一种免佐剂具有防治1型糖尿病作用的免疫调节剂

摘要

本发明提供了一种能用于预防和治疗1型糖尿病的免疫调节剂。单一抗原多肽难以在机体已经发生自免疫攻击后重建免疫耐受，阻断自免疫攻击。将三个抗原表位多肽基因(源于人谷氨酸脱羧酶65分子)依次串联后连接到霍乱毒素B亚基基因下游，实现了串联抗原表位多肽与CTB的融合表达。所得到的融合蛋白不需要添加佐剂，通过粘膜免疫途径可激发机体产生针对该串联抗原多肽的体液免疫耐受，显著降低NOD小鼠糖尿病的发生，能够用于防治1型糖尿病。

说明书

技术领域

本发明涉及DNA重组技术、蛋白分离纯化技术及医学相关领域。更具体地，本发明涉及融合蛋白CTB-GADIII的构建、表达及分离纯化。在医学领域中，本发明是一种免疫调节剂，能用于预防和治疗1型糖尿病。

背景技术

糖尿病是最常见的慢性病之一。随着人们生活水平的提高，人口老龄化以及肥胖发生率的增加，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势。糖尿病分为1型和2型两种。1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，表现为机体对胰腺抗原成分免疫欠耐受，针对胰腺β细胞发生自身免疫性破坏，进而导致胰腺功能丧失，胰岛素分泌减少或缺乏，出现高血糖等代谢紊乱。一旦发病，患者需要终生外源使用胰岛素。因此1型糖尿病也曾经被称为胰岛素依赖性糖尿病或自免疫性糖尿病。1型糖尿病约占总糖尿病患病人数的10％，多发生于青少年。成人隐匿性自身免疫糖尿病是从貌似2型糖尿病患者中筛选出来的1型糖尿病，是1型糖尿病的亚型。因为它是以胰岛β细胞破坏为主，从本质上属于1型糖尿病。这种特殊类型的糖尿病患者占总患者人数的10-15％。

目前1型糖尿病的治疗研究主要集中在异种胰腺/胰岛素细胞移植，胰岛素及其他药物治疗，预防以及治疗疫苗，基因免疫治疗以及致病基因的破译等方面。在药物开发方面主要的研究成果集中于自身抗原疫苗的研究开发。一般情况下，自身免疫性疾病可以通过免疫相关自身抗原产生免疫耐受来中断机体对自身抗原的免疫应答。1型糖尿病相关自身抗原有胰岛素(Ins)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、热休克蛋白60(HSP60)等。GAD主要在脑组织和胰岛β细胞的分泌颗粒中表达，其主要作用是催化谷氨酸脱羧形成γ氨基丁酸(GABA)，而GABA是一种重要的神经递质。目前确定GAD分为两型：GAD67和GAD65，分别由不同的基因编码，其氨基酸序列有70％相似。上世纪90年代的研究确认，GAD65分子存在于胰岛中，是1型糖尿病的特异性靶抗原，因为针对GAD65的抗体可出现于发病前多年。1型糖尿病病人中的自身抗体反应局限于GAD65特异性表位，只有11％～18％的病人具有与GAD67共同的表位。1993年，Kaufman等人发现，NOD小鼠体内存在针对GAD65分子的自免疫性T细胞应答，由此开始开展基于GAD65分子的药物研究。使用基因方法发现，使β胰岛细胞的GAD65表达缺失可保护细胞免受T细胞介导的免疫攻击，防止NOD小鼠发生1型糖尿病，即NOD小鼠的β细胞表达GAD65分子是发生1型糖尿病的必要条件。据报道GAD65的氨基酸序列与柯萨奇病毒蛋白序列相似，当病毒感染后，因病毒与β细胞具有相同抗原性而产生交叉免疫反应，针对病毒的抗体及效应T细胞在消灭病毒的同时也破坏β细胞。2001年，研究者发现在NOD小鼠中使用GAD质粒DNA可以达到预防1型糖尿病的作用。目前GAD65全肽作为1型糖尿病病人药物正在欧洲和美国进行三期临床实验。与此同时，对GAD65分子上各相关肽的研究也在进行中。抗原肽特异性免疫较全肽的优势在于可以更特异的诱导自免疫性T细胞的耐受，而对免疫系统没有较大影响。然而研究发现，在疾病后期，难以使用单一肽段或表位达到抑制疾病的目的。有研究认为需要使用混合的非靶点肽在疾病后期进行治疗作用，以激发未分化的T细胞产生调节作用。也有研究发现，含有多表位的长肽基因注射给予NOD小鼠具有疾病后期进行1型糖尿病治疗的作用。

