一种来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系及其建系方法

摘要

本发明涉及微生物动物细胞领域，具体涉及来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系及其建系方法。本发明的技术方案如下：一种来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系，它保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO：C200814。一种来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系的建系方法，包括以下步骤：(1)癌栓细胞的获取及原代培养；(2)肿瘤细胞岛的克隆扩大培养；(3)肿瘤细胞的传代培养。其优点表现在：CSQT－1细胞是从门静脉癌栓取材的，对肝癌门静脉癌栓形成机制及倾向性生长机制有其他现存肝癌细胞系无法比拟的优点。这株细胞系具有广泛的应用前景。它的核型分析显示为亚4倍体，占总数58％。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物动物细胞领域，具体涉及来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系及其建系方法。

背景技术

原发性肝癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，未经治疗的病人中位生存期不到一年。手术切除是目前肝癌治疗最有效的措施。但即使切除了肿瘤，术后大多数病人仍死于术后肿瘤复发转移。肝癌转移的主要特征是向门静脉内生长而形成门静脉癌栓。上海东方肝胆外科医院对5524例肝癌患者行肝肿瘤切除术，切除标本发现门静脉内已形成癌栓的比例达67.1％(中华外科杂志，2001，39：25-28)；通过对肝癌门静脉癌栓生长特征的研究提出了癌栓分为5型8个亚型(中国现代普通外科进展，2003，6：171-173)，对肝癌合并门静脉癌栓的患者的临床治疗及预后判断提供了重要的参考。但是目前对肝癌门静脉癌栓形成的分子机制方面的研究还不够深入，纵观国内外人肝癌细胞系模型，尚无来自门静脉癌栓转移灶的人肝癌细胞系，无法对原发肿瘤细胞系和癌栓来源细胞系的生物学行为进行对比研究，也就难以了解癌栓倾向性生长的分子机制，无法寻找癌栓形成的防治策略。

CN1338512A公开了利用人肝癌原位接种至裸鼠肝脏，从裸鼠的肺转移灶中取材建立了人肝癌细胞系，为肝癌肺转移的机理和防治肺转移提供了适宜的实验材料。CN1232874A公开了利用人肝癌高转移的裸鼠模型移植瘤作为建系瘤源，采用体外培养结合动物体内再接种生长的方式交替进行，建成具有高转移潜能的细胞系MHCC97。而来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系及其建系方法方面未见报道。

发明内容

本发明的目的在于：

(1)、提供一种来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系；

(2)、一种来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系的建系方法。

本发明的技术方案如下：

一种来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系，它保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C200814。

一种来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系的建系方法，包括以下步骤：

(1)、癌栓细胞的获取及原代培养；

(2)、肿瘤细胞岛的克隆扩大培养；

(3)、肿瘤细胞的传代培养。

所述，步骤(1)和步骤(2)使用D/F培养液，步骤(3)使用D/F培养液和DMEM培养液。步骤(3)中肝癌细胞用D/F培养液培养，到20代以后，用DMEM培养液进行培养。

所述D/F培养液含有DMEM/F12，胎牛血清，其中还含有胰岛素，EGF。胰岛素为4-6ug/ml，EGF10-30ng/ml。胰岛素优选为5ug/ml，EGF优选为20ng/ml。

