公开/公告号CN101578366A
专利类型发明专利
公开/公告日2009-11-11
原文格式PDF
申请/专利权人 三得利控股株式会社;
申请/专利号CN200880001564.X
申请日2008-06-12
分类号C12N15/09;A23D9/00;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N9/10;C12P7/64;
代理机构上海市华诚律师事务所;
代理人徐申民
地址 日本国大阪府
入库时间 2023-12-17 23:01:37
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-05-30
授权
授权
2010-01-06
实质审查的生效
实质审查的生效
2009-11-11
公开
公开
技术领域
本申请基于2007年6月18日申请的日本国专利申请2007-160042，主张优先权。
本发明涉及新型甘油-3-磷酸酰基转移酶基因。
背景技术
脂肪酸是构成磷脂质、三酰基甘油等脂质的重要成分。含有2个以上不饱和键的脂肪酸总称为高不饱和脂肪酸(PUFA)，已知有花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等，并已报道了各种生理活性(非专利文献1)。虽然在期待着这种高不饱和脂肪酸在各种领域的应用，但其中也包括了在动物体内不能合成的物质。因此，开发出了培养各种微生物获得高不饱和脂肪酸的方法。并且，也在尝试利用植物生产高不饱和脂肪酸。已知在这种情况下，高不饱和脂肪酸例如作为三酰基甘油等储存脂质的构成成分，在微生物的菌体内或植物种子中积累。
更加详细地说，三酰基甘油在生物体内按以下方式生成。甘油-3-磷酸被甘油-3-磷酸酰基转移酶酰化生成溶血磷脂酸，该溶血磷脂酸被溶血磷脂酸酰基转移酶酰化生成磷脂酸，该磷脂酸被磷脂酸磷酸酯酶脱磷酸化生成二酰基甘油，该二酰基甘油被二酰基甘油酰基转移酶酰化生成三酰基甘油。并且已知酰基CoA：胆甾醇酰基转移酶、溶血卵磷脂酰基转移酶等间接参与三酰基甘油的生物合成。
在上述三酰基甘油生物合成途径、磷脂质生物合成途径中，通过甘油-3-磷酸的酰化生成溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid)的反应中，已知有甘油-3-磷酸酰基转移酶(以下有时记为“GPAT”：EC2.3.1.15)的参与。
对于GPAT基因，到目前为止已在几种生物中报道。作为来自哺乳动物的GPAT基因，内质网型(膜结合型)和线粒体型(膜结合型)这2种已被克隆(非专利文献2)。此外，作为来自植物的GPAT基因，内质网型(膜结合型)、线粒体型(膜结合型)及叶绿体型(游离型)这3种已被克隆(非专利文献3)。另外，作为来自真菌酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的GPAT基因，内质网型(膜结合型)的GPT2(GAT1)及SCT1(GAT2)这2种已被克隆(非专利文献4)。因此，GPT2具有可将从棕榈酸(16:0)至油酸(18:1)的广泛范围的脂肪酸作为底物利用的活性。而SCT1则显示了将棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)等碳原子数为16的脂肪酸作为底物的强效选择性(非专利文献4)。并且从大量其他生物中克隆了GPAT基因。
已报道了来自作为脂质生产菌的被孢霉属(Mortierella)微生物的GPAT。对于来自Mortierella ramanniana的GPAT，已分离出内质网型GPAT，显示其选择性地将比棕榈酸(16:0)多5.4倍的油酸(18:1)作为酰基供体利用(非专利文献5)。对于来自高山被孢霉(Mortierella alpina)(以下简写为“M.alpina”)的GPAT，报道微粒体组分中有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性(非专利文献6)。此外，报道如果使存在于M.alpina的微粒体中的GPAT(与膜结合的状态)和各种酰基CoA在体内反应，在维持高的活性的同时将油酸(18:1)、亚油酸(18:2)、二高-γ-亚麻酸(DGLA)(20:3)、花生四烯酸(20:4)等PUFA作为底物广泛利用(专利文献1)。进而，使从M.alpina(ATCC#16266)中克隆的GPAT，在以可生物合成二十碳五烯酸(EPA)的方式发生转化的Yarrowia lipolytica中进行表达，显示总脂肪酸内，二高-γ-亚麻酸(DGLA)(20:3)的组成增大，油酸(18:1)的组成减少。该结果表明长链、不饱和度高的PUFA更能被选择性地利用(专利文献2)。
专利文献1国际公开第WO2004/087902号文本
专利文献2美国专利申请公开第2006/0094091号说明书
非专利文献1Lipids，39，1147(2004)
非专利文献2Biochimica et Biophysica Acta，1348，17-26，1997
非专利文献3Biochimica et Biophysica Acta，1348，10-16，1997
非专利文献4The Journal of Biological Chemistry，276(45)，41710-41716，2001
非专利文献5The Biochemical Journal，355，315-322，2001
非专利文献6Biochemical Society Transactions，28，707-709，2000
发明内容
但是，至今为止已报道的GPAT基因，即使导入宿主细胞使其表达，因其底物特异性，宿主产生的脂肪酸组合物也受到局限。因此，希望鉴定出可产生与以往不同组成的脂肪酸组合物的新型基因。
