适用于土壤溶液阳离子分析的毛细管电泳检测体系

摘要

一种适用于土壤溶液阳离子组成及其浓度的毛细管电泳分离检测体系，其特征在于该体系含有咪唑5～10mM，HIBA在缓冲液中的浓度8～9mM，18－冠－6浓度为2－5mM，检测体系的pH值为3.5－4.0。本发明的目的是提供一种土壤原位溶液中阳离子组分的毛细管电泳分离检测体系。这种检测体系重点对检测缓冲液的组分及其配比进行优化改进，使其广泛用于土壤溶液的快速检测尤其适用于组分比例关系复杂不适合等比例吸释，部分组分浓度较高的检测需要。

说明书

一、技术领域

本发明提供了一种毛细管电泳分离检测体系，特别适用于土壤溶液阳离子组成及其浓度的毛细管电泳分离检测体系。

二、背景技术

土壤及根际溶液中阳离子的检测技术对于土壤学、植物营养学以及农业环境的研究来说具有非常重要的地位，同时也是指导农业科学生产的重要工具。但是长期以来，土壤及根际溶液中阳离子的检测技术一般是先破坏性地分离得到大量根际土壤，然后风干，之后再采用不同的试剂及一定水土比将土壤进行浸提后得到相应的土壤溶液；或者在得到大量根际土壤后，采取高速离心或压榨的方法得到新鲜土壤溶液。之后分别采用比色法、火焰光度计法、原子吸收光谱法或离子色谱法等检测得到土壤养分状况数据。这些方法不仅比较繁琐，而且需要大量的土壤以及获取大量的土壤溶液(500ul-50ml)。这对于土壤溶液样品的自动化快速检测以及样品量较少(30-50ul)的土壤原位溶液相的研究都是不可行的。

毛细管电泳具有样品消耗量小(进样量在nl级，最少5ul就足够检测)、短时间(几分钟)内就可以实现多种组分的同时检测(最多有一次出峰四五十个离子组分)、检测程序简单，基本无需前处理等优点。从上世纪90年代以来，已经有应用于无机离子的检测的研究：李群彬等2005报道了pH值为4.82的6mM咪唑-乙酸缓冲液体系，其对茶水中阳离子的检测范围在0.5-50ug/ml之间；曾小岚，刘君2005报道了环境水样的阳离子毛细管电泳检测体系：pH为4.5的5mM咪唑-6mMa-HIBA体系，线性范围Ca²⁺、Na⁺为5-40mg/L；Mg²⁺为3.5-45mg/L；张少君等2004采用pH为4.5的8mM咪唑-乙酸缓冲体系对自来水中阳离子进行分析，对1-200ppm Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺检测，线性关系R²均达到0.99以上。但此缓冲液的醋酸属于挥发性物质，对于缓冲液的标准化配置造成一定的影响。又因为毛细管电泳消耗样品量较少，也已有研究者将其应用于采样量有限的土壤原位溶液研究A.Dieffenbach，A.Gottlein，et al，1997报道了一种阳离子缓冲液体系，成分为5mM metol，1mM ascorbic acid，2mM 18-crown-6，但相应样品浓度在0.56-2.43ppm之间；Z.Y.Wang，2004采用同样的缓冲液检测土壤溶液浓度在4-6ppm之间，检测上限偏低，难以满足高浓度离子的直接检测。此外这种检测缓冲液需要新鲜配置，一般几小时后就会变质，不适合样品数量多时的批量检测。

对于土壤溶液来说，无机阳离子主要有NH₄⁺、K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺。根据相关报道，土壤中速效态或可交换态的含量NH₄⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺一般在几十到上百个ppm，Ca²⁺则通常是Na⁺、Mg²⁺的几倍，在几千个ppm。以土壤含水量20-40％计，土壤溶液中NH₄⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺含量很低在十几个到几十个ppm之间，Ca²⁺的浓度则在几百至上千个ppm之间，这种各离子浓度不成比例的特征在旱地、水田、设施农业土壤中广泛存在。而申请人对土壤原位溶液中无机阳离子的初步结果显示，根际土壤原位溶液，由于养分、水分吸收以及盐基离子随水分迁移的特性，阳离子中NH₄⁺、K⁺浓度更低，而Ca²⁺的浓度更高，施氮的农业土壤中Ca²⁺的浓度一般在400ppm左右，甚至可以达到700-1000ppm。而目前的筛选体系不仅不能应用于高浓度样品的检测，更不适用于组分浓度复杂，个别离子浓度很高和很低的情况同时存在，不适合等比例的稀释检测的情况。

