适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基

摘要

本发明适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基，包括24种基础代谢营养物、11种维生素、3种转铁蛋白替代物类化合物、5种脂类化合物、2种核酸类化合物、4种激素及生长因子、3种抗氧化剂、1种抗剪切保护剂、1种pH指示剂、2种pH缓冲剂、9种其他无机盐，采用大豆水解物替代动物来源成分，采用硫酸亚铁、硝酸铁和EDTA·2Na的组合物替代转铁蛋白；将上述组分溶解于三次蒸馏水中，可制得所述的培养基；其积极效果是：不含动物来源成分，总蛋白含量低于10毫克/升，有利于产物的分离纯化，适于重组蛋白类药物生产，支持动物细胞的正常生长和长期传代培养，无需适应即可使用，配制方便，适于动物细胞产品的大规模生产。

说明书

【技术领域】

本发明涉及现代生物技术之培养基研发技术领域，具体地说，是一种适于动物细胞大规模培养及抗体、融合蛋白等重组蛋白药物产品生产的无动物来源低蛋白培养基。

【技术背景】

动物细胞培养技术是当今生物工程领域中的前沿课题之一，无论是基础研究还是生产实践方面都得到生物技术界的重视。2000年以来，FDA批准的所有创新生物技术药物中，用酵母表达的只有2种，用大肠杆菌表达的只有6种，而用哺乳动物细胞表达或生产的药物达到55种，占70％以上。2003年6月～2004年6月全球销售额最高的10个生物技术药物中，哺乳动物细胞表达的产品占8个，并且年销售额超过20亿美元的前6位的生物技术药物全部是哺乳动物细胞表达的产品。2005年全球生物技术药物销售额超过500亿美元，哺乳动物细胞表达产品占70％。至2007年末，仅单克隆抗体药物的销售额就达到260亿美元，预计至2013年其销售额将达到490亿美元。应用无血清培养技术进行动物细胞的规模化培养及重组蛋白表达生产已成为一种趋势。

随着哺乳动物细胞培养规模的扩大和生物药物需求的增长，基于细胞及产品特性的无血清培养基的研制已成为细胞工程领域的重要课题。在疫苗生产、单克隆抗体和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分，使工程细胞在最有利于其生长和目的产物表达的培养环境中维持较高的活细胞密度和较长的培养时间，是降低生产成本的有效方法。

与传统的有血清培养基相比，无血清培养基具有诸多优势：第一，无批次差异、无不明血清组分对细胞的影响；第二，避免了血清中外源性污染及对细胞的毒害作用；第三，使产品易于纯化，提高回收率；第四，成分明确，有利于研究细胞的生理状态，可根据不同细胞株设计和优化能支持其高密度培养和产物高水平表达的培养基。此外，无血清培养技术也是进行细胞生长、增殖、分化及基因表达调控等基础研究的关键技术之一。

无血清培养基的开发与优化，主要有以下两个发展方向：一是不添加任何动物来源的成分；二是降低培养基的蛋白质含量。据此，无血清培养基可以分为以下三种：

(一)传统的无血清培养基，即用各类可替代血清功能的组分配制而成，如添加牛血清白蛋白(BSA)、转铁蛋白、胰岛素、从血清中提取的混合脂类及水解蛋白等组分，其特点是蛋白含量高，含有大量动物来源蛋白。

(二)无动物来源成分的培养基，即祛除培养基中的动物来源成分。由于动物来源成分中可能含有潜在的朊蛋白和病毒污染的危险，因此，在培养基中必须慎用动物来源成分，这样才可确保生产的重组蛋白安全可靠。

(三)低蛋白或无蛋白培养基，即减少或祛除培养基中蛋白质成分。降低培养基中的蛋白质含量，可减少产物的分离纯化步骤，提高目标蛋白的回收率和品质，保证批次间的一致性，从而实现整个生产过程的高效率和经济性。

综上所述，动物细胞无血清培养基的开发与优化是朝着“无动物来源、无蛋白”的方向发展的。

经过几十年的发展，哺乳动物细胞〔如杂交瘤、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NSO等〕无血清培养基技术已取得了可喜的进展：

