使用非对称流场流分馏方法优化小粒子分离的方法和装置

摘要

通过给出同一非对称流场流分馏装置A4F内一定范围的可用通道长度，允许改进的试样分离方法的一种新型的A4F装置被描述。借助这样的装置，通过实施作为通道长度函数的分馏，试样可被最优地分离。在同一A4F装置内改变通道长度的能力迄今为止还未实现。

说明书

背景技术

【0001】对分离诸如高分子、病毒样颗粒、细菌或胶体的小粒子的需要已经成为确定它们质量或大小方面特征和确定其分布之前的重要任务。近年来，最成功的可分离这些粒子的一种途径是通过非对称流场流分馏装置，即AsFFFF，或简称A4F。该装置是由J.Calvin Giddings在他的1993 Science paper260卷1456-1465页中详细描述的早期横向流FFF装置的一种变体。A4F的变体被它的发明者Carl-Gustav Wahlund与J.Calvin Giddings在前者1987的论文“Properties of an asymmetricalflow field-flow fractionation channel having one permeable wall”，Analytical Chemistry 59，1332-39中描述。

【0002】A4F装置包括下述元件和将这些元件结合在一起的装置：1)支撑可渗透液体的熔块的底部组件结构，通常该底部组件结构由烧结的无缝钢粒子制造而成，2)位于熔块之上的可渗透薄膜，3)具有空腔的厚度约为75到800μm的垫片，以及4)顶部组件结构，该结构一般支撑由诸如或玻璃的材料构成的透明板。生成的夹层借助螺栓或其他手段被结合起来。垫片内的蹄形空腔作为通道来使用，分离就发生在该通道中。所述顶部组件结构包括三个孔，这些孔穿过大体透明的板，被称为口，这些口位于所述通道上部中心并且允许配件附在其中。这些口是：1)靠近所述通道起点的流动相入口，而且称为流动相的载体液体通过该入口被泵送。2)试样口，非常靠近且处在所述入口的下游，被分离的等份试样通过试样口被引导到所述通道，以及3)出口，所述已分馏的等份试样通过该出口离开所述通道。

【0003】A4F通道被用于分离上述不同种类的粒子且粒子大小从几纳米到几十微米。由这种粒子组成的等份试样的分离依次取决于所述蹄形空腔的长度、宽度和厚度。此外，该分离取决于所述通道流速、横向流相对于通道流的比例、液体粘性、pH、电离度、所述粒子本身的物理构成以及位于所述熔块上的可渗透薄膜种类。通过适当地设定随时间变化的通道流一横向流比例，不同种类的粒子分离可被明显改善，而且存在于被注入的等份试样中的一系列大小的粒子可在同一进程中被分离。的确，对于每一种将被分离的粒子，通过经验性地改变可得到的变量，最优分离可被开发。对于传统通道，唯一不能改变的变量是通道长度。

【0004】以往，所述A4F的通道长度大约为25到30cm，其中通道最大宽度约为1到3cm而且沿长度逐渐减小且在末端与出口宽度差不多宽。最近的研究认为较短长度的通道可提供一定好处，而且在此基础上，一种全新的结构被开发且被集成到更短的A4F装置。然而选择单通道的情况下，除非上述所有影响变量可被测试，否则为特定种类的粒子提供更好分离的可能性不可能被彻底研究。因此流速对所述每一种粒子分离的影响可通过固定通道方便地测试到，但是当前通道设计传统不允许改变长度。当前通道设计传统允许在三个口位置相同的情况下改变通道宽度和薄膜厚度。如果仅仅单通道长度可利用，几个问题会出现：是否存在产生的分离比任一可用的固定长度装置产生的分离更好的长度？是否存在最优长度，该最优长度会产生等同的分离但却需要更小的等份试样大小？可否将从针对相同试样的几种不同长度得到的结果合并起来产生更好的被检测试样特性？每一种试样的最优分离是否具有相关的最优通道长度？

【0005】本发明的基本目标是给出装置和方法，通过装置和方法这些问题可被回答。分离取决于许多参数，其中一些被软件和系统操作员控制。然而，在本发明之前，一个参数即所述通道长度不能被改变。因此本发明的进一步目标是通过在相同通道结构内提供不同通道长度值来提供更大的分离灵活性，凭借分离灵活性，试样可被更详尽地表示特征。