本发明的目的是提供：通过在宿主细胞内导入或表达，可制造目的脂肪酸组成的油脂、或可增加目的脂肪酸的含量的蛋白质及核酸。
本发明者为了解决上述课题进行了精心研究，首先进行脂质生产菌高山被孢霉(Mortierella alpina)的EST分析，从中提取出与已知GPAT基因同一性高的序列。进而为了获得编码GPAT的开放阅读框(ORF)的全长，进行cDNA文库筛选或通过PCR克隆基因。将其导入酵母等具有高增殖能力的宿主细胞内，以试验产生期望脂肪酸组合物的发明者，成功克隆出可生产与以往GPAT表达的宿主所产生的脂肪酸组合物相比，不同的脂肪酸组合物的底物特异性不同的新型的与GPAT相关的基因，完成了本发明。即本发明如下所述。
(1)核酸，其含有以下(a)～(e)中任一项所述的碱基序列，
(a)碱基序列，其编码由序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或添加后的氨基酸序列组成、且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性的蛋白质，
(b)碱基序列，其与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格的条件下杂交，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性的蛋白质，
(c)碱基序列，其由与序列号4所组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列组成，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性的蛋白质，
(d)碱基序列，其编码与由序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性的蛋白质，
(e)碱基序列，其与由编码序列号2表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交、且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性的蛋白质。
2.如上述(1)所述的核酸，其含有以下(a)～(c)中任一项的碱基序列，
(a)碱基序列，其编码由序列号2表示的氨基酸序列中1～10个氨基酸发生缺失、取代或添加后的氨基酸序列组成、且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性的蛋白质，
(b)碱基序列，其与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性的蛋白质，
(c)碱基序列，其编码与由序列号2组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性的蛋白质。
(3)核酸，其含有以下(a)～(c)中任一项所述的碱基序列或其片段，
(a)碱基序列，其由序列号4表示，
(b)碱基序列，其编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质，
(c)碱基序列，其由序列号1表示。
(4)核酸，其含有以下(a)～(e)中任一项所述的碱基序列，
(a)碱基序列，其编码以下蛋白质，
由序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或添加后的氨基酸序列组成，且具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～v)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，
i)油酸含量
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及
v)花生四烯酸及/或二高-γ-亚麻酸含量的比率
(b)碱基序列，其与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码以下蛋白质，
具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～v)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，
i)油酸含量
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及
v)花生四烯酸及/或二高-γ-亚麻酸含量的比率
(c)碱基序列，其由与序列号4所组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列组成，且编码以下蛋白质，
具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～v)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，
i)油酸含量
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及
v)花生四烯酸及/或二高-γ-亚麻酸含量的比率
(d)碱基序列，其编码以下蛋白质，
由与序列号2所组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～v)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，
i)油酸含量
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及