本发明所公开一种来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系及其建系方法，其优点表现在：1、CSQT-1细胞是从人门静脉癌栓取材的，对肝癌门静脉癌栓形成机制及倾向性生长机制有其他现存肝癌细胞系无法比拟的优点。(目前所存的肝癌细胞系多从人肝癌原发灶、人肝癌移植裸鼠模型及该模型形成的肺转移灶中取材，比如SMMC7721、MHCC97、HCCLM3)。2、CSQT-1细胞中稳定表达CD133⁺的细胞亚群约为20％。目前多数学者认为CD133⁺的肝癌细胞亚群具有肝癌干细胞样活性。这株细胞系在研究门静脉癌栓形成过程中肝癌干细胞的作用及干细胞在肿瘤转移机制中的作用研究方向具有广泛的应用前景。3、在原代培养时期，由于肿瘤细胞经历一个从体内到体外微环境的改变过程，肿瘤细胞不容易存活，在一般体外培养条件下要使肿瘤细胞传代是非常困难的。本发明使用了DMEM/F12培养液添加适量的EGF和胰岛素，后两者在所给出的浓度范围里能有效地维持肿瘤细胞在体外存活，并使其获得永生性的可能大大增加。经过体外稳定传代20代以后，一般培养条件就能使细胞存活并传代，还能降低使用前一种培养液带来的昂贵费用，故采用两种培养液交替使用，能有效、经济地建立肝癌细胞系。4、取材方法的特异性：从人肝癌门静脉癌栓取材建立的细胞系，具有门静脉癌栓背景，对门静脉癌栓的形成机制研究提供了适宜的材料。

附图说明

图1：原代细胞培养1周后形成的“细胞岛”(200×)。

图2：单层贴壁生长的CSQT-1细胞(200×)，细胞为簇样生长，细胞成典型的上皮样细胞，其形状不规则，排列紧密，界限清楚，接触性抑制丧失。

图3：CSQT-1扫描电镜(2000×)，细胞表面有皱褶，周围有微绒毛或指状突起，可见细胞间紧密连接。

图4：CSQT-1细胞的生长曲线图，在DMEM培养条件下，细胞群体倍增时间为48.2小时。

图5：CSQT-1细胞接种后贴壁率随时间变化图，种植4小时后大部分细胞(95％以上)均可以贴壁生长。

图6：第15代CSQT-1细胞中CD133⁺的细胞亚群流式图，该细胞中一部分亚群细胞CD133⁺，可能具有肝癌干细胞样活性。

图7：第35代CSQT-1细胞中CD133⁺的细胞亚群流式图，该细胞中一部分亚群细胞CD133⁺，可能具有肝癌干细胞样活性。

图8：CSQT-1细胞的核型分析图，染色体为90条。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系的建立

一、材料

1.两种不同的细胞培养液及其配制方法

1.1培养液D/F∶DMEM/F12(1∶1)(美国GIBCO公司)，10％(v/v)胎牛血清(美国Biochrom AG公司)，EGF(Epidermal Growth Factor，表皮生长因子)20ng/ml(美国Sigma公司)，5ug/ml胰岛素，0.30g/L的L-谷氨酰胺，100U/L青霉素，100ug/L链霉素；

1.2培养液DMEM：高糖DMEM培养基(美国GIBCO公司)，10％(v/v)胎牛血清(美国Biochrom AG公司)，0.30g/L的L-谷氨酰胺，100U/L青霉素，100ug/L链霉素。

2.其余细胞培养材料

细胞筛(美国BD公司)；程序冻存盒(美国NALGENE公司)；0.05％I型胶原酶溶液(美国Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)；胰蛋白酶消化液：0.25％胰酶(美国GIBCO公司)+0.02％EDTA，PH值为7.3；细胞冻存液(DMEM∶FBS∶DMSO＝7∶2∶1)；D-Hank’S洗液(PH值为7.2-7.4)；

3.标本来源

上海东方肝胆外科医院患者陈××(住院号115360)，男，43岁，术前征得患者本人同意，签署知情同意书，术中切除的肝癌及门静脉癌栓标本。术后病理诊断为肝细胞癌伴门静脉癌栓(病理号075074)。

4.实验动物

BALB/c-nu/nu裸鼠，鼠龄为4～5周，由中国科学院上海斯莱克实验动物中心提供。

二、方法

从人肝癌和门静脉癌栓中分别取材，采用消化法获取癌栓细胞，通过原代培养、肿瘤“细胞岛”的克隆扩大培养、肿瘤细胞的传代培养等步骤建立一株能在体外稳定传代的细胞系，具体的方法如下：