GAD65相关肽p217-236，p524-538以及p290-306都是β细胞抗原靶决定簇。使用这些肽可以在NOD小鼠发生胰腺炎前(4周龄以前)达到预防1型糖尿病的效果，诱导体内的Th1型炎症应答向Th2型保护性应答或其他的调节性应答漂移。但是在疾病中后期，单独使用这些肽没有抑制疾病的作用，这是由于在已经建立的Th1炎症应答的内环境中，单纯使用单肽注射难以产生足够的调节作用。

使用抗原免疫预防和治疗1型糖尿病的效果与以下三方面的因素相关：1.抗原肽的选择。使用肽进行免疫治疗，在疾病后期抑制疾病发展的效果与选择的肽密切相关。研究发现存在不同的T细胞表位肽，分别具有不同的预防、治疗甚至是加剧疾病发展的能力。2.免疫治疗介入时间。使用抗原肽容易在疾病发生前期控制疾病发展，但在已经发生胰腺细胞浸润后，给予单一抗原肽难以在炎症环境中诱发足够的耐受和调节作用，因而难以达到治疗作用。3.给药途径。研究发现相同肽使用注射或粘膜免疫可以达到不同甚至完全相反的效果。此外对于需长期服药的1型糖尿病病人而言，口服是最受欢迎的给药方式。然而对于多肽药物而言，由于胃肠道内存在大量肽水解酶和蛋白水解酶，口服极易被催化分解，失去药物活性；或发生首过效应而被肝脏代谢消除。口服耐受的产生和维持，必须尽早和长期口服大量抗原，如果抗原的来源有限或成本过高，都将限制其广阔的应用前景。

霍乱毒素B亚基(CTB)是一种重要的疫苗载体，它是霍乱毒素的无毒亚基，具有结合真核细胞神经节苷脂GM1受体的功能，可以使得与它结合的抗原分子紧密结合在粘膜细胞表面，是很好的粘膜免疫剂，能达到无创给药的目的。同时使用CTB作为在位佐剂，可以有效降低抗原给予量以及免疫次数，防止致命性过敏反应的发生。本发明使用CTB作为载体，将GAD65三肽串联连接在CTB下游，可以得到用于粘膜免疫的疫苗，其中CTB所具有的佐剂功能，可以非特异性刺激T细胞或作用于巨噬细胞，起到呈递特异性抗原的作用；串联多肽可以增大表位剂量，提高药效。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有防治人1型糖尿病作用的免疫调节剂。

本发明的另一目的是提供生产该免疫调节剂的方法。

本发明的再一目的是提供了该免疫调节剂的免疫途径。

本发明的最终目的是公开该免疫调节剂的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种具有防治人1型糖尿病作用的免疫调节剂。该调节剂采用基因工程手段，将源于GAD65的多肽基因依次插入CTB基因的下游，使串联抗原多肽与CTB融合表达。为叙述方便，在实施例中，本发明的串联抗原多肽使用“GADIII”表示，含有人GAD65 p217-236，p524-538，p290-306依次串联。CTB是指来源于霍乱毒菌的霍乱毒素的B亚基。将串联多肽与CTB融合表达，能强化抗原多肽的免疫原性。将三段抗原表位与CTB融合表达所获得的具有防治人1型糖尿病作用的免疫调节剂表示为CTB-GADIII。

在本发明的第二方面，提供了生产该免疫调节剂的方法，其技术路线详述如下：

1.GADIII基因的设计与获得。

GADIII是人GAD65上三段抗原肽串联得到的多肽。三段抗原肽的氨基酸序列分别是：p217-236 EYVTLKKMREIIGWPGGSGD，p524-538 SRLSKVAPVIKARMM，p290-306AALGIGTDSVILIKCDE。根据此三肽的氨基酸序列，选择原核和真核生物均使用的密码子，借助于计算机设计六条寡核苷酸，分别作为一条上游引物和五条下游引物，并在上游引物1的5’端加上限制性内切酶NheI的酶切位点，下游引物6的5’端加上终止密码子和限制性内切酶HindIII的酶切位点，通过聚合酶链式反应(PCR)法获得GADIII串联多肽的核苷酸序列。