v)花生四烯酸及/或二高-γ-亚麻酸含量的比率
(e)碱基序列，其与由编码序列号2表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交、且编码以下蛋白质，
具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～v)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，
i)油酸含量
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及
v)花生四烯酸及/或二高-γ-亚麻酸含量的比率。
(5)如上述(4)所述的核酸，其含有以下(a)～(c)中任一项的碱基序列，
(a)碱基序列，其编码以下蛋白质，
由序列号2表示的氨基酸序列中1～10个氨基酸发生缺失、取代或添加后的氨基酸序列组成，且具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～v)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，
i)油酸含量
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及
v)花生四烯酸及/或二高-γ-亚麻酸含量的比率
(b)碱基序列，其与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且编码以下蛋白质，
具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～v)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，
i)油酸含量
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及
v)花生四烯酸及/或二高-γ-亚麻酸含量的比率
(c)碱基序列，其编码以下蛋白质，
由与序列号2所组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～v)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，
i)油酸含量
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及
v)花生四烯酸及/或二高-γ-亚麻酸含量的比率。
(6)蛋白质，其为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，
(a)蛋白质，其由序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或添加后的氨基酸序列组成，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性，
(b)蛋白质，其为由与序列号2所组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性。
(7)蛋白质，其为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，
(a)蛋白质，其由序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或添加后的氨基酸序列组成，且具有可形成在上述氨基酸序列所组成的蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～v)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性，
i)油酸含量
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及
v)花生四烯酸及/或二高-γ-亚麻酸含量的比率
(b)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有可形成在上述氨基酸序列所组成的蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～v)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性，
i)油酸含量
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及
v)花生四烯酸及/或二高-γ-亚麻酸含量的比率。
(8)蛋白质，其由序列号2所示的氨基酸序列组成。
(9)重组载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的核酸。
(10)转化体，其为上述(9)所述的重组载体转化的转化体。
(11)脂肪酸组合物，其为培养上述(10)所述的转化体而获得的脂肪酸组合物，具有可形成在上述脂肪酸组合物的脂肪酸组成中，以下i)～v)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，
i)油酸含量
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及
v)花生四烯酸及/或二高-γ-亚麻酸含量的比率。
(12)上述(11)所述的脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从培养上述(10)所述的转化体而获得的培养物中提取所述的脂肪酸组合物。
(13)食品，其含有上述(11)所述的脂肪酸组合物。