1.癌栓细胞的获取及原代培养

将新鲜癌栓组织剔除血污及坏死组织，用含5倍浓双抗(500u/mL青霉素和500ug/mL链霉素)D-Hank’S冲洗3次后剪成约1mm³大小，用0.1％的胶原酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)在37℃下消化30min，加入培养液DMEM(含10％胎牛血清)终止消化，用75um孔径的细胞筛(cell strainer)过滤，除去未消化组织，在滤液中加入D-Hank’s液3ml，1000rpm离心5min，弃去上清，用D-Hank’s液漂洗重悬细胞沉淀1次，1000rpm离心5min，弃去上清，将沉淀细胞悬浮于培养液D/F，接种于一次性塑料培养皿中(d＝35mm)，放入37℃，5％CO₂的空气环境、饱和湿度的细胞培养箱中培养。

2.肿瘤“细胞岛”的克隆扩大培养

培养数天后，通过肿瘤细胞克隆消化法，获取纯种的肿瘤细胞，对肿瘤细胞进行扩大培养，避免了成纤维细胞对肿瘤细胞的抑制作用。具体方法如下：先将细胞接种到培养皿，培养5天～7天后，很多肿瘤细胞凋亡，但出现了一些生长旺盛的“细胞岛”(见图1)，在倒置相差显微镜下对这些“细胞岛”位置在平皿底部用油性笔定位标记。将培养液吸弃，加入2ml胰蛋白酶消化液预消化，使用20ul移液枪吸取10ul培养液，让消化液保持在枪头管口处，将枪头置于所标记的“细胞岛”上面，吹出少量培养液，随即将培养液重新吸回移液枪的枪头内。将含细胞的培养液种入24孔板内，加入约1ml的D/F培养液继续培养。每隔3～4天换2/3的D/F培养液，细胞长满皿底的80％～90％后进行扩大培养。

3.肿瘤细胞的传代培养

根据细胞的状态及培养液颜色的变化，每隔3-4天更换2/3的D/F培养液，细胞长满皿底的80％-90％即应及时消化传代，分种率1∶2，接种细胞密度为5×10⁵/皿(d＝100mm)。冻存液体外培养到20代以后，细胞生长稳定，改换用DMEM培养液进行培养。

三、结果

来源于肝癌原发灶的细胞未能在体外连续传代，而来源于门静脉癌栓的细胞则在体外连续传代半年多，目前已传至60多代，命名为CSQT-1。具体如下：

1.癌栓细胞的原代培养

原代细胞贴壁生长，1周后出现6个较大的“细胞岛”(见图1)。

2.肿瘤“细胞岛”的克隆扩大培养

经过“细胞岛”的克隆扩大培养法，在6孔板中有一个“细胞岛”来源的细胞在5天后长满皿底，传代到小皿，6天后传代到中皿，4天后传代到大皿(d＝100mm)，在大皿里4天后长满皿底的80％，按1∶2传代(已经第六代)。此后细胞生长开始加速。

3.肿瘤细胞的传代培养

从第六代开始，每隔3天传代一次，每次分种率为1∶2，培养液使用D/F培养液。细胞生长稳定，到20代后，改换成DMEM培养液，细胞经过5天的生长缓慢期，然后继续以每3天一代的速度进行传代，目前已经在体外培养维持半年多，传代至60余代，命名为CSQT-1。