2.pET28a-CTB-GADIII重组基因工程菌的构建。

将霍乱霉素B亚基(CTB)的DNA序列插入pET28a质粒中，得到重组质粒pET28a-CTB由我们实验室保存。GADIII基因经NheI和HindIII切割后插入经同样酶切割的pET28a-CTB质粒中，组成融合表达的重组质粒pET28a-CTB-GADIII，重组质粒转化大肠杆菌BL21，获得重组基因工程菌。

3.包涵体形式表达融合蛋白。

在37℃下培养含有表达融合蛋白的重组质粒的重组基因工程菌，用终浓度为3～15mmol/L的α-乳糖诱导表达融合蛋白；

4.融合蛋白的纯化。

将所述重组基因工程菌的菌体裂解后离心收集含有融合蛋白的包涵体沉淀、用包涵体洗涤液和0.5-2mol/L尿素溶液洗去部分杂质、再用6-8mol/L尿素溶液变性溶解包涵体、经离子交换柱层析纯化、缓冲液复性、分子筛Sephadex G100柱层析，得到纯化的CTB-GADIII融合蛋白。

在本发明的第三方面是提供了该免疫调节剂的免疫途径。利用鼻粘膜给药进行粘膜免疫简便易行，药物经鼻粘膜部丰富的毛细血管吸收后直接进入体循环，使药物不良反应发生几率大为降低。通过鼻粘膜给药可免受胃肠道中酶的破坏和肝脏对药物的首过清除效应，有利于提高生物利用度和血药浓度，极大减少药物用量。采用黏膜方式给药，诱使机体重新建立对这些表位的免疫耐受，从而抑制了可能发生的自身免疫攻击。

在本发明的第四方面是该免疫调节剂的用途。如上所述，此免疫调节剂能用于防治人1型糖尿病的发生。我们选用国际上通用的1型糖尿病动物模型NOD(nonobese diabetic mouse，NOD)小鼠，随机分成三组，每组10只，分别是CTB-GADIII融合蛋白鼻腔粘膜免疫组，CTB蛋白鼻腔粘膜免疫组，PBS空白对照组。分别于8周龄、10周龄、12周龄3次免疫，使用PBS溶解蛋白，不加其他佐剂，每次免疫剂量为0.001μmol/只。每月测定小鼠体内血糖水平。结果显示，CTB-GADIII可以降低机体对GADIII的体液免疫，显著推迟NOD小鼠糖尿病的发生，并显著降低糖尿病发病率。

附图说明

图1载体质粒pET28a-CTB(A)以及pET28a-CTB-GADIII(B)结构图。

图2重组质粒pET28a-CTB-GADIII C端部分基因测序结果。

图3SDS-PAGE电泳显示重组质粒pET28a-CTB-GADIII的融合表达。1.大肠杆菌BL21细胞全蛋白；2大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；3.载荷pET28a-CTB-GADIII质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；4.标准分子量蛋白。

图4SDS-PAGE电泳显示纯化的CTB-GADIII蛋白。1.CTB-GADIII单体蛋白；2.CTB-GADIII五聚体蛋白；3.标准分子量蛋白。

图5各组NOD小鼠免疫后血清抗GADIII抗体分析。每月从小鼠眼底丛静脉取血，使用rhVEGF-GADIII融合蛋白作为包被抗原，测定抗GADIII抗体滴度。

图6各组NOD小鼠免疫后不同周龄发病率统计。每四周一次从小鼠眼底丛静脉取血用于血糖分析。两次连续测定结果＞11.1mmol/L判定为发病。结果显示：CTB-GADIII融合蛋白鼻腔粘膜免疫可以显著降低NOD小鼠发病率。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案进一步说明。

(1)菌株，细胞系和质粒：

宿主菌E.coli BL21(Escherichia coli BL21)是基因工程常用工具菌种，在与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。

质粒pET28a购自Novagen公司。

质粒pET28a-CTB由本实验室构建并保存，CTB蛋白、rhVEGF-GADIII融合蛋白也由本实验室分离纯化。

(2)酶和试剂：分子克隆工具酶和试剂、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品；PCR回收试剂盒和琼脂糖胶回收试剂盒为上海华舜生物工程公司产品。

(3)培养基：LB培养基，配方见参考文献Salmbrook J，Fristsh EF，Maniatis T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2^nd ed.NY：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989。

(4)CM52纤维素为Whatman公司产品，Sephadex G100为Pharmacia Biotech公司产品。

(5)辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗为武汉博士德公司产品。

(6)3、3’、5、5’-四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)、过氧化氢脲和牛血清白蛋白(BSA)为美国西格玛(Sigma)公司产品。