本发明的GPAT，与以往的GPAT的底物特异性不同，可在宿主中产生与以往GPAT表达的宿主产生的脂肪酸组成不同的脂肪酸组合物。因此可提供具有需要的特性、效果的脂质，所以可有效适用于食品、化妆料、医药品、肥皂等中。
此外，因为本发明的GPAT可使脂肪酸、贮藏脂质的生产能力提高，所以优选作为使微生物、植物中的高不饱和脂肪酸的生产效率提高的酶。
附图说明
图1表示本发明的GPAT2的cDNA序列(序列号1)和推定氨基酸序列(序列号2)。图中*表示认为对GPAT活性重要的氨基酸残基，+表示认为对与甘油-3-磷酸的键合重要的氨基酸残基。
具体实施方式
本发明涉及来自被孢霉(Mortierella)属的新型甘油-3-磷酸酰基转移酶基因，该基因的特征在为使甘油-3-磷酸酰化生成溶血磷脂酸。
本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)，是催化使甘油-3-磷酸酰化生成磷脂酸的反应的酶。酰基供体通常为酰基CoA，但不限于此。此外，在本发明涉及的蛋白质的作用下发生的酰基转移反应的酰基受体是甘油-3-磷酸，但并不限于此。
编码本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶的核酸
本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)中包含GPAT2。将编码GPAT2的核酸的cDNA、CDS、ORF以及氨基酸序列的对应关系整理记载于以下表1内。
表1
也就是说，作为与本发明的GPAT2相关的序列，可例举GPAT2的氨基酸序列的序列号2、表示GPAT2的ORF区域序列的序列号4、表示其CDS区域序列的序列号3、以及其cDNA的碱基序列的序列号1。其中，序列号3相当于序列号1的第113～1891位碱基序列，序列号4相当于序列号1的第113～1888位碱基序列、以及序列号3的第1～1776位碱基序列。
本发明的核酸，除单链及双链DNA之外，还包括其RNA互补体，可以来自天然，也可以由人工制作。DNA中例如可例举基因组DNA、与上述基因组DNA对应的cDNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA、以及其组合物、DNA和RNA的杂交体等，但并不限于这些。
作为本发明的核酸的优选形态，可例举(a)序列号4表示的碱基序列、(b)编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列、(c)序列号1表示的碱基序列等。
序列号4表示的碱基序列及编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列、以及序列号1表示的碱基序列，如表1中记载。
为了获得上述碱基序列，也可从具有GPAT活性的生物的EST、基因组DNA的碱基序列数据中，搜索编码与已知的具有GPAT活性的蛋白质有高同一性的蛋白质的碱基序列。作为具有GPAT活性的生物，优选脂质生产菌，作为脂质生产菌，可例举M.alpina，但并不限于此。
进行EST分析时，首先构建cDNA文库。对于cDNA文库的构建方法，可参考“MolecularCloning，A Laboratory Manual 3rd ed.”(Cold Spring Harbor Press(2001))。并且也可用市售的cDNA文库构建试剂盒。作为适用于本发明的cDNA文库的构建方法，例如可例举以下方法。即：将脂质生产菌M.alpina的适当菌株接种到适当的培养基中，预培养适当时间。作为适合该预培养的培养条件，可例举例如培养基的组成为1.8％葡萄糖、1％酵母膏、pH为6.0，培养时间为3天，培养温度为28℃的条件。然后将预培养物在适当的条件下供给本培养。作为适合本培养的培养基组成，例如可例举1.8％葡萄糖、1％大豆粉、0.1％橄榄油、0.01％Adecanol、0.3％KH2PO4、0.1％Na2SO4、0.05％CaCl2·2H2O、0.05％MgCl2·6H2O，pH为6.0。作为适合本培养的培养条件，例如可例举300rpm、1vvm、26℃下通气搅拌培养8天的条件。培养期间也可添加适当量的葡萄糖。在本培养中适时提取培养物，从其中回收菌体，制备总RNA。制备总RNA时，可使用盐酸胍/CsCl法等公知的方法。可使用市售的试剂盒从获得的总RNA中纯化poly(A)+RNA。并且可使用市售的试剂盒构建cDNA文库。然后将构建的cDNA文库的任意的克隆的碱基序列，使用按照可确定载体上插入部分的碱基序列的方式设计的引物进行确定，可获得EST。例如用ZAP-cDNA GigapackIII Gold CloningKit(STRATAGENE)构建cDNA文库时，可进行定向克隆。
用ORF的碱基序列进行比较，本发明的GPAT2基因和公知的来自M.alpina(ATCC#16266)的GPAT1基因的同一性为42.0％。此外，对本发明的GPAT2基因进行BLASTX分析的结果，与编码E-value最低、即同一性最高的来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶样的推定蛋白质序列(GB注册号No.EAA62242)的碱基序列、以及编码功能明确的蛋白质的同一性最高的来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甘油-3-磷酸酰基转移酶的Sct1p(GB注册号No.CAC85390)的碱基序列的同一性，分别为36.9％和36.6％。