发明内容

【0006】从而，允许使用垫片提供各种通道长度和形状的一种新型A4F装置的大体透明顶板元件被描述。不是提供出口、试样注入口和出口的一套三个位置，本发明的顶板形式包括提供多个试样注入口和出口位置。给定分离极大地取决于试样注入口到出口的距离，在出口处已分馏的等份试样离开通道，也就是所述等份试样沿所述通道被所述通道流和横向流的共同作用分离的区域。因此，对于单一通道，通过选择更靠近所述出口的试样注入口，其中通过所述试样注入口注入所述试样，所述通道的有效长度被缩短；其他所有的结构元件保持不变。或者，所述垫片本身可被具有更短通道的垫片取代。对于本改型，初始试样注入口可保持不变，然而更靠近初始试样注入口的已分馏试样出口基于合适的位置会被用于新的有效通道。因此通过使用更短的垫片通道和选择更靠近试样注入口的出口，所述通道分离长度可被缩短。除非需要，否则所述多个未被使用的口孔保持密封或被阻塞。

附图说明

【0007】图1示出了现有技术的所述A4F结构元件。

【0008】图2描述了使用两种不同通道长度分馏的不同之处。

【0009】图3描述了当通道流保持不变时，改变横向流对分离的影响。

【0010】图4示出了本发明的顶板的一个实施例。

【0011】图5示出了一套垫片，其中每个垫片具有用于本发明的不同通道。

【0012】图6示出了顶板和与两个通道一起使用的相应垫片。

【0013】图7示出了本发明的顶板的另一个实施例，其中多个口位于其中，允许增加用户可选择的通道结构的灵活性。

具体实施方式

【0014】图1示出了非对称流场流分馏装置的传统结构和它的元件。典型装置包括持有顶板1的顶板组件10，包含多孔熔块结构3的底板2，一些流体可通过的薄膜4，其内部被挖去锥形通道6的垫片5，用于所述流动相插入的入口7，试样注入口8，将被分馏的等分试样通过试样注入口8引入，出口9，已分馏的试样和流动相在进入一个或多个探测装置之前通过所述出口9离开所述结构，以及用于为所述装置提供足够流量和控制的配套泵和控制器。所述顶板组件10一般通过螺栓11固定在所述底板2上。顶板1一般是透明的，以便如果需要的话，在试样分离时可观察通道6。顶板1一般也包括口7、8和9。通过限制离开薄膜4的流来产生通过出口9的流。因此如果流动相输入流是每分钟两毫升，则通过所述薄膜的流就被限制为每分钟0.5毫升，所述出口流将会是每分钟1.5毫升。

【0015】当粒子已经被A4F分离，粒子一般借助不同种类的对其中粒子敏感的探测装置来检验。这些探测装置包括光散射光度计、UV吸收计、示差折光率检测器和差分粘度计。这样的装置根据分离的粒子/分子的摩尔质量、固有粘度测定、大小等来表示分离的粒子/分子的特征。

【0016】所谓的分离力F也就是所述通道分离不同大小粒子的能力，通道的分离力可通过如下关系来描述

$>F=S\left(\frac{w}{384\mathrm{bLD}}\right)\left(\frac{V_{\mathrm{cross}}^{3/2}}{V_{\mathrm{channel}}^{1/2}}\right)---\left(1\right)$>

其中S是所谓的选择常数，V_cross是通道横流流速，V_channel是通道纵流流速，b是通道宽度，L是通道长度，w是通道厚度，以及D是粒子扩散率，所述粒子扩散率通过爱因斯坦-斯托克斯公式与粒子流体力学半径R_h联系起来，也就是

$>R_h=\frac{k_{b}T}{6\mathrm{\pi \eta D}}---\left(2\right)$>

其中η是绝对温度T下的溶液粘度，且k_b是玻耳兹曼常数。

【0017】从上面公式1，我们注意到减小通道长度似乎有可能来改良试样的分离。然而通道保留粒子的能力取决于通道限定的薄膜区的每单位面积的横向流，所述薄膜区也就是被垫片内的空腔确定的薄膜区域。因为每单位面积横向流近似地为V_cross/bL＝ξ，所以等式1变为

$>F=S\frac{\mathrm{w\xi }}{384D}\sqrt{\frac{V_{\mathrm{cross}}}{V_{\mathrm{Channel}}}}---\left(3\right)$>