(7)96孔酶标板为美国康宁(Corning)公司产品。

(8)测定血清中血糖浓度的仪器为Hitachi Automatic Analyzer(Model-7150，Tokyo，Janpan)。

(9)考马斯亮蓝试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。

方法

分子生物学操作方法

质粒提取、聚合酶链式反应、限制性核酸内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转化大肠杆菌；在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见Salmbrook J，Fristsh EF，Maniatis T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2^nd ed.NY：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，pp，16-340。

重组蛋白表达量的测定：参见Salmbrook J，Fristsh EF，Maniatis T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2^nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法进行。

实施例1：CTB-GADIII多肽基因的设计、合成和克隆

根据CTB基因和GAD65抗原肽基因的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，借助于计算机设计六条寡核苷酸片段，首先通过PCR法合成GADIII多肽基因，将该基因克隆到pET28a-CTB基因的下游，转化大肠杆菌得到重组质粒命名pET28a-CTB-GADIII。具体方法如下：

六条寡核苷酸：

P1：5′-AAAGCTAGCGGTGGTGAATACGTTACTCTGAAAAAAATGCGTGAAATCATCGGTT-3′

P2：5′-AAAAAGCTTAGTCACCTGAACCACCCGGCCAACCGATGATTTCACGCATT-3′

P3：5′-GATAACCGGAGCAACTTTAGACAGACGTGAGTCACCTGAACCACCCGGCCAA-3′

P4：5′-AAAAAGCTTACATCATACGAGCTTTGATAACCGGAGCAACTTTAGAC-3′

P5：5′-AACGGAGTCAGTACCGATACCCAGAGCAGCCATCATACGAGCTTTGATAA-3′

P6：5′-AAAAAGCTTATTCGTCGCATTTGATTAAGATAACGGAGTCAGTACCGATAC-3′

上游引物P1引入NheI酶切位点，下游引物P6引入HindIII酶切位点。

通过PCR获得GADI多肽基因：将寡核苷酸片段P1和P2按一定比例混合，二者互为引物和模板，94℃1min，53℃1min，72℃30sec，共30个循环；72℃，10min。将扩增获得的PCR产物经试剂盒纯化后作为模板，使用引物1和引物3作为上下游引物，94℃1min，57℃1min，72℃30sec，共30个循环；72℃，10min。通过PCR获得GADII(1)基因片段，再使用经试剂盒纯化后的GADII(1)作为模板，引物1和引物4作为上下游引物，94℃1min，57℃1min，72℃30sec，共30个循环；72℃，10min。PCR获得GADII基因片段。使用纯化后的GADII基因片段为模板，引物1和引物5作为上下游引物，94℃1min，60℃1min，72℃30sec，共30个循环；72℃，10min，获得GADIII(1)基因片段。最后使用GADIII(1)基因片段作为模板，引物1和引物6作为上下游模板，94℃1min，59℃1min，72℃30sec，共30个循环；72℃，10min。最终获得GADIII基因片段。

将扩增所得PCR产物经PCR纯化试剂盒纯化后用限制性内切酶NheI和HindIII消化，与用NheI和HindIII消化的pET28a-CTB质粒连接，连接产物转化大肠杆菌BL21，所获得的转化子中含CTB-GADIII融合蛋白基因的重组质粒pET28a-CTB-GADIII。结构框架见图1，C端部分基因序列见图2。

实施例2：CTB-GADIII基因在大肠杆菌中的表达

将重组质粒pET28a-CTB-GADIII转化大肠杆菌BL21。从生长有不同转化子平板上挑取单菌落接种含有50μg/ml卡那霉素LB液体培养基，于37℃培养4小时后，加入终浓度为5mmol/L的α-乳糖诱导大肠杆菌表达T₇RNA聚合酶，继续培养从而表达融合蛋白CTB-GADIII。诱导后每隔1小时取少量菌液，离心回收菌体，SDS-PAGE电泳再经薄层扫描显示已经实现了CTB-GADIII多肽基因的融合表达。融合蛋白在诱导6小时达到稳定的最大表达量，融合蛋白占细菌总蛋白的50％以上，结果见图3.

