5千亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法

摘要

本发明公开了一种5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法。其步骤是：A.试剂、培养基的配制及平板培养基的制备；B.样品的预处理：C.样品的稀释：D.试样涂布及培养：将稀释至10

说明书

技术领域

本发明涉及5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数含量生物检测技术领域，更具体涉及一种5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法。

背景技术

20世纪50年代以来，抗生素作为疾病治疗剂和动物生长促进剂对畜禽、水产养殖业发展发挥了重大作用。然而，由于抗生素负面效果越来越严重，世界卫生组织已禁止在饲料中使用任何抗菌药物，饲料和养殖业以添加抗生素预防和促进动物生长的饲养方式已经受到了很大冲击，抗生素替代品的开发和推广使用成为世界性的重要课题，其中的益生菌受到广泛关注。

益生菌又称微生态制剂，是指有益微生物经过特殊驯化和加工制成的活菌制剂，益生菌可以改善动物肠道中微生物的菌群平衡，防治某些细菌性疾病的发生，能提高动物的饲料利用率、提高机体免疫力，促进生长和改善生产性能，得到安全无药物残留的产品。现已开发成商品制剂的益生菌有：芽胞杆菌类、酵母、乳酸菌、双歧杆菌、链球菌、曲霉等，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillus简称Bs)是最重要的品种。

与食用益生菌一样，饲用益生菌制造业十分年轻。为规范益生菌产业健康有序发展，美国FDA正式规定42种微生物可用作益生菌，其中属于芽胞杆菌的有枯草芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、迟缓芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和短小芽胞杆菌，枯草芽胞杆菌名列首位。中国农业部公布用于饲料的微生物添加剂的有12种：干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌、屎链球菌、乳酸片球菌、枯草芽胞杆菌、纳豆芽胞杆菌、嗜酸乳杆菌、乳链球菌、啤酒酵母、产酛假丝酵母、沼泽红假单胞菌等，枯草芽胞杆菌也榜上有名。

据全球产业分析公司(GIA)发表的《益生菌：全球战略经营报告》，预计到2010年，全球益生菌市场的销售规模(包括医用、食品和饲用)将达到200亿美元。另一市场调研机构BCC公司发布的市场研究报告《益生菌市场：原料、补充剂及食品》显示：2007年，全球益生菌原料、补充剂及食品的市场规模达到149亿美元，到2013年将达到196亿美元，年均复合增长率(CAGR)为4.3％，两份权威调研报告的结论颇为相近。

我国至今没有饲用益生菌销售的官方统计数字，但“山寨版”Bs产品充斥市场，产品纯度低，价格混乱的现象比比皆是，尽管如此，Bs制剂带来的效果，如提高机体免疫力，提高饲料利用率、加快动物生长速率等经济效果还是得到广大用户的认同。

国际市场需要包括Bs的益生菌高端产品，国内随着需求量的增加需要安全、规范的益生菌中低端产品。在这种背景下，科诺公司进入益生菌制造行业。为了提高竞争力，我们利用响应面方法对枯草芽胞杆菌发酵培养基进行筛选，得到一个发酵水平最佳的配方，再进行发酵过程控制的研究，发酵水平大幅度提高。发酵液水平达到200亿cfu/g，原药水平达到5,000亿cfu/g以上，远高于国内通常采用的固体发酵方式生产的枯草杆菌制剂(有效活菌数一般在150亿cfu/g左右)和部分厂家采用液体发酵生产的制剂(芽胞数一般为1000-2000亿cfu/g)。

根据联合国粮农组织(FAO)的规定，益生菌剂应用应该是含有足够数量的活微生物制剂，并能有利于宿主的健康。高含量枯草芽孢杆菌制剂功能性、安全性及其注明产品质量的检测尤为重要，而衡量产品的质量标准主要是含有活菌数量及微生物的种类是否与商标一致。益生菌剂含有足够数量的活菌数，是衡量其质量的一个重要指标。大量研究证明，含有的活菌数越多，对机体的益生作用越显著。常规生物检测法：取一定量的菌剂与无菌水混合，进行系列稀释，然后涂布或倾注平板，通过培养，统计平板上的单菌落数，计算菌剂中的活菌数量。对于高含量枯草芽胞杆菌原药芽胞高度粘结与集聚，分散难的问题，常规的生物检测方法的检测结果误差大，重复性低。