【0018】图2示出了通道长度为25cm的标准通道12与通道长度为18cm的较短的通道13的分离的比较。垫片厚度均为490μm，这些空腔被从垫片内挖去。此外，横向流如同对应的纵流流速一样会有轻微的不同。对于标准和短的空腔，对应的通道流和横向流分别是(1，3.0)ml/min和(0.5，2.0)。因此，所述相关联的ξ值分别是3/(bL₁)和2/(bL_s)。项对于标准和较短通道的对应比率分别是1.73和2.00。根据等式(3)，短通道相对于标准通道的分离能力的比值仅为1.07。这个因子对应具有可忽略的7％的增强分离。然而，对于相同数量的注入试样，较短通道产生了相对于相应更小的稀释度的更尖锐的峰，因为如本例所示，短通道的通道流量仅仅是较长通道的一半。通过调整两个流动速率的灵活性，两种通道使用已选速率进行的比较对于较短的长度没有产生质变性提高的分离能力。实际上，对于选择的两种长度，对于较长通道的横向流的轻微改变并不能产生与之相关联的分离能力的差异。然而考虑下面的研究，该研究比较两个不同长度的通道产生的结果，如下表所示：

  特征  标准通道(25cm)  较短通道(18cm)  需要的时间  56分钟  31分钟  洗脱液体积/运行  159mL  70mL  注入试样大小  20μg  2.5-10μg

表1标准25cm通道和较短18cm通道的比较

虽然作为本结果来源的分子种类与图2中产生数据的分子种类很不相同，重要的是注意到较短通道似乎是能达到相同质量的分离而且更快且需要更少的试样。

【0019】根据图2，可以看到从二聚体和较高低聚馏分产生的顶点更早的洗脱：表1观察结果的另一个证明。因此，通过检查作为通道长度的函数的分馏来分析一种特定试样的能力会成为任何A4F系统宝贵的特征。当前，仅有一条通道的实验是可能的，而且从实际的观点来看，提供最优分离的通道长度可通过仅仅使用不同的包含通道的装置来决定，每个装置基于固定的长度。当本发明提出时，仅有对应不同通道长度的两个不同通道结构是可用的，而且从这些通道得到的数据类似于上表1得到的数据。虽然图2所示较短通道数据13相对于较长通道数据12暗示有可能的提高，然而对通道数据13进一步观察发现对于低聚状态，峰似乎并不是由基线决定。峰之间的极小值通过增加的洗脱加速了所述极小值相对于基线的分离。很明显，存在的数据中没有任何通道长度对分离和溶解的的函数相关性的估计。由于仅有两个通道长度值且A4F理论相对粗糙，考虑或不考虑其他参数如流速的变化，改变通道长度的重要性依然是没有答案的问题。

【0020】例如，图3示出了当通道纵向流速保持60毫升/小时恒定不变时，改变横流对标称直径为50nm的聚苯乙烯乳胶球的影响。测定的均方根半径，$>{<r_g^2>}^{1/2}=r_g,$>均方根半径与粒子的流体力学半径a成比例，关系是$>r_g=\sqrt{3/5}a.$>对于三种不同的横向流速40、60和80毫升/小时，洗脱在相同的尺寸范围上实际是相等的。由最快洗脱推断出的粒径分布，产生在横向流速是40毫升/小时时，似乎是在早期洗脱中被截断，仅仅是由于用于计算粒子大小的间隔的选择。由于某种原因，为实际计算所选择的范围小于该最小横截面。对应于最低横向流速40毫升/小时的较慢洗脱试样表明包含较大尺寸的粒子的小峰值部分的存在。这就与保留在薄膜上并且仅当横向流速被设定为0时被释放的粒子较好地对应。虽然没有显示会有较好的横流选择，但非常有趣的是当试样包括多于一种单独尺寸时可以看到类似的结果，也就是经过一段较长时间时分离的重要性。使用不同长度的通道进行的类似比较是不完整的。

【0021】由于没有手段可具体检测通道长度变化的效果，所以仅仅是两个商业上可获得的结构的结果用于检测这种影响。现在考虑图4所示的结构。这里我们可以看到与图1所示相同的通道结构，除了包括多个附加的试样注入点。一套可能的这种附加口被相应地分别标记为14、15、16、17和18。这种口的实际数量和它们沿通道长度的位置可能改变。这些试样注入口的每一个距出口9的距离对应于通道的有效分离长度，也就是试样离开通道之前可沿着它被分馏的距离。因此，对应每一个这样的注入口，相应的试样注入和试样集中启动随后的传统分离。通过选择用于相等份试样顺序注入的一系列注入口，在一系列通道长度上分离相同的试样将会允许为每个这样研究的试样确定最优通道长度。在具体注入过程中不使用的试样注入口可被暂时塞紧或被外部阀门或管道所控制。因此可配置多口试样注入阀以便每个注入口有一个对应位置；所有口都一次被连接，一次仅有一个口被激活。一旦自动化，作为长度、通道流速和横向流速的函数的通道特性的测量可被容易实现。