同样，本发明的GPAT2与公知的来自M.alpina(ATCC#16266)的GPAT1之间的氨基酸序列的同一性为15.7％。此外，对本发明的GPAT2基因进行BLASTX分析的结果，与E-value最低、即同一性最高的来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶样的推定蛋白质的序列(GB注册号No.EAA62242)、以及功能明确的蛋白质的同一性最高的来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甘油-3-磷酸酰基转移酶的Sct1p(GB注册号No.CAC85390)的同一性，分别为17.0％和15.0％。
本发明还包括：与含有上述序列号4表示的碱基序列(有时记为“本发明的碱基序列”)、以及编码由序列号2表示的氨基酸序列(有时记为“本发明的氨基酸序列”)组成的蛋白质的碱基序列的核酸具有同等功能的核酸。“具有同等功能”是指，本发明的碱基序列编码的蛋白质及由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质具有GPAT活性。此外，除具有这种GPAT活性之外，还包括具有下述活性的蛋白质(以下，有时称为“具有可形成本发明的GPAT的脂肪酸组成的活性的蛋白质”)的情况，该活性可形成：在本发明的碱基序列编码的蛋白质或由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下
i)油酸含量
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及
v)花生四烯酸及/或二高-γ-亚麻酸含量的比率
中的至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成。
具体为：含有编码具有以下活性的蛋白质的碱基序列的核酸，该活性可形成满足以下各项中的至少一项以上的数值的脂肪酸组成，将上述本发明的碱基序列等插入表达载体pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.，59，1221-1228，1995)中，以酵母Saccharomycescerevisiae EH13-15株(Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，515-520，1989)作为宿主进行转化，培养获得的转化体，回收菌体，用以下实施例6等记载的方法进行脂肪酸分析时，上述本发明的GPAT的脂肪酸组成具体为：
i)油酸含量为47％以上，优选48％以上、49％以上、50％以上、51％以上；
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率为8.0以上，优选9.0以上、10.0以上、10.5以上；
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率为8.5以上、优选9.0以上、10.0以上、11.0以上、11.5以上；以及
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率为1.2以上、优选1.3以上、1.4以上；以及
v)花生四烯酸的含有率为0.47以上、优选0.50以上、0.55以上、0.60以上、及/或二高-γ-亚麻酸的含有率为0.34以上、优选0.40以上、0.50以上、0.55以上。
更优选本发明的碱基序列等是含有编码具有GPAT活性及可形成上述本发明的GPAT脂肪酸组成的活性的蛋白质的碱基序列的核酸。
作为本发明的脂肪酸组合物的特征之一，可例举花生四烯酸的含有率高。花生四烯酸是用化学式C20H32O2表示的分子量为304.47的物质，是含有4个双键的20个碳原子的碳链组成的羧酸(〔20:4(n-6)〕)，被分类为(n-6)系。花生四烯酸作为重要的磷脂质而存在于动物的细胞膜中(特别是磷脂酰乙醇胺·磷脂酰胆碱·磷脂酰肌醇)，在脑中大量含有。而且，花生四烯酸是通过花生四烯酸级联反应生成的前列腺素·凝血黄素·白三烯等系列类二十烷酸的起始物质，在细胞间传递信息方面，作为第二信使非常重要。另一方面，动物可以亚油酸为原料在体内合成花生四烯酸。但是，由于动物的种类或年龄等不同，因该功能不充分而不能生产必要的量，或者因完全失去生产功能，所以必须从食物中摄取花生四烯酸，可以说花生四烯酸是必须脂肪酸。
本发明的脂肪酸组合物中的花生四烯酸的含有率，例如可按以下方法测定。即：将本发明的GPAT2的质粒，例如通过实施例8所述的方法插入pDuraSC、pDura5MCS等载体内，使在M.alpina株中转化获得的转化体进行表达，使用根据实施例8所述的培养方法等获得的培养菌体，测定菌体内的脂肪酸含有率、每单位培养基的花生四烯酸的含量等。作为花生四烯酸的含量等的分析方法，可例举例如利用盐酸甲醇法将获得的培养菌体的脂肪酸衍生为脂肪酸甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷后，用气相色谱法进行测定的方法。由此显示，使本发明的GPAT2在M.alpina中转化时，菌体内的脂肪酸含有率、每单位培养基的花生四烯酸生产量均高。因此，花生四烯酸含有率高的本发明的脂肪酸组合物，因为可高效摄取花生四烯酸，所以优选。
此外，作为本发明的脂肪酸组合物的特征之一，可例举二高-γ-亚麻酸含有率高。二高-γ-亚麻酸(DGLA)是用化学式C20H34O2表示的分子量为306.48的物质，是由含有3个双键的20个碳原子的碳链组成的羧酸〔20:3(n-6)〕)，被分类为(n-6)系。DGLA通过γ-亚麻酸(18:3(n-6))延伸而获得。如果DGLA的双键增加1个就变成花生四烯酸。
作为与本发明的核酸具有同等功能的核酸，可例举含有以下(a)～(e)中任一项所述的碱基序列的核酸。此外，在以下例举的碱基序列的记载中，“本发明的上述活性”是指，上述“GPAT活性及/或可形成上述本发明的GPAT的脂肪酸组成的活性”。
