，通过在狗中进行的血管替代品测试对其 血液相容性和抗血栓形成的性质进行了评估。将狗的一部分降主动脉和颈 静脉用内径为2-3mm的人造血管来替代。一个月之后取出人造血管并检查 凝块附着情况。在缝线区域有凝块沉积，并在人造血管的整个内表面都观 察到轻度附着的凝块。

WO 01/610 26 A1和(Klemm et al.Prog.Polymer ScL 26(2001)1561 -1603)描述了一种通过在圆柱形玻璃基质上培养产生纤维素的细菌来产生 具有一定形状的生物材料(具体而言，在显微外科手术中用作直径为1-3mm 以及更小的血管的替代品)的方法。这一方法得到了具有水平层叠结构的 微生物纤维素，所述微生物纤维素由于机械性能不佳(例如爆破压低)而 不太适合作为较大血管的替代品。

WO 89/12107描述了在气体/液体界面产生微生物纤维素的各种方法。 该申请表明，可通过借助冒泡或搅拌或者通过增加周围气体环境中氧气压 力或浓度来增加细菌可得的氧气浓度，从而提高纤维素的产量。

US 6,017,740和相应的EP 0792935描述了一种在通气并搅拌的发酵 池中产生细菌纤维素的方法。使用增加的氧气压力和含量表明可增加微生 物纤维素的产量。

发明内容

本发明的一个主要目的是提供一种经改进的制备中空微生物纤维素管 的方法，通过在中空载体的外表面上培养产生纤维素的微生物，该方法能 够可重复地制备中空微生物纤维素管。该方法的特征在于：通过在该中空 载体内侧提供含氧气水平高于大气氧的气体来进行培养。所得到的微生物 纤维素管的特征在于具有高机械抗性、高爆破压、高通透抗性。

本发明提供了一种具有由微生物产生的纤维素的中空纤维素管。所述 中空微生物纤维素管通过在中空载体的外表面培养产生纤维素的微生物而 获得，所述中空载体由具有高度氧气通透性特征的无孔材料制成。

已报道，氧气是所产生微生物纤维素的产量的限制因素(Schramm & Hestrin J.Gen.Microbiol.11(1954)123-129)。另一方面，Watanabe 等人(Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995)65-68)报道，与空气相 比，气相中的较高氧压会抑制细菌纤维素的产生。

本发明已经设计出一种产生中空纤维素管的新方法，该方法的特征在 于要为产生纤维素的微生物连续提供合适水平的氧气，这使得可以产生具 有更好机械性能的微生物纤维素。为产生纤维素的微生物连续提供合适水 平的氧气，正如本发明的方法所提供的那样，不仅可以增加纤维素的产量， 更重要的是还可以产生机械性能得到改进的微生物纤维素管。这可通过本 发明实施例2中进一步描述的实验而显而易见，在该实施例中可以看出， 以增加的氧比例产生的微生物纤维素管的爆破压显著升高。

最重要的是，本发明的方法提供了这样一种中空微生物纤维素管，其 中所述纤维素与该脉管壁平行层叠(如实施例1和图5所示)，并且其中 内层具有产生高通透抗性的高密度(如实施例2所阐述)。

因此，与由现有技术中描述的方法产生的微生物纤维素管相比，本发 明产生的微生物纤维素管具有更好的机械性能。

与此前描述的方法相比，本发明的方法还能缩短培养周期。

例如，Klemm等人(WO 01/61026A1，Prog.Polymer Sci.26(2001) 1561-1603)所描述的方法得到了纤维素与脉管壁垂直层叠的微生物纤维 素，这致使脉管具有较差的机械性能。在该方法中所使用的培养周期是14 天。

产生得到的中空微生物纤维素管可为任何形状：线形的、锥形的和/ 或分枝形的。

本发明的另一个目的是提供一种人造生物脉管，所述脉管与活体具有 非常好的相容性，并具有更好的机械性能，可用作人造脉管例如人造血管。

内皮细胞在细菌纤维素管内腔的培养表明，一层汇合的内皮细胞在7 天之后形成(实施例3)，这证明了本发明用于生物医学和心血管应用(特 别是作为人造脉管例如人造血管)的微生物纤维素脉管和管具有非常好的 生物相容性和适合性。还可以将本发明的脉管和管切开，并将由此形成的 小片在例如心血管应用中用作修复原生血管(natice vessel)的补丁。