活菌计数技术作为常规的微生物学技术，是衡量细胞生物量和产率的重要手段，广泛用于微生物发酵行业。然而，对于高含量枯草芽胞杆菌原药(5,000亿cfu/g)，由于芽胞的高度粘结与集聚，不易分散，且不同芽胞的热稳定性和生物活性也不相同，造成芽胞检测的困难，因此，如何准确、快速地检测高含量枯草芽胞芽胞成为本项目质量控制的关键。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，该方法操作简便，灵敏度高、适合大量样品的检测，是测定样品含有的活菌数和菌株鉴定的经典方法。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明涉及活芽胞检测技术作为常规的微生物学技术，是衡量细胞生物量和产率的重要手段。针对高含量枯草芽胞杆菌原粉制剂(5,000亿cfu/g)不易检测的难点，如枯草芽胞杆菌原粉制剂中芽胞的高度粘结与集聚，不易分散，不同的稀释程序、不同的涂布方式和次数，对检测准确性和稳定的影响很大。建立良好的高含量枯草芽胞杆菌原粉芽胞数的检测技术，可以准确的检测出产品中活芽胞的数量。利用这一技术，在一般实验室及相对简单的实验设备都能进行检测。

检测操作流程：称取适量0.99g-1.01g(准确至0.0002g)5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品与混有10％(体积比)吐温-80溶液的生理盐水混匀，(吐温-80作为表面活性剂，能有效的分散聚集的芽胞)，放磁力搅拌器(CJJ-4上海君竺仪器制造有限公司)上混合，28-32min后放入超声波水浴器(KQ-600B昆山市超声仪器有限公司)超声波处理13-17min，再用匀质器(Bagmixer400W/P/VW)处理8-12min，(超声波与匀质器处理，能有效分散粉剂中粘结集聚的芽胞)进行稀释，稀释至10^-8水浴28-32min(68-72℃)，然后再稀释至10^-9取0.1mL涂布。5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌制剂样品培养：涂布完成后的平板放入37℃恒温培养箱(WMK-02湖北黄石市医疗器械厂)中16-20hr。计数：5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品培养16-20hr后，统计平板上的单菌落数，计算菌剂中的活菌数量，得到了5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品的准确的芽胞数。

一种5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，其步骤是：

1、试剂及培养基的配制：

(1)10％(体积比)吐温-80溶液：准确移取10mL吐温-80于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，配制成10％(体积比)吐温-80溶液，121℃灭菌30min备用。

(2)生理盐水：8.5gNaCl用蒸馏水定容至1000mL，分装400mL每瓶，121℃灭菌30min备用。

(3)配制营养琼脂培养基：胰蛋白胨5g、酵母浸粉2.5g、氯化钠5g、葡萄糖1g、琼脂15g、蒸馏水1000mL、pH 6.8-7.2、121℃灭菌30min；

(4)营养琼脂培养基灭菌后降温48-52℃时，倒平板，待平板培养基凝固后，用灭菌好的牛皮纸包好，底朝上斜放在37℃恒温培养箱中培养18-22hr，以保证平板干燥、无污染。

2、5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品的预处理：

(1)按照1％(体积比)的比例在无菌生理盐水中加入灭好菌的10％(体积比)吐温-80溶液，混合均匀，待用；

(2)称取0.99g-1.01g(准确至0.0002g)的试样于中性瓶中。猛烈摇动，使之混合均匀。

(3)把中性瓶放在磁力搅拌器平台上，混合28-32min；在13-17min时剧烈摇动1min，再次将磁力搅拌混合13-17min。

(4)将已混合好的试样放入超声波水浴器中(超声波水浴器水平面必须等同于试样液面，试样瓶应放在超声波振源处)，共超声13-17min(7min时停止，猛烈摇动试样瓶1min，然后再超声8min)。

(5)在超声波处理之后，再次用匀质器(速度：6～9次挤压/秒)处理8-12min。3、5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品的稀释：

(1)向7支无菌试管分别加入4.5mL生理盐水和10％(体积比)吐温-80溶液混合的稀释液，试管上标记样品号和稀释倍数的字样。操作在超净工作台中进行。

(2)吸取0.5mL已处理好的试样溶液到第一支1支试管中，再从第1支试管吸取0.5mL试样溶液于第2支试管，依次进行到第6支试管，稀释浓度至10^-8(每次加液后，需混合均匀，再进行下一次操作)。

(3)将5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品至10^-8试管放入68-72℃水浴锅中水浴28-32min取出后立即冷却至25-30℃。然后准确吸取0.5mL该试管试样溶液于第7支试管，稀释浓度至10^-9，混匀，备用。