(a)碱基序列，其编码由序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或添加后的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质。
本发明的核酸中含有的碱基序列，包括编码由序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或添加后的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
具体为编码由下述氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列，
(i)序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个(优选1个或数个(例如1～180个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、更优选1～5个))氨基酸发生缺失后的氨基酸序列，
(ii)序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个(优选1个或数个(例如1～180个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、更优选1～5个))氨基酸用其他氨基酸取代后的氨基酸序列，
(iii)序列号2表示的氨基酸序列中添加1个或多个(优选1个或数个(例如1～180个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、更优选1～5个))其他氨基酸后的氨基酸序列，或
(iv)将(i)～(iii)组合后的氨基酸序列。
其中，取代优选为保守取代。保守取代是指，将特定的氨基酸残基用具有类似的物理化学特征的残基取代，但只要不实质性改变原来序列的结构相关的特征，也可为任意取代，例如，只要取代氨基酸不破坏原来序列中存在的螺旋结构，或者不破坏赋予原来序列特征的其它种类的二级结构，也可为任何取代。
保守取代通常用生物学合成体系、化学肽合成来导入，优选通过化学肽合成来进行。此时，取代基中可含有非天然的氨基酸残基，也含有肽模仿物、氨基酸序列中没有被取代的区域发生倒位的倒位型或同区域发生反转的反转型。
以下按照可取代氨基酸残基的残基分类例示，但可取代的氨基酸残基并不限于以下记载的残基。
A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；
B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；
C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；
D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；
E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；
F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；
G组：苯丙氨酸、酪氨酸。
非保守性取代时，上述种类中的1种成分可以与其他种类的成分替换，此时为了保持本发明的蛋白质的生物学功能，优选参考氨基酸的亲水指数(亲水性氨基酸指数)(Kyte等，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982))。
此外，非保守性取代时，可根据亲水性进行氨基酸的取代。
在本说明书及图中，碱基、氨基酸及其缩略语，均遵照IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature的规定，或者基于例如Immunology--A Synthesis(第2版，E.S.Golub及D.R.Gren监修，Sinauer Associates，马萨诸塞州Sunderland(1991))等记载的本领域惯用的缩略语。此外，对于氨基酸，如果有光学异构体时，如无特别标示，均表示L体。
D-氨基酸等上述氨基酸的立体异构体、α，α-二取代氨基酸等非天然氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、以及其它非惯用的氨基酸，也可作为构成本发明的蛋白质的要素。
此外，本说明书中使用的蛋白质的表示方法，根据标准用法及本领域常用的表示方法，左方是氨基末端方向，右方是羧基末端方向。
同样，在通常情况下如无特别说明，单链多核苷酸序列的左端为5’端，双链多核苷酸序列的左方为5’方向。
如果是本领域技术人员，使用本领域公知的技术，可设计并构建本说明书中记载的蛋白质的适当的突变体。例如通过将认为对本发明的蛋白质的生物学活性不太重要的区域作为靶区，可鉴定不损坏本发明的蛋白质的生物学活性而可改变其结构的蛋白质分子中适当的区域。并且也可鉴定在类似蛋白质间保守的分子残基及区域。进而，在认为对本发明蛋白质的生物学活性或结构重要的区域中，在不损坏生物学活性、且对蛋白质的多肽结构不产生不良影响的情况下，也可导入保守性氨基酸取代。特别是，在本发明中，如图1中的双重下线所示，本发明的GPAT的氨基酸序列中的第87～93残基中，存在与甘油磷脂质酰基转移酶(Glycerolipid acyltransferase)中必需的保守基序(motif)“HXXXXD(HX4D)”(J.Bacteriology，180，1425-1430，1998)相类似的基序(保守组氨酸及天冬氨酸用＊表示)。此外，在上述保守基序中，X表示可以为任何氨基酸残基。认为该基序对于本发明的GPAT来说，对于维持GPAT活性也很重要。此外，认为图1中用＊表示的本发明的GPAT的氨基酸序列中的第87残基、第93残基、以及第172残基，对于本发明的GPAT的活性重要。并且认为第138残基及第174残基对于本发明的GPAT和甘油-3-磷酸的键合重要。因此，本发明的突变体，只要保存有上述保守基序及上述残基，可以为任何突变体。