具体实施方式

本发明的一个实施方案是一种改进的制备中空微生物纤维素的方法， 该方法通过在中空载体的外表面培养产生纤维素的微生物进行。将含氧气 体提供到该中空载体的内侧。

该方法的进一步特征在于：所述含氧气体的氧气水平高于大气氧。优 选地，在氧气水平介于21％-100％、35％-100％、50％-100％、60％-100％、 70％-100％、80％-100％或90％-100％之间进行培养。所使用气体的其余部分可 为任何惰性气体例如氮气、氩气、氦气。氧气百分比以v/v百分比表示。

优选地，在氧气水平为100％时进行培养。

为进一步升高氧分压，所提供气体的压力可高于大气压，例如其气压 比大气压高0.2、0.5、1.0、2.0或5.0巴。

优选地，通过在垂直放置于培养基中的中空载体上培养产生纤维素的 微生物来进行该方法。

含氧气体可从中空载体的顶部、从中空载体的底部或同时从中空载体 的顶部和底部提供。合适的发酵池的实例在图1示出。

产生本发明微生物纤维素管的方法的进一步特征在于：培养周期不到 10天，例如不到7天，或培养周期为5天或5天以下。

优选地，该方法通过在由可通透氧气的无孔材料构成的中空载体上培 养产生纤维素的微生物进行，优选地，所述材料具有高氧气通透性。

通透性(P)是扩散度(D)和溶解度(S)系数的乘积。

P_i＝D_i×S_i

某种材料的氧气通透性取决于该材料的极性、结晶度和玻璃转化温度 (Tg)。氧气是一种疏水性气体，因此与极性材料相比，非极性材料具有较 高的氧气溶解度，并因此具有更高的氧气通透性。结晶度低的材料比结晶 度高的材料具有更高的氧气通透性。因此，优选具有低Tg的材料。

二甲基硅酮具有可以使各种气体快速通透过它的能力。这一现象主要 是由于硅酮链灵活的硅酮-氧-硅酮连接位点以及硅酮橡胶中缺乏结晶度。 从技术层面来讲，通透过无孔物质的过程实际上是一个三相活动。尽管无 孔材料使用尺寸排阻法作为其分离方法，但是通过无孔膜发生通透的过程 是一个复杂得多的达到目的的过程。其中要经过下列步骤：通透性气体吸 附到该材料、扩散通过该材料以及从该材料解吸附。通透速率是通透性气 体的扩散度和溶解度系数的乘积。气体进入二甲基硅酮的溶解度系数与大 部分聚合物的溶解度系数相当，但是通过硅酮的扩散速率比任何其他膜聚 合物都要高出几乎一个数量级。因此，二甲基硅酮对气体的快速运输应归 因于其高扩散速率而非溶解度。

优选地，构成中空载体的材料的氧气通透性高于0.1×10^-7(cm³/cm²/cm/s)、高于1×10^-7(cm³/cm²/cm/s)、高于2×10^-7(cm³/cm²/cm/s)、 更优选高于5×10^-7(cm³/cm²/cm/s)、甚至更优选高于10×10^-7(cm³/cm²/cm/s)。这些数值表示在1个大气氧压力下在1秒钟内通透厚1cm 的1cm²标本的氧气量。因此，构成中空载体的材料的氧气通透性高于0.1 ×10^-7(cm³·cm/cm²·s·atm)，高于1×10^-7(cm³·cm/cm²·s·atm)，高 于2×10^-7(cm³·cm/cm²·s·atm)，更优选高于5×10^-7(cm³·cm/cm²·s·atm)， 甚至更优选高于10×10^-7(cm³·cm/cm²·s·atm)。