【0022】上述可能的试验类型有力地表明所有商业上可获得的A4F结构都没有用于给定通道长度的坚实基础。没有可用的选择且很少有数据表明为什么A4F装置已被生产仅用于由厂商指定的通道。已经进行的有关特定通道长度的分离优点的研究非常少。自然地，有许多如图3的研究，这些研究证明了流动速率、垫片厚度和垫片形状变化的影响。然而，直到本发明时，通道长度的影响还不是研究的目标。可能将最优长度和每个不同的试样类型相联系。这样的研究已经期待很久了。

【0023】虽然图4所示的实施例会允许进一步对通道长度影响的探索和研究，但当保持一个恒定的通道形状时，检查通道长度影响可被证明是重要的。图4所示的实施例从所选注入口到出口利用了同一通道形状。传统地，在流动相入口和试样注入口之间的区域给定为锥形的形状。利用如图4所示的本发明的不同试样注入口消除了该过渡腔形状。虽然可能在文献中很少发现这种预注入形状的评论或研究，但不期望影响随后的分离。本发明的另一个实施例对这样的研究很有用，它在图5中被示出。对于该实施例，A4F装置必须是开口的，而且垫片可被交换用于每种选定的长度，但类似的通道形状也可用于不同的选定长度。

【0024】图5所示的顶板显示顶板结构具有流动相注入口7和试样注入口8。而且还有一套流出口19、20、21、22、23和24。与每个这样出口相对应的将是带有通道的垫片，该通道具有相同的入口和试样注入口7和8。因此标记为25的垫片会具有对应于出口24的被挖出空腔，标记为26的垫片具有出口21等等。尽管出口数量和口之间的距离增量可以或大或小，这样的出口数量如图5所示为六，将会有相关联的通道长度用于这样的出口。

【0025】顶板的灵活性和位于其中的不同口位置的可能性在图4和5的示例中被示出。扩展使用顶板以容纳如此过多口位置的能力在其中已被清晰地描述出来了。另一个简单的变更在图6中被示出，其中所示顶板配有口以便允许单一垫片提供两个或更多不同的空腔。对于本简单示例，所示顶板被提供2组流动相入口7和对应的2组试样注入口8。虽然两个空腔27和28可具有不同的长度和形状，然而垫片具有两个相应的出口9。注意到空腔可被连接到同一控制器装置而且是借助合适的多阀结构；这样的通道可被顺序地转换和使用。修改A4F结构的顶板来包括不同的所需口以便允许额外的活动空腔在同一垫片内，这种修改有进一步的好处：此分离所需的最昂贵的一次性薄膜的利用可被极大的增强。当前通道结构设计导致仅仅小部分薄膜表面积被使用。通过改变传统通道的位置来允许在同一个垫片内放置两个或更多通道，薄膜将会被更加有效地使用且运作花费明显被减少。

【0026】通过给每个通道增加足够的附加口来允许通道实现类似于图4或5所描述的发明模型，甚至更大的通用性可被赋予此多通道实施方式。本实施例的一个示例在图7中被示出，其中许多口遍布顶板的整个可接触面。可接触意味着这种孔正下方的区域必须包括垫片，该垫片可被切除一个空腔或其中一部分，露出在其下被可渗透熔块结构支撑的薄膜。这些发明元件的重要性不能被夸大。这些发明元件不仅为A4F提供了更大的灵活性而且它们允许对昂贵的薄膜元件更多的利用。最重要的是，它们显著地扩展了导出每种分子和/或粒子的最优分离条件的能力。

【0027】很明显对于粒子分离和场流分馏技术领域的技术人员来说，存在许多由我们发明和描述的通用通道实施和应用的明显变形，这些变形不偏离我们为它们的应用所列出的基本元素；所有这些变形仅仅是以上描述的我们的发明的明显实现且被包括在随后的权利要求中。