Darfler等人开发了CITTL无血清培养基，以DMEM/F12(1∶1)为基础培养基，添加了5mg/L的过氧化氢酶、1.5mg/L的胰岛素、1.5～3.0mg/L的转铁蛋白、2nmol/L睾酮、0.5mg/L的二亚油酰磷脂胆碱和1.5mg/L的β-甘油磷酸，可支持sf9细胞的克隆化生长，也可用于杂交瘤细胞的培养。

Murakami等人开发了无血清培养基，以DMEM/F12(1∶1)为基础培养基，添加了5mg/L胰岛素、2～35mg/L转铁蛋白、20μmol/L乙醇胺和1nmol/L亚硒酸钠等物质，这就是现被广泛使用的DMEM/F12-ITES配方。

Kover和Frank开发了无血清培养基，以RPMI1640为基础培养基，并添加10mg/L胰岛素、5mg/L转铁蛋白、20μmol/L乙醇胺、5mg/L亚油酸、1g/L牛血清蛋白、3mg/L抗坏血酸、2μg氢化可的松和12种微量元素，可支持几种细胞的生长。

美国专利U.S.P.4927762公开了一种含有抗氧化剂的培养基，阐述了细胞在还原性介质中能更好地生长，同时指出，N-乙酰半胱氨酸、硫乳酸、巯基乙醇等物质的添加可以起到抗氧化的作用。

美国专利U.S.P.4767704主要就微量元素的添加进行了研究，通过对铜、铁、镁、锌、硅、锰、钒、镍、锡、铝、钙、溴、氯、碘、硒、锗等元素和孕酮、腐胺、油酸、嘧啶等物质的添加，开发出了一种无蛋白培养基，使人们认识到微量元素的重要性。

Jinyou Zhang等人以Fe-Na₂SeO₄混合物替代转铁蛋白，研制出的卵巢细胞(CHO)无蛋白培养基能支持较高的活细胞密度。但Fe-Na₂SeO₄混合物的配制十分复杂，条件苛刻，不适用于规模化生产。

目前，以Gibico，Hyclone、JRH等为代表的商业无血清、无蛋白培养基也已相继问世。在已有的无血清培养基中，有些无法实现高密度培养过程；有些虽能很好地支持细胞生长，但可能导致细胞表达产物能力降低，甚至丧失；此外，商业无血清培养基的配方常属商业机密，且组分复杂、价格昂贵，既不利于特定细胞株培养技术的研究，也无法直接用于细胞培养过程的研究、开发和优化。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基，以适应动物细胞大规模培养及工业生产重组蛋白药物产品的需要。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基，其特征是，采用大豆水解物替代动物来源成分(如，牛血清白蛋白等)，采用硫酸亚铁、硝酸铁和EDTA·2Na的组合物替代转铁蛋白，其成分包括基础代谢营养物类、维生素类、转铁蛋白替代物、脂类、核酸类、激素及生长因子类、抗氧化剂类、抗剪切保护剂、pH指示剂、pH缓冲剂和其他无机盐类；

——所述的基础代谢营养物类包括：葡萄糖、大豆水解物、丙酮酸钠、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；

——所述的维生素类包括：生物素、维生素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、泛酸钙、维生素B6、核黄素、维生素B1、硫辛酸；

——所述的转铁蛋白替代物类包括：硫酸亚铁、硝酸铁、EDTA·2Na；

——所述的脂类包括：乙醇胺、吐温80、鱼肝油、胆固醇、亚油酸；

——所述的核酸类包括：胸苷、次黄嘌呤；

——所述的激素及生长因子类包括：孕酮、氢化可的松、重组胰岛素、腐胺；

——所述的抗氧化剂类包括：亚硒酸钠、生育酚、牛磺酸；

——所述的抗剪切保护剂为嵌段式聚醚F68；

——所述的pH指示剂为酚红；

——所述的pH缓冲剂包括碳酸氢钠、Hepes；

——所述的其他无机盐类包括：氯化钙、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、磷酸二氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、硫酸锌、硫酸铜。