优选地，构成中空载体的材料的玻璃转化温度(Tg)低于30℃，更优选 低于20℃，更优选低于0℃，更优选低于-20℃，甚至更优选低于-100℃。

通过中空载体壁的氧气运输量还取决于中空载体壁的厚度。中空载体 壁的厚度优选低于1mm，低于0.5mm，优选低于0.2mm，甚或更优选低 于0.1mm。

总之，通过每平方厘米中空载体壁的氧气运输量是所提供含氧气体的 氧气水平、所提供含氧气体的压力与构成中空载体的材料的氧气通透性的 乘积再除以中空载体壁的厚度。

正如本发明人所指出的那样，微生物纤维素管的机械性能取决于通过 中空载体壁的氧气运输水平。较高的氧气运输量会得到机械强度高的微生 物纤维素管。

本质上，中空载体内侧至外侧的氧气交换是通过氧气的分子扩散而不 是通过微气泡的扩散实现的。有孔材料例如陶瓷材料、纺织材料、ePTFE， 为微气泡通过中空载体的材料提供了可能。气泡在中空载体外侧的形成将 干扰微生物纤维素的形成，会使所形成的中空微生物纤维素有缺陷。

优选地，中空载体由无孔材料构成。无孔材料是指没有孔、通道和裂 缝的材料。优选地，中空载体由硅酮聚合物例如二甲基硅酮、乙烯基甲基 硅酮、氟硅酮、二苯硅酮或腈硅酮构成。硅酮聚合物还被称为聚硅氧烷。

优选地，中空载体的外表面是没有孔或裂缝或其他不规则结构的平滑 表面，因为在中空载体外表面形成的微生物纤维素会具有一个内表面，该 内表面是中空载体外表面的翻版。

优选地，该方法通过在具有分枝的中空载体上培养产生纤维素的微生 物，从而产生具有分枝的中空微生物纤维素管。

本发明提供了一种含有由微生物产生的纤维素的中空纤维素管。该中 空微生物纤维素管优选由本发明的任一方法产生。

本发明还提供了中空微生物纤维素管，其特征在于由层叠的纤维素构 成，其中所述各层与所述管壁平行。

本发明的中空纤维素管由具有高通透抗性特征的微生物纤维素构成。 通透抗性优选高于250N/mm²，高于300N/mm²，高于500N/mm²，并更优选 高于700N/mm²，例如高于1000N/mm²。

本发明的中空微生物纤维素管优选为微生物纤维素管形式。

本发明的另一个目的是提供一种基本由微生物纤维素构成的管状物。 优选地，本发明的微生物纤维素管状物基本由本发明的微生物纤维素管构 成。

本发明的中空微生物纤维素管可为任何形状：线形的、锥形的和/或分 枝形的。中空微生物纤维素的形状和结构由中空载体的形状和结构来决定。

通过使用为分枝形的中空载体，可获得分枝形的微生物纤维素管状物。 通过使用锥形的中空载体，可获得锥形的微生物纤维素管状物。

本发明的微生物纤维素管状物的特征在于具有高爆破压。优选地，爆 破压高于100mmHg，高于150mmHg，高于250mmHg，高于300mmHg， 高于400mmHg，高于500mmHg，并更优选高于800mmHg。微生物纤维 素管状物可通过本发明的方法产生。

本发明的微生物纤维素管状物由具有高通透抗性特征的微生物纤维素 构成。通透抗性优选高于250N/mm²，高于300N/mm²，高于500N/mm²，并 更优选高于700N/mm²，例如高于1000N/mm²。

本发明的微生物纤维素管和微生物纤维素管状物可在外科手术操作中 用来替代动物体或人体中的脉管，例如作为人造的血管、尿道、输尿管、 气管、消化管或淋巴管。

可将本发明的微生物纤维素管和微生物纤维素管状物切开，并将形成 的小片用于在外科手术操作中修复动物体或人体的脉管，例如血管、尿道、 输尿管、气管、消化管或淋巴管。

因此，本发明提供了一种人造生物小片，它基本由已被切开的本发明 微生物纤维素管构成。

本发明的又一目的是提供一种人造血管，其与活体具有非常好的相容 性，并具有更好的机械性能。本发明的人造血管可由本发明的方法产生。 本发明的人造血管可由本发明的微生物纤维素管构成。