只要是本领域技术人员，通过鉴定对本发明的蛋白质生物学活性或结构重要、与该蛋白质的肽相类似的肽残基，比较这2个肽的氨基酸残基，即可预测与本发明的蛋白质类似的蛋白质的哪个残基是与对生物学活性或结构重要的氨基酸残基相对应的氨基酸残基，也就是说，可进行结构-功能研究。进一步通过选择与上述预测的氨基酸残基的化学性质类似的氨基酸取代，可选择保持本发明蛋白质的生物学活性的突变体。此外，如果是本领域技术人员，也可对本蛋白质的突变体的三维结构及氨基酸序列进行分析。并且从获得的分析结果中，也可预测与蛋白质的三维结构相关的氨基酸残基的比对。预测在蛋白质表面上的氨基酸残基，有参与和其他分子的重要相互作用的可能性，如果是本领域技术人员，均可根据上述分析结果，构建使预测在这种蛋白质表面上的氨基酸残基不变化的突变体。进而如果是本领域技术人员，也可构建在构成本发明的蛋白质的各种氨基酸残基中，仅有一个氨基酸残基发生取代的突变体。将这种突变体通过公知的分析方法进行筛选，可收集各种突变体的信息。因此，通过对某种特定氨基酸残基被取代的突变体的生物学活性与本发明的蛋白质的生物学活性相比降低时、不表现这种生物学活性时、或者产生阻碍本蛋白质的生物学活性的不适当活性时的情况进行比较，可评价构成本发明的蛋白质的各种氨基酸残基的有用性。此外，只要是本领域技术人员，根据这种从日常实验中收集的信息，单独或与其他突变组合，即可容易地分析作为本发明蛋白质的突变体所不期望的氨基酸取代。
如上所述，由序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或添加后的氨基酸序列组成的蛋白质，可根据《Molecular Cloning，A Laboratory Manual 3rded.》(Cold Spring Harbor Press(2001))、《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley&Sons(1987-1997))、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-92、Kunkel(1988)Method.Enzymol.85：2763-6等记载的定点诱变法等方法进行制备。这种氨基酸发生了缺失、取代或添加等突变的突变体的构建，例如可使用通过Kunkel法、Gappedduplex法等公知的方法，使用利用了定点诱变法的突变引入用试剂盒，例如QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制)、GeneTailorTM Site-DirectedMutagenesis System(Invitrogen公司制)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：TaKaRa Bio公司制)等进行。
此外，作为在蛋白质的氨基酸序列中，在保持其活性的同时导入1个或多个氨基酸的缺失、取代、或添加的方法，除上述定点诱变之外，还可例举用突变源处理基因的方法、以及使基因选择性断裂将选择的核苷酸除去、取代或添加后进行连接的方法。
本发明的核酸中含有的碱基序列，优选为编码由序列号2表示的氨基酸序列中1～10个氨基酸发生缺失、取代或添加后的氨基酸序列组成、且具有GPAT活性的蛋白质的碱基序列。
此外，本发明的核酸中含有的碱基序列中，也包括编码由序列号2中1～10个氨基酸发生缺失、取代或添加后的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
本发明的蛋白质中氨基酸的突变或修饰的数量、或者突变或修饰的位点，只要保持GPAT活性、或本发明的可形成GPAT的脂肪酸组成的活性，没有特别限定。
本发明的GPAT活性、或本发明的可形成GPAT的脂肪酸组成的活性，可用公知的方法测定。例如可参照以下文献：Biochem.J.，355，315-322，2001。
例如本发明的“GPAT活性”可按以下方法测定，从使本发明的GPAT表达的酵母中，通过J.Bacteriology，173，2026-2034(1991)记载的方法等制备微粒体组分。接着在反应液0.44mM甘油-3-磷酸、0.36mM酰基-CoA、0.5mM DTT、1mg/ml BSA、2mM MgCl2、50mMTris-HCl(pH7.5)中添加上述微粒体组分，在28℃下反应适当时间，添加氯仿∶甲醇终止反应后，进行脂质的提取，将获得的脂质通过薄层色谱法等进行分离，可对生成的溶血磷脂酸的量进行定量。
此外，本发明的“可形成GPAT的脂肪酸组成的活性”，例如可按照以下方法测定。在通过本发明的脂肪酸组合物的制造方法获得的冷冻干燥菌体中，添加以适当比率调整的氯仿∶甲醇并搅拌后，加热处理适当时间。进一步通过离心分离来分离菌体，回收溶剂，这样重复数次。然后使用适当的方法使脂质干燥固化后，添加氯仿等溶剂溶解脂质。将该试样分取适量，利用盐酸甲醇法将菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷后，用气相色谱法进行分析。
(b)碱基序列，其与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。