一种适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基，其各种成分的含量为(毫克/升)：

葡萄糖(_D-Glucose)                  2000～7000

大豆水解物(Lucratone Soy)          500～1000

丙酮酸钠(Sodium Pyruvate)          55～220

谷氨酰胺(_L-Glutamine)              200～900

丙氨酸(_L-Alanine)                  4～15

精氨酸(_L-Arginine·HCl)            100～300

天冬酰胺(_L-Asparagine·H₂O)        6～15

天冬氨酸(_L-Aspartic Acid)          6～15

半胱氨酸(_L-Cysteine·H₂O)            15～50

胱氨酸(_L-Cystine·2HCl)              30～65

谷氨酸(_L-Glutamic Acid)              5～20

甘氨酸(Glycine)                      15～40

组氨酸(_L-Histidine·HCl·H₂O)        15～40

异亮氨酸(_L-Isoleucine)               50～100

亮氨酸(_L-Leucine)                    50～150

赖氨酸(_L-Lysine·HCl)                80～185

甲硫氨酸(_L-Methionine)               15～35

苯丙氨酸(_L-Phenyalanine)             30～70

脯氨酸(_L-Proline)                    10～34.5

丝氨酸(_L-Serine)                     20～52.5

苏氨酸(_L-Threonine)                  50～107

色氨酸(_L-Tryptophan)                 9～18

酪氨酸(_L-Tyrosine·2Na·2H₂O)        55～120

缬氨酸(_L-Valine)                     50～120

生物素(Biotin)                       0.0035～0.0105

维生素B12(Vitamin B12)               0.50～2.50

氯化胆碱(Choline Chloride)           8.50～30

叶酸(Folic acid)                     2.50～8

肌醇(_I-Nositol)                      12～30

烟酰胺(Niacinamide)                  2～7

泛酸钙(_D-Ca·Pantothenate)           2～8

维生素B6(Pyridoxine·HCl)            2～8

核黄素(Riboflavin)                   0.2～0.7

维生素B1(Thiamine·HCl)              2～8

硫辛酸(Lipoic acid)                  0.08～0.50

硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)                0.417～5

硝酸铁(Fe(NO₃)₃·9H₂O)               0.05～0.8

EDTA·2Na                          2～10

乙醇胺(Ethanolamine)               3～10

吐温80(Tween 80)                   0.24～0.5

鱼肝油(Cod liver oil)              0.1～0.2

胆固醇(Cholesterol)                0.045～0.1

亚油酸(Linoleic acid)              0.042～0.084

胸苷(Thymidine)                    0.4～2.5

次黄嘌呤(Hypoxanthine)             2～20

孕酮(Progesterone)                 0.003～0.012

氢化可的松(Hydrocortisone·HCl)    0.036～0.072

重组胰岛素(Insulin)                3～8

腐胺(Sodium Putrescine·HCl)       0.08～20

亚硒酸钠(Sodium Selenate)          0.02～0.08

生育酚(α-Tocohcrol acetate)       1～4

牛磺酸(Taurin)                     20～50

嵌段式聚醚F68(Pluronic-F68)        500～2000

酚红(Phenol Red)                   8.1

碳酸氢钠(NaHCO₃)                   2450

Hepes                              2000～5000

氯化钙(CaCl₂)                      110～150

氯化镁(MgCl₂)                      40～75

硫酸镁(MgSO₄)                      45～65

氯化钾(KCl)                        310～400

磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·H₂O)           60～120

氯化钠(NaCl)                       6995.5

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)                55～120

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)                0.432～1.25

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)                0.0013～0.0065。

本发明的积极效果是：

(1)不含动物来源成分，总蛋白含量低于10毫克/升，有利于产物的分离纯化，适于动物细胞表达的重组蛋白类药物产品生产，安全可靠。

(2)支持动物细胞的正常生长、重组蛋白表达和长期传代培养，无需适应即可使用，其最高活细胞密度及重组蛋白产量均超过已知的商业培养基。

(3)成分简单，配制方便，适合于动物细胞产品的大规模生产。

【附图说明】

附图为CHO细胞在本发明的无动物来源低蛋白培养基中批培养生长和产物表达曲线的坐标图。

【具体实施方式】

以下对本发明适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基的实施例进行具体说明，但本发明不限于以下的实施方式。

一种适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基，包括24种基础代谢营养物、11种维生素、3种转铁蛋白替代物类化合物、5种脂类化合物、2种核酸类化合物、4种激素及生长因子、3种抗氧化剂、1种抗剪切保护剂、1种pH指示剂、2种pH缓冲剂、9种其他无机盐，各种成分的含量为(毫克/升)：