在本发明中，可使用任何类型产生纤维素的微生物。例如，可提及的 是木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasturianus)、醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)、恶臭醋杆菌 (Acetobacter ransens)、胃八叠菌(Sarcina ventriculi)、木糖苷杆 菌(Bacterium xyloides)、属于假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌、属于 农杆菌属(Agrobacterium)的细菌和属于根瘤菌属(Rhizobium)的细菌。优 选地，使用木醋杆菌(也称为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus))菌株，例如但不限于木醋杆菌NCIB 8246 ATCC(美国典型培养 物保藏中心)保藏号23769、木醋杆菌NQ5 ATCC保藏号53582或木醋杆菌 BPR2001 ATCC保藏号7000178。

使用上述微生物，通过常规细菌培养方法形成并累积纤维素。也就是 说，将微生物加入常规营养肉汤，该肉汤含有碳源、氮源、无机盐，必要 时可含有有机微量营养素例如氨基酸和维生素，并且培养在20-40℃的温 度下进行。

本发明制备中空微生物脉管的方法包括在中空载体外表面培养产生纤 维素的微生物。更具体而言，将该中空载体浸入培养液中，将产生纤维素 的微生物和培养基提供到中空载体的外侧，并通过将含氧气体引入中空载 体内侧来进行培养。如果以这种方式进行培养，那么可在载体表面形成厚 度为0.01-20mm的凝胶状纤维素。取出中空载体，可获得只由纤维素构成 的具有一定形状的中空物体。

由于由此制得的纤维素含有微生物细胞或者培养基成份，因此该纤维 素可根据需要进行洗涤，这一洗涤可通过单独使用弱碱、弱酸、有机溶剂 和热水进行，或者以其任何组合形式进行。

可用作培养基的有：多元醇类例如甘油、赤藻糖醇、乙二醇、山梨糖 醇和麦芽糖醇，糖类例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖和乳糖，天然 的和合成的高度聚合的物质例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、 羧甲基纤维素、琼脂、淀粉、海藻酸盐、黄原胶，多糖类，寡糖类，胶原， 明胶和蛋白；以及水溶性极性溶剂例如乙腈、二噁烷、乙酸和丙酸。这些 培养基可以单独使用，或以其两种或多种的混合物形式使用。另外，可将 含有合适溶质的溶液用作培养基。合适培养基的实例是Schram Hestrin Media(Schramm et al.Biochem.J.67(1957)669-679)(葡萄糖20g/l、 酵母提取物5g/l、蛋白胨5g/l、Na₂HPO₄ 2.7g/l、柠檬酸·H₂O 1.15g/l， pH 5)、CSL培养基(Matsuoka et al.Biosci.Biotechn.Biochem.60(1996) 575-579)(果糖40g/l、KH₂PO₄ 1g/l、MgSO₄·7H₂O 0.25g/l，(NH₄)₂SO₄ 3.3 g/l、维生素混合物1％、盐混合物1％、CSL(玉米浆)20ml/L、乳酸盐0.15％， pH 5-5.5)、Son培养基(Son et al.Biotechnol.Appl.Biochem.33(2001) 1-5)(葡萄糖15g/l，(NH₄)₂SO₄ 2g/l、KH₂PO₄ 3g/l、MgSO₄·7H₂O 0.8g/l、 FeSO₄·7H₂O 5mg/l、H₃BO₃ 3g/l、烟酰胺0.5g/l、乳酸盐6％)或ATCC培 养基(酵母提取物5g/l、蛋白胨3g/l、甘露醇25g/l、琼脂15g/l)。

3.5-6之间的任何pH值均适合实施本发明的方法。

培养基可循环使用，并用新鲜培养基连续更换。

中空微生物纤维素被用作人造血管时，如此制备得到的中空微生物纤 维素可直接替换活体中的血管，或者可将此中空微生物纤维素进行某些预 先处理。例如，将内皮细胞附着于中空微生物纤维素的表面就是一种预先 处理。