因此，针对传统检测技术的检测过程繁琐、等待时间长、需要大量各种试剂的问题，以及毛细管电泳检测技术在土壤溶液检测应用方面存在的各种问题和无法适用于土壤溶液样品的批量检测或者成分复杂而且个别组分浓度较高、等比例稀释无法进行的样品的检测的问题。建立相应的检测体系对于土壤溶液的自动化快速检测以及改善对根际原位这个特殊领域的科学认知都是非常必要的。

三、发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种土壤原位溶液中阳离子组分的毛细管电泳分离检测体系。这种检测体系重点对检测缓冲液的组分及其配比进行优化改进，使其广泛用于土壤溶液的快速检测尤其适用于组分比例关系复杂不适合等比例吸释，部分组分浓度较高的检测需要。

技术方案：一种适用于土壤溶液阳离子组成及其浓度的毛细管电泳分离检测体系，该体系含有咪唑5～10mM，HIBA在缓冲液中的浓度8～9mM，18-冠-6浓度为2-5mM，检测体系的pH值为3.5-4.0。

所述检测体系的pH值优选为3.7。

所述咪唑优选为9mM。

所述HIBA的浓度优选为8mM。

有益效果：

缓冲液的pH不仅控制着石英毛细管管壁羟基解离程度，以及样品组分在电泳过程中的赋存形态，进而很大程度影响各组分的迁移速率和分离度。对于阳离子缓冲体系来讲pH值一般在3.5-4.5之间，本发明中优选为3.5-4.0，进一步优选为3.7。

土壤溶液中的无机离子如NH₄⁺、K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺大部分不能直接利用紫外吸收检测，因此只能采用间接紫外吸收检测。间接紫外检测中背景试剂通常有咪唑、米吐尔，而咪唑尤其适合样品中Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺同时测定，且其性质稳定、容易保存。另外咪唑还可以增加缓冲液的粘滞度，改善各组分间的分离，但浓度过高信号值反而减小，对于个别浓度较低组分的检测灵敏度产生影响。咪唑的浓度一般在5-10mM，优选为9mM，此时低浓度的NH₄⁺、K⁺信噪比符合检测要求，且Ca²⁺、Na⁺两组份的Rs最高，为0.89，Na⁺与Mg²⁺两组份的Rs为1.5。

另外，为了改善Ca²⁺、Na⁺与Mg²⁺的分离度，增加弱络合剂来影响三种组分的迁移度是必要的，乙酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、a-羟基乙酸(HIBA)均可以采用，经过笔者初步的筛选发现仅有HIBA可以适用于这类个别成分浓度较高的样品，分离度相对较高、基线平稳，这可能是HIBA与这几种组分有合适的络合常数，达到较好的迁移率差异。HIBA在缓冲液中的浓度一般在5-10mM，浓度过低使高浓度的物质峰峰形不稳定难以积分，浓度过高时的对低浓度物质造成掩盖，使峰信号值大大缩小，灵敏度降低，在本发明中优选为8-9mM，但8mM时，Ca²⁺、Na⁺与Mg²⁺的分离度(Rs)为1.5，而9mM时，仅为0.8，因此优选8mM。试剂18-冠-6可以与NH₄⁺、K⁺离子络合，进而改善二者的分离度，本发明中优选为4.0mM。