4、5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品涂布及培养：

将稀释至10^-9试样各准确吸取0.1mL到5个营养琼脂平板中，各平板均标上样品号、日期、稀释度。使用1支涂棒，将已放在平板中的试样涂布到全部被培养基吸收，涂布3个平板后用涂棒在空白的营养琼脂平板上来回涂布20次；换1支涂棒将其余两个平板中的试样涂布到全部被培养基吸收，再用涂棒在空白的营养琼脂平板上来回涂布20次。涂布完成后，将其放在37℃恒温培养箱中16hr-20hr。

5、计数：5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品培养16-20hr后，统计平板上的单菌落数，计算原粉中的活芽胞数含量。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

(1)处理方法能有效分散粉剂中粘结集聚的芽胞、杀灭热稳定性和生物活性不稳定的无效芽胞，准确的检测出产品中有效活芽胞的数量；

(2)重复性好；

(3)检测过程不需要特殊昂贵的仪器；

(4)成本低；

(5)可以同时检测8-10个样品；

(6)操作简单便于推广。

具体实施方式

一种5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，包括下列步骤：

1、试剂、培养基的配制及平板培养基的制备：

(1)10％(体积比)吐温-80溶液：准确移取10mL吐温-80于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，配制成10％吐温-80溶液，121℃灭菌30min备用。

(2)生理盐水：8.5gNaCl用蒸馏水定容至1000mL，分装400mL每瓶，121℃灭菌30min备用。

(3)配制营养琼脂培养基：胰蛋白胨5g、酵母浸粉2.5g、氯化钠5g、葡萄糖1g、琼脂15g、蒸馏水1000mL、pH 6.8-7.2、121℃灭菌30min；

(4)营养琼脂培养基灭菌后降温48-52℃时，倒平板，待平板培养基凝固后，用灭菌好的牛皮纸包好，底朝上斜放在37℃恒温培养箱中培养18-22hr，以保证平板干燥、无污染。

2、5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品的预处理：

(1)按照1％(体积比)的比例在无菌生理盐水中加入灭好菌的10％(体积比)吐温-80溶液，混合均匀，待用；

(2)称取0.99g-1.01g(准确至0.0002g)的试样于中性瓶中。猛烈摇动，使之混合均匀。

(3)把中性瓶放在磁力搅拌器平台上，混合28-32min；在13-17min时剧烈摇动1min，再次将磁力搅拌混合13-17min。

(4)将已混合好的试样放入超声波水浴器中(超声波水浴器水平面必须等同于试样液面，试样瓶应放在超声波振源处)，共超声13-17min(7min时停止，猛烈摇动试样瓶1min，然后再超声8min)。

(5)在超声波处理之后，再次用匀质器(速度：6～9次挤压/秒)处理8-12min。3、5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品的稀释：

(1)向7支无菌试管分别加入4.5mL生理盐水和10％(体积比)吐温-80溶液混合的稀释液，试管上标记样品号和稀释倍数的字样。操作在超净工作台中进行。

(2)吸取0.5mL已处理好的试样溶液到第1支试管中，再从第1支试管吸取0.5mL试样溶液于第2支试管，依次进行到第6支试管，稀释浓度至10^-8(每次加液后，需混合均匀，再进行下一次操作)。

(3)将5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品至10^-8试管放入68-72℃水浴锅中水浴28-32min取出后立即冷却至25-30℃。然后准确吸取0.5mL该试管试样溶液于第7支试管，稀释浓度至10^-9，混匀，备用。

4、5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品涂布及培养：

将稀释至10^-9试样各准确吸取0.1mL到5个营养琼脂平板中，各平板均标上样品号、日期、稀释度。使用1支涂棒，将已放在平板中的试样涂布到全部被培养基吸收，涂布3个平板后用涂棒在空白的营养琼脂平板上来回涂布20次；换1支涂棒将其余两个平板中的试样涂布到全部被培养基吸收，再用涂棒在空白的营养琼脂平板上来回涂布20次。涂布完成后，将其放在37℃恒温培养箱中16hr-20hr。

5、计数

a)培养16hr-20hr后，统计平板上的单菌落数，计算试样中的活芽胞数。

b)小于30个或大于300个菌落的平板不计数。

c)计算

试样中枯草芽孢杆菌的芽孢数N(单位为cfu/g)，按式(1)计算：

N＝c/m*10¹⁰.........

式中：

C----几个有效平板的平均菌落数，单位为个；

M----试样的称样量，单位为克(g)；

10¹⁰---试样稀释倍数。

两次平行测定相对偏差不大于12％。