实施例3：重组蛋白CTB-GADIII的分离纯化

使用含1％Triton的PBS缓冲液将包涵体洗涤3次。将初步纯化的融合蛋白CTB-GADIII溶解于含有8mol/L尿素的0.1mol/L Tris缓冲溶液中(pH 8.9)。使用CM52阳离子交换树脂分离纯化变性蛋白。用含有8mol/L尿素的Tris/NaCl梯度洗脱，分段收集进行SDS-PAGE电泳检测，CTB-GADIII在120-150mmolNaCl处的洗脱峰中。将得到的纯化蛋白溶解在含有0.1mol/L Tris-HCl，pH 8.9，0.4mol/L NaCl和2mmol/l EDTA的复性缓冲液中，37℃过夜孵育复性。复性蛋白进一步通过分子筛分离单体和五聚体。用SDS-PAGE电泳检查其纯度，见图4。

实施例4：CTB-GADIII重组蛋白的药效学研究

选用8周龄雌性NOD小鼠，随机分为3组，每组10只，分别是CTB-GADIII鼻腔粘膜免疫组、CTB蛋白对照组和PBS空白对照组。小鼠分别在8、10、12周龄滴鼻给予PBS稀释的蛋白，每次每只小鼠的给药剂量为0.001μmol。三次免疫结束后，每月从小鼠眼眶后静脉丛取血一次，4000rpm，10min离心，取血清，5小时内用全自动生化分析仪(Hitachi，model-7150)测定血糖的浓度。两次连续测定血糖浓度＞11.1mmol/L视为发生糖尿病。结果显示：CTB-GADIII蛋白鼻腔粘膜免疫组可显著降低NOD小鼠糖尿病发病率。各组发病率见图5。

实施例5：抗GADIII抗体的ELISA检测

使用本实验室制备的rhVEGF-GADIII蛋白作为包被抗原包被96孔酶标板。rhVEGF-GADIII溶于包被稀释液(0.05mmmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH 9.6)，1μg/μl，每孔加入100μl，4℃包被过夜。弃去包被液，加入5％BSA(pH 7.4PBS配制)封闭液，4℃满孔封闭过夜。弃去封闭液，每孔加入1∶1005％BSA封闭液稀释的小鼠血清100μl，37℃孵育1h。弃去血清，每孔用PBST和自来水间隔洗涤，每次3min，共洗涤6次。洗涤后，每孔加入用5％BSA封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG二抗100μl，稀释倍数为1∶20000，37℃孵育1h。弃去酶标二抗液，每孔用PBST和自来水间隔洗涤，每次3min，共洗涤6次。洗涤后，每孔加入100μl底物液(过氧化氢脲和3，3`，5，5`-四甲基联苯胺(TMB)溶液)。37℃反应30min后，加入2mol/L H₂SO₄终止反应，用酶标仪在450nm波长下测定每孔的光密度值。结果显示CTB-GADIII给药组小鼠在给药后13周龄开始，抗GADIII抗体滴度显著降低于PBS组和CTB对照组，并且持续至观测结束。所得结果见图6。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>中国药科大学

<120>一种免佐剂具有防治I型糖尿病作用的免疫调节剂

<130>免疫调节剂

<160>7

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>160

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>CTB-GADIII

<400>1

Met Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr

1               5                   10                  15

Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu

            20                  25                  30

Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile

        35                  40                  45

Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys

    50                  55                  60

Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu

65                  70                  75                  80

Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala

                85                  90                  95

Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Ala Ser Gly Gly Glu Tyr Val Thr

            100                 105                 110

Leu Lys Lys Met Arg Glu Ile Ile Gly Trp Pro Gly Gly Ser Gly Asp

        115                 120                 125

Ser Arg Leu Ser Lys Val Ala Pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Ala

    130                 135                 140

Ala Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys Asp Glu

145                 150                 155                 160

<210>2

<211>55

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>P1

<400>2

aaagctagcg gtggtgaata cgttactctg aaaaaaatgc gtgaaatcat cggtt    55

<210>3

<211>50

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>P2

<400>3

aaaaagctta gtcacctgaa ccacccggcc aaccgatgat ttcacgcatt          50

<210>4

<211>52

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>P3

<400>4

gataaccgga gcaactttag acagacgtga gtcacctgaa ccacccggcc aa      52

<210>5

<211>47

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>P4

<400>5

aaaaagctta catcatacga gctttgataa ccggagcaac tttagac            47

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<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>P5

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aacggagtca gtaccgatac ccagagcagc catcatacga gctttgataa         50

<210>7

<211>51

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>P6

<400>7

aaaaagctta ttcgtcgcat ttgattaaga taacggagtc agtaccgata c        51