葡萄糖(_D-Glucose)                    4500

大豆水解物(Lucratone Soy)            1000

丙酮酸钠(Sodium Pyruvate)            55

谷氨酰胺(_L-Glutamine)                584.6

丙氨酸(_L-Alanine)                    5

精氨酸(_L-Arginine·HCl)              155

天冬酰胺(_L-Asparagine·H₂O)          7.5

天冬氨酸(_L-Aspartic Acid)            6.65

半胱氨酸(_L-Cysteine·H₂O)            17.56

胱氨酸(_L-Cystine·2HCl)          31.29

谷氨酸(_L-Glutamic Acid)          7.35

甘氨酸(Glycine)                  18.75

组氨酸(_L-Histidine·HCl·H₂O)    18.75

异亮氨酸(_L-Isoleucine)           54.47

亮氨酸(_L-Leucine)                59.05

赖氨酸(_L-Lysine·HCl)            91.25

甲硫氨酸(_L-Methionine)           17.24

苯丙氨酸(_L-Phenyalanine)         35.48

脯氨酸(_L-Proline)                17.25

丝氨酸(_L-Serine)                 26.25

苏氨酸(_L-Threonine)              53.45

色氨酸(_L-Tryptophan)             9.02

酪氨酸(_L-Tyrosine·2Na·2H₂O)    55.79

缬氨酸(_L-Valine)                 52.85

生物素(Biotin)                   0.0105

维生素B12(Vitamin B12)           2.04

氯化胆碱(Choline Chloride)       26.94

叶酸(Folic acid)                 7.95

肌醇(_I-Nositol)                  12.6

烟酰胺(Niacinamide)              6.06

泛酸钙(_D-Ca·Pantothenate)       6.72

维生素B6(Pyridoxine·HCl)        6.093

核黄素(Riboflavin)               0.657

维生素B1(Thiamine·HCl)          6.51

硫辛酸(Lipoic acid)              0.305

硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)            1.217

硝酸铁(Fe(NO₃)₃·9H₂O)           0.65

EDTA·2Na                          5

乙醇胺(Ethanolamine)               9

吐温80(Tween 80)                   0.24

鱼肝油(Cod liver oil)              0.1

胆固醇(Cholesterol)                0.045

亚油酸(Linoleic acid)              0.042

胸苷(Thymidine)                    2.365

次黄嘌呤(Hypoxanthine)             10

孕酮(Progesterone)                 0.006

氢化可的松(Hydrocortisone·HCl)    0.036

胰岛素(Insulin)                    8

腐胺(Sodium Putrescine·HCl)       0.081

亚硒酸钠(Sodium Selenate)          0.0519

黄体酮(α-Tocohcrol acetate)       2

牛磺酸(Taurin)                     30

嵌段式聚醚F68(Pluronic-F68)        1000

酚红(Phenol Red)                   8.1

碳酸氢钠(NaHCO₃)                   2450

Hepes                              3500

氯化钙(CaCl₂)                      116.6

氯化镁(MgCl₂)                      40.4

硫酸镁(MgSO₄)                      48.84

氯化钾(KCl)                        311.8

磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·H₂O)           120

氯化钠(NaCl)                       6995.5

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)                110

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)                0.006

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)                0.432。

将上述组分溶解于三次蒸馏水中，即可配制成适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基。

使用本发明所述的无动物来源低蛋白培养基，将表达抗CD20嵌合单克隆抗体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)接种于2升生物反应器中，接种密度为2.39×10⁵细胞/毫升，接种时细胞活性为98.45％；细胞在此2升反应器中进行155小时的批培养，对数生长期的平均比生长速率为0.652天^-1，最大活细胞密度达3.75×10⁶细胞/毫升，细胞扩增15.7倍，最大单抗浓度为203毫克/升，活细胞密度对时间的积分值为13.41×10⁹细胞·天，对数生长期单位细胞每天的抗体产量达15.88毫克/10⁹细胞·天。

附图为CHO细胞在本发明的无动物来源低蛋白培养基中批培养生长和产物表达曲线的坐标图，附中，

◆活细胞曲线；

■死细胞曲线；

▲总细胞曲线；

□产物曲线。

从附图的曲线可以得知，本发明适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基能良好地支持细胞的正常生长和产物表达，其最高活细胞密度及产物浓度均超过已知的商业培养基。