四、附图说明

图1某公司提供的广谱分离体系对标准溶液H100的分离结果。如图所示，1，NH₄⁺；2，Na⁺；3，K⁺；4，Mg²⁺和Ca²⁺两组分混合峰。

图2某公司提供的广谱分离体系对标准溶液H1的分离结果。如图所示，5，Mg²⁺；6，Ca²⁺。

图3本发明分离体系对标准溶液H100的分离结果。1，NH₄⁺；2，Na⁺；3，K⁺；5，Mg²⁺；6，Ca²⁺。

图4本发明分离体系对标准溶液H1的分离结果。1，NH₄⁺；2，Na⁺；3，K⁺；5，Mg²⁺；6，Ca²⁺。

图5本发明分离体系的缓冲液运行次数与电流的影响。

图6本发明分离体系检测氨亏缺指数(0mgN/Kg干土)及钙富集指数(300mgN/Kg干土)。

五、具体实施方式

实施例1：

适用于土壤溶液阳离子组成及其浓度的毛细管电泳分离检测体系，含有咪唑5～10mM，HIBA在缓冲液中的浓度8～9mM，18-冠-6浓度为2-5mM，检测体系的pH值为3.5-4.0。检测体系的pH值优选为3.7。咪唑优选为9mM。HIBA的浓度优选为8mM。

实施例2：

缓冲液的配置：

所用实际均采用优级纯，所以水采用已经灭菌的二次去离子水。准备一个干净的1000mL储液瓶，用万分之一天平精确分别称取0.6127g咪唑试剂、0.8328ga-HIBA试剂、18-冠-6试剂1.05736g于储液瓶中，将事先准备好的1L灭菌水缓缓注入储液瓶并在搅拌器上搅拌至试剂完全融化，并盖好储液瓶上盖，充分搅拌后用1NHCl调pH至3.7，从而获得电泳缓冲液。此缓冲液可以直接用于电泳分析。

毛细管电泳条件：

分离模式为毛细管区带电泳(CZE)，使用检测波长为214nm，采用压力进样，条件为0.2psi×5”，48孔样品盘自动进样，分离电压为+30kV，毛细管为直径为75um的无涂层熔融石英毛细管，有效分离长度为60cm。新的毛细管进样前先采用0.1NNaOH冲洗20min，然后用二次净化纯水冲洗5min，然后用缓冲液冲洗10min并加电压分离平衡一次，然后再开始进样分离。两个相邻样品间的分离，只需用电泳缓冲液冲洗2min即可。分离缓冲液每运行10个换新一次。

实施例3：

根际实施例2的结论确定的缓冲液组分，本例报道了该缓冲液应用于不同浓度标准溶液的相关性研究。考虑到待测样品中各组分间浓度比例级差较大，且Ca²⁺浓度处于高位的特点，按照表1分别配置H1至H100标准溶液系列。

对于阳离子的综合检测，某公司提供一种广谱型的检测体系(包括检测方法和分离缓冲液)，可以用来检测大多数样品。因此，首先运用该广谱检测体系分析此标准溶液系列，然后运用本发明分离体系分析此标准溶液系列。

广谱检测体系应用于表1的表准混合液系列后，发现出峰顺序依次为NH₄⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺，基线较差，不能顺利积分，如图1所示对H1(即NH₄⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺均为1ppm，Ca²⁺浓度10ppm)的分离效果图。并且从H10(即Ca²⁺浓度100ppm)开始，Ca²⁺、Mg²⁺两物质峰出现重叠无法分离，对H100的的分离结果如图2所示。而本发明的分离体系可以完成整个标准系列中的各个组分的分离。

本发明分离体系对该混合标准溶液中极低(H1)及极高(H100)的分离效果如图3及图4所示。可见，本发明分析体系既可以实现未知复杂样品中实现含量极低的NH₄⁺及K⁺的分离检测，也可以实现其中含量极高的Ca²⁺的分离检测。内标法及单组分分析检测的结果显示，最先出峰的是NH₄⁺，之后依次为K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺。为了检测该分离体系检测效果，对该分离体系分离混合标准系列的浓度(C)与峰面积信号值(A)进行了相关性分析；根据S/N为2计算了检测线性范围；根据该检测体系对混合标准液H20连续20次的分析结果计算了各组分的迁移时间和峰面积RSD％值；结果如表(2)所示。该检测体系对混合标准液H20连续20次的电流变化情况如图(5)所示。