该中空微生物纤维素与活体尤其是血液有着非常良好的相容性，并且 具有高的表面取向性和高的机械强度。

本发明还提供了一种使用本发明的微生物纤维素管作为脉管假体来进 行外科手术操作的方法，所述方法包括切开接受者的脉管，并将该微生物 纤维素管连接到所述接受者的脉管。在一个优选的实施方案中，所述接受 者脉管为血管，最优选为动脉。

本发明还提供了一种使用微生物纤维素小片来修复原生血管进行外科 手术操作的方法，所述小片是通过将本发明的微生物纤维素管切开获得的， 所述方法包括将所述微生物纤维素小片连接到所述接受者脉管。在一个优 选的实施方案中，所述接受者脉管为血管，最优选为动脉。

附图说明

图1.发酵池

A)(1)进气口，(2)接种管，(3)塞子，(4)由氧气可通透材料构成的中 空载体，(5)耐热(pyrex)玻璃管，(6)含有产生纤维素的细菌的培养基，(7) 塞子。

B)(1)进气口和中空载体的固定器，(2)接种管，(3)垫圈，(4)由氧气 可通透材料构成的中空载体，(5)耐热(pyrex)玻璃管或不锈钢管，(6)培养 基。

图2.微生物纤维素管的图像。A)长的线形管。B)有分枝的管。C)具 有不同直径的管的横截面。

图3.SEM(扫描电镜)图像：A)以100％氧气培养的微生物纤维素管， B)以35％氧气培养的微生物纤维素管。

图4.SEM图像：以35％氧气培养的微生物纤维素管的A)内表面和B) 外表面。

图5.SEM观察到的细菌纤维素管的横截面。A)以20％氧气培养的微生 物纤维素管，B)以35％氧气培养的微生物纤维素管，C)以50％氧气培养的微 生物纤维素管，和D)以100％氧气培养的微生物纤维素管。

实施例1

发酵

浸没在70ml玻璃管中的管的发酵通过将硅酮管(直径为4×0.5mm；50 shores；Lebo production AB，Sweden)用作氧可通透材料来进行。将在大 气压下具有不同氧气浓度(即21％(空气)、35％、50％和100％)的气体混合 物提供到氧可通透材料中。将复合培养基(CSL)(Matsuoka et al.Biosci.， Biotechnol.，Biochem.60(1996)575-579)和略经改进的Son等人所述 的合成培养基(Bioresource Technology 86(2003)215-219)用作发酵培 养基。使用标准的酶学试剂盒(R-Biopharm，Food Diagnostics AB Sweden) 来测量葡萄糖和果糖消耗情况和pH。用于生物合成的菌株是木醋杆菌亚种 sucrofermentas BPR2001，商品号：1700178^TM。该菌株购自美国典型培 养物保藏中心。在Rough烧瓶中将六个形成纤维素的集落培养两天，所产 生的细胞浓度为3.7×10⁶cfu/ml。通过剧烈震荡将细菌从所得到的BC水 凝胶中释放出来，并每个发酵池中(图1)加入2.5ml。五天之后完成发酵， 通过在60℃于0.1M NaOH中煮沸4小时并随后在Millipore^TM水中反复 煮沸来纯化BC管和获自预培养的水凝胶。通过高压20分钟(120℃，1巴) 将该BC管进行蒸汽灭菌，并将其保存在冰箱中，直至进行表征和冷冻干燥。 在50℃烤箱中干燥该管直至记录不到重量变化之后，记录下产量。

通过升高用于复合培养基的氧气比例，纤维素产量略有增加，见表I。

表I.通过在不同氧气水平下培养所获得的微生物纤维素的产量

  氧气比例[％]   21   35   50   100   平均产量[mg]   0.0377   0.0398   0.0451   0.0599   标准误   3.6744e-3   3.3829e-3   2.5560e-3   1.2865e-3

O₂为100％时的产量显著高于O₂为20％和35％时各自的产量。这一结果 与Watanabe等人(Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995)65-68)所报 道的结果相反。

形态学

扫描电镜(SEM)

SEM用于研究管的内表面、外表面以及截面的形态学。首先将该材料 在液氮中冷冻，然后使用Heto PowerDry PL3000在-52℃下冷冻干燥24小 时。干燥后的材料随后用金包被，之后再用LEO 982 Gemini场发射SEM进 行分析。