实施例2

来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系生物学特性

在本实施例中，用常规方法对保存号为CCTCC NO：C200814的细胞系CSQT-1进行生物学特性的检测。方法如下：

一、实验方法

1.形态学

(1)大体形态

细胞接种2天后，观察群体细胞的生长形态。

(2)光镜

在倒置相差显微镜下观察培养的活细胞形态结构及其生长特点。

(3)电镜

取40代细胞，扫描及透射电镜观察细胞的超微结构。

2.细胞动力学

(1)细胞生长曲线的绘制及细胞群体倍增时间

取生长良好的对数生长期细胞(第20代)，胰蛋白酶消化细胞，轻轻吹匀，倍比稀释，以每孔100ul(0.6×10⁴)接种于96孔板，每孔再加入DMEM完全培养液100ul，使细胞终浓度为3×10⁴/mL，每组3个复孔。另外一组使用D/F培养液做对照，培养板放入孵箱。24h后，在每组的3孔细胞中加入MTT 20uL(5mg/mL)，置孵箱培养4h后取出，吸尽上清，加入DMSO150uL，置孵箱30min后取出，吸尽孔内液体至一空白96孔板，微型振荡仪上振荡5min，选择波长为550nm，在ELISA仪上测定吸光值，取均值，DMSO做空白对照。其余细胞每2天更换培养液。以后每24h测定吸光值，连续7天，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。用半高度法计算群体倍增时间。

(2)细胞贴壁率

取对数生长期细胞，观察细胞生长良好，胰蛋白酶消化细胞，轻轻吹匀，稀释悬液，计数，以每孔1.2×10⁴接种于24孔板中，共5孔，第0.25h、0.5h、1h、2h、4h分别计数贴壁细胞数，计算出每个时间点的贴壁率，并绘制贴壁率随时间变化图(见图5)。

3.染色体分析

第40代对数生长期的CSQT-1细胞经秋水仙素(终浓度0.05ug/mL)处理1小时后，10％胰蛋白酶消化，1000r/min离心10min，吸去上清液。然后用0.075mol/L KCI低渗处理30min，加入固定液(甲醇∶冰乙酸＝3∶1)混匀预固定，同前离心，吸去上清，再重复固定两次，最后用适量固定液，轻轻吹匀制成细胞悬液，冰湿片滴片，室温老化后将标本放入预温87.5℃的Earle’s溶液中温育，片与片之间留有空隙，进行R显带，标本温育60min后，每隔5～10min取出1～2片，流水下冲洗。温育时间约在60～120min之间。用新鲜配制的10％Giemsa染色液染色8～10min，取出水洗，待干，用Leica CW4000Karyo分析软件镜检分析。

4.AFP与HBsAg检测

分别取第10代和第40代的CSQT-1细胞的培养上清，1200转/分离心12分钟，取上清，送第二军医大学东方肝胆外科医院检验科，检测AFP、HBsAg等。

5.冻存与复苏

细胞的冻存：每隔2-3代，留一皿细胞消化后进行冻存，具体方法如下：取一皿细胞常规胰酶消化后加入含血清的培养液终止消化后，进行细胞计数，按1000转/分离心5分钟，弃上清，用冻存液重悬细胞，最后冻存密度为1×10⁶个/ml，每个冻存管1ml。冻存管放置到程序冻存盒(美国NALGENE公司)内，-80℃过夜，次日放置到液氮中，长期保存。

细胞的复苏：从液氮中取出冻存管，在41℃水浴锅中用力振荡，在1分钟内使冻存液溶解，用1000转/分离心5分钟，弃上清，用培养液重悬细胞，利用胎盘蓝染色计数活细胞存活率，按1×10⁶个/皿(d＝100mm)接种，放入培养箱内培养，次日2/3量换液。

6.异体成瘤

(1)将对数生长期的CSQT-1细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，1000转/分离心5分钟，弃上清，用无血清的DMEM重悬细胞并加入等体积的Matrix gel(美国BD公司)混合制成1×10⁷细胞/mL细胞悬液，备用；

(2)实验动物与动物饲养：BALB/c-nu/nu裸鼠，4-6周龄，购自上海中科院斯莱克实验动物研究中心。实验过程中，裸鼠饲养于局部100级净化饲养柜中，自由进水、进食。细胞接种及给药均在局部100级净化工作台中进行。

(3)细胞异体接种：4～6周龄BALB/c-nu/nu裸鼠，雌雄不拘，每组5只，每只在双侧鼠蹊部皮下接种CSQT-1细胞悬液，按细胞数量分为3组，A组细胞数为8×10⁴，B组细胞数8×10⁵，C组细胞数为8×10⁶。