如表(2)所示，该检测体系相关性较好，R2值均达到了0.99以上，线性范围的上限符合组分复杂且个别组分较高的需求，下限较低，满足个别组分较低的需求，各个组分的迁移时间RSD％值较小，峰面积RSD％在7％左右。回收率％均达到97％以上。如图(5)所示，该缓冲体系运行20次电流值变化在15.88-16.99uA之间，相差0.11uA。电泳进行过程中缓冲体系的电流值变化小，对分离检测的影响很小，但笔者仍建议电泳次数至多超过15次后更换新的缓冲液。

实施例4：

采用发明“用于水田种植系统根际的土壤溶液原位采集装置及其应用(申请号200910026388.1)”获取苗龄为30天的水稻根际及土体土壤原位溶液样品进行研究。其施氮肥处理以N(NH₄⁺)，用量为0mg/Kg干土和300mg/Kg干土两个处理；磷钾肥分别以P、K计均采用150mg/Kg干土处理。采样点位于水稻根系具有根毛的伸长区，距根尖为5cm，设重复4次。

对所获样品中NH₄⁺及Ca²⁺浓度，采用本发明分离体系进行检测分析，结果显示，NH₄⁺浓度最低点出现在0mg/Kg干土处理的根表采样点，为1.87ppm；最高点出现在300mg/Kg的距根表5cm的采样点，为58.68ppm。而Ca²⁺浓度最高点出现在300mg/Kg干土处理的根表采样点，为773.76ppm；最低点出现在0mg/Kg干土处理的距根表5cm的采样点，为48.38ppm。根据不同施氮处理下所采各点样品的NH₄⁺及Ca²⁺浓度，计算0mg/Kg干土处理下NH₄⁺亏缺指数(即某点位NH₄⁺浓度/距单根根表5cm点位NH₄⁺浓度×100％)以及300mg/Kg干土处理下Ca²⁺的富集指数(某点位Ca²⁺浓度/根表Ca²⁺浓度×100％)为指数为100％，则0mg/Kg干土处理下NH₄⁺亏缺指数及300mg/Kg干土处理下Ca²⁺的富集指数如图6所示

实施实例证明，本发明所述毛细管电泳分离体系对于组分比例复杂且个别组分浓度极高与极低同时存在、等比例稀释无法进行的的样品的分离检测具有很高的重复性和精确性，是实现根际土壤溶液相的原位研究的有效检测手段和保证。

表1混合标准溶液系列及其各组分浓度表

  标准溶液  系列  NH₄⁺  K⁺  Ca²⁺  Na⁺  Mg²⁺  H1  1  1  10  1  1  H2  2  2  20  2  2  H5  5  5  50  5  5  H10  10  10  100  10  10  H20  20  20  200  20  20  H50  50  50  500  50  50  H80  80  80  800  80  80  H100  100  100  1000  100  100

注：根据土壤溶液这类样品的特征，设计了相应浓度区间的标准溶液系列作为浓度计算的依据

表2本发明分离体系相关回归关系式、线性范围、R²、线性范围、R.S.D.％

  组分  回归关系  R²  线性范围  (ppm)  迁移时间  (RSD％)  峰面积  (RSD％)  回收率  (％)  NH₄⁺  C＝0.0053A+0.19  0.9939  0.52-100  0.13  7.18  97.9  K⁺  C＝0.0084A+1.1375  0.9956  0.65-100  0.09  7.49  108.27  Ca²⁺  C＝0.0038A-10.277  0.9904  0.42-1000  0.19  8.16  99.91  Na⁺  C＝0.0039A-4.0772  0.9931  0.25-100  0.10  7.08  101.72  Mg²⁺  C＝0.0019A-0.2149  0.9914  0.24-100  0.10  8.02  108.39

注：根据本发明的缓冲体系，运行标准溶液系列后的相关参数