微生物纤维素管的图像参见图2。将硅酮支持物变得更长、更窄、更 宽、更短之后，分别获得了更长、更窄、更宽或更短的纤维素管。因此， 对于长度是没有限制的，而对于根据由Klemm等人((Progress in Polymer Science 26(2001)1561-1603；WO 01/61026))所报道的静态法所产生 的细菌纤维素而言，对长度却是有限制的。另外，这一发酵技术速度很快， 大约七天的时间就可以生产一个管，并且能生产锥形和有分枝的管。

细菌纤维素管内侧和外侧的SEM图像可参见图4。所有的细菌纤维素 管均具有平滑的内表面和有孔的外表面。已表明，更为平滑的表面会改善 EC的附着和增殖，因此，管的平滑内表面将是一个有利的特征(Xu et al. J.Biomed.Mater.Res.Part A，71(2004)154-161)。管外层更为开 放的结构对于组织向内生长并因此致使BC脉管向机体内生长是有利的。

在不同氧气水平下产生的管的横截面表现出层叠结构，参见图3和图 5。层叠部分的厚度随所提供气体中的氧气水平而异。该厚度随氧气水平下 降而变得更薄，与氧气为100％时相比，氧气为35％时薄约1.5倍，氧气为 20％时薄约2.5倍。图5A、B和D。

可将此结构与静态培养细菌纤维素时(如此前Klemm等人(Prog. Polymcr Sci.26(2001)1561-1603)所述)获得的水平层叠结构相比较。 最可能受欢迎的是具有与脉管壁相平行的层，因为由血流所引起的张力与 血管壁成水平方向。

实施例2

机械性能

爆破压测量

通过沿水柱施加压力就形成了压力增加的液流。在上部、中部和下部 的三个位置测试所有的管。将脉管暴露于每10秒增加1巴的压力下。记录 下发生爆破时的压力。

基本结构和通透抗性

在TA-XT2i Texture分析仪(Stable Micro Systems，Surrey，England) 上进行测试。用剪刀剪切一次将管样品切开。将样品置于样品固定器中的 孔上，并紧紧地锚定到该固定器上。使用直径为2mm的探针，以及5kg 的测压元件。以0.1mm/秒的速度测量通透力。然后记录下力的峰值，并 与不同材料相比较。在用50％氧气和100％氧气培养得到的管上进行测试； 它们的峰值分别为1500N和3800N。由此可计算得出各测试管的通透抗 性分别为477N/mm²和1260N/mm²。

结果

对机械性能进行了两种不同的评价，即爆破压和通透抗性。爆破压结 果遵循在产量部分观察到的相同的模式，参见表II。

表II.在不同氧气水平下生长的微生物纤维素管的爆破压

  氧气比例[％]   21   35   50   100   平均爆破压[mmHg]   300   517   709   885   标准误   0.0229   0.0528   0.0694   0.0687

爆破压测量结果清楚地表明，随着氧气水平升高，管变得更为结实， 即在更高的压力下才爆破。在氧气为21％和35％时制备得到的管与在氧气为 50％和100％时制备得到的管的性能有显著差异。在高于大气氧气的氧气比 例下产生的管就可承受血压即250mmHg，在以氧气比例为100％产生的管 可承受的压力达到最大值880mmHg。我们认为，管需要具有高密度的内 层来承受一定的压力。随着氧气比例的增加，空气/培养基界面处的内层更 高的密度以及层数的增加，这可能是爆破压随氧气比例增加而增加的原因。

实施例3

细胞接种

从人隐静脉的健康部分分离内皮细胞(HSVEC)。静脉或者是冠状动脉旁 路手术的富余部分，或者取自对曲张静脉进行手术的患者。使用酶学技术 分离HSVEC。将细胞接种到BC管的管腔侧，并在静态条件下在95％空气 /5％CO₂的潮湿氛围下以及37℃的温度下培养7天。用3.7％福尔马林固定细 胞，并用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐，DAPI(Sigma-Aldrich)对细 胞核进行复染色。

内皮细胞在细菌纤维素管腔的培养表明在7天之后获得了一层汇合的 内皮细胞。