(4)接种后第八天开始观察成瘤情况。出现肿瘤块，每隔4天称裸鼠体重，并用游标卡尺测量瘤块的长径(L)和短径(W)。体积(v)计算采用经验公式：v＝(W²×L)/2mm³。

7.克隆形成率

接种分散均匀的第40代CSQT-1细胞于6孔板中，每孔1000个细胞，加入2mlDMEM培养液，静止培养2-3周。当培养板中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。甲醇固定加适量结晶紫染料染色5分钟，计数克隆数，取平均值。集落形成率＝克隆数/接种细胞数×100％。

8.肿瘤干细胞组分测定

利用目前通用的肝癌干细胞表面标记物CD133对CSQT-1细胞进行流式细胞仪分析。分别对第15代和第35代细胞进行检测。

二、实验结果

1.形态学

(1)大体形态

细胞接种2天后，肿瘤细胞排列成索状生长，与肝小叶排列相似(见图2)。

(2)光镜

在倒置相差显微镜下观察培养的活细胞，大多呈多角形，胞浆丰富，核大，圆形，核仁多个而明显，可见核分裂和瘤巨细胞。

(3)电镜

扫描电镜显示细胞表面有皱褶，周围有微绒毛或指状突起。透射电镜显示细胞外形不规则，核大有畸变，核质比例增大，核膜有凹陷，有多个核仁，胞质内有丰富的游离核糖体、线粒体、内质网、溶酶体等细胞器，细胞表面有微绒毛，可见细胞间紧密连接(见图3)。

2.细胞动力学

(1)细胞生长曲线的绘制

细胞在两种不同培养基中的生长曲线见图4。在DMEM培养条件下，利用半高度法计算细胞群体倍增时间为48.2小时。

(2)细胞贴壁率

种植4小时后大部分细胞(95％以上)均可以贴壁生长，细胞贴壁率随时间变化见图5。

3.染色体分析

染色体为三倍体和四倍体之间，主流在76-90条，占总数的58％，见图8。

4.肿瘤标志物及乙肝表面抗原检测

第10代和第40代CSQT-1细胞培养上清均未检测到AFP和HBsAg的分泌。

5.冻存与复苏

冻存后的细胞复苏，细胞的存活率约为70％，活细胞培养状况良好。

6.异体成瘤

A组5只老鼠1个月未见明显成瘤(0/5)；B组有3只裸鼠从第3周开始出现肿瘤块，其余2只注射部位的注射包块随时间而逐渐消失，1个月成瘤率为60％(3/5)；C组裸鼠从第10天5只均开始出现明显的肿瘤块，且有明显的血供，至1个月时裸鼠成瘤率为100％(5/5)。

7.克隆形成率

通过计算得到肿瘤细胞的克隆形成率为20±3.0％。

8.肿瘤干细胞组分测定

利用流式细胞仪检测，第15代和35代细胞的CD133(+)细胞含量在20％左右，见图6，图7。

实施例3

培养液D/F(一)

DMEM/F12(1∶1)(美国GIBCO公司)

10％(v/v)胎牛血清(美国Biochrom AG公司)

EGF(美国Sigma公司)20ng/ml

胰岛素5ug/ml

L-谷氨酰胺0.30g/L

青霉素100U/L

链霉素100ug/L

制备方法：按上述浓度可制得培养液D/F。

实施例4

培养液D/F(二)

DMEM/F12(1∶1)(美国GIBCO公司)

10％(v/v)胎牛血清(美国Biochrom AG公司)

EGF(美国Sigma公司)30ng/ml

胰岛素4ug/ml

L-谷氨酰胺0.30g/L

青霉素100U/L

制备方法：按上述浓度可制得培养液D/F。

实施例5

培养液D/F(三)

DMEM/F12(1∶1)(美国GIBCO公司)

10％(v/v)胎牛血清(美国Biochrom AG公司)

EGF(美国Sigma公司)10ng/ml

胰岛素6ug/ml

L-谷氨酰胺0.30g/L

青霉素100U/L

链霉素100ug/L

制备方法：按上述浓度可制得培养液D/F。