本发明的核酸中含有的碱基序列，包括与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。对于序列号4以及GPAT活性，如上所述。
上述碱基序列，用本领域技术人员公知的方法使用适当的片段构建探针，使用该探针通过菌落杂交法、噬菌斑杂交法、Southern印迹法等公知的杂交法，可从cDNA文库及基因组文库等中获得。
对于杂交法的详细操作步骤，可参照《Molecular Cloning，A Laboratory Manual 3rded.》(Cold Spring Harbor Press(2001)；特别是Section 6-7)、《Current Protocols inMolecular Biology》(John Wiley & Sons(1987-1997)；特别是Section6.3-6.4)、《DNACloning 1：Core Techniques，A Practical Approach 2nd ed.》(Oxford University(1995)；杂交条件特别是Section2.10)等。
杂交条件的强度，主要由杂交条件、更优选由杂交条件及洗涤条件决定。在本说明书中“严格条件”包括中度或高度严格条件。
具体来说，作为中度严格条件，例如杂交条件，可例举1×SSC～6×SSC、42℃～55℃的条件，更优选1×SSC～3×SSC、45℃～50℃的条件，最优选2×SSC、50℃的条件。杂交溶液中例如含有约50％甲酰胺时，采用比上述温度低5至15℃的温度。作为洗涤条件，可例举0.5×SSC～6×SSC、40℃～60℃。在杂交及洗涤时，通常可加入0.05％～0.2％SDS、优选约0.1％SDS。
作为高度严格(高严格)的条件，包括在比中度严格条件高的温度及/或低的盐浓度下的杂交及/或洗涤。例如杂交条件，可例举0.1×SSC～2×SSC、55℃～65℃的条件，更优选0.1×SSC～1×SSC、60℃～65℃的条件，最优选0.2×SSC、63℃的条件。作为洗涤条件，可例举0.2×SSC～2×SSC、50℃～68℃，更优选0.2×SSC、60～65℃。
特别是作为本发明使用的杂交条件，例如可例举：在5×SSC、1％SDS、50mMTris-HCl(pH7.5)及50％甲酰胺中，在42℃的条件下，进行预杂交后添加探针，在42℃保温过夜形成杂交体，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃下进行3次20分钟的洗涤的条件。但并不限于此条件。
此外，还可使用探针内不使用放射性物质的市售的杂交试剂盒。具体可例举使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)、ECL direct labeling & detection system(Amersham公司制)的杂交等。
作为本发明含有的碱基序列，优选与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且编码具有GPAT活性的蛋白质的碱基序列。
(c)碱基序列，其由与序列号4所组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列组成、且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。
本发明的核酸中含有的碱基序列，包括由与序列号4表示的核酸序列有至少70％以上的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
优选可例举含有与序列号4表示的核酸序列有至少75％、更优选80％(例如85％以上、更优选90％以上、最优选95％、98％或99％)同一性的碱基序列的核酸，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
2个核酸序列的同一性％，可通过视觉检查、数学计算来决定，但优选使用计算机程序通过比较2个核酸的序列信息来决定。作为序列比较的计算机程序，例如可例举可利用美国国立医学图书馆网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html的BLASTN程序(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)：version 2.2.7、或WU-BLAST2.0计算法等。对于WU-BLAST2.0的标准默认参数的设定，可使用以下网站：http://blast.wustl.edu记载的参数值。
(d)碱基序列，其编码与序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。
本发明的核酸中含有的碱基序列，包括编码与由序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的核酸编码的蛋白质，只要与具有本发明的上述活性的蛋白质有同等功能，也可以是与GPAT2的氨基酸序列有同一性的蛋白质。
具体可例举与序列号2表示的氨基酸序列有75％以上、优选80％以上、更优选85％、更进一步优选90％以上(例如95％、进一步98％)以上同一性的氨基酸序列等。
本发明的核酸中含有的碱基序列，优选为编码与由序列号2组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。进一步优选为编码与由序列号2组成的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
2个氨基酸序列的同一性百分数，可通过视觉检查、数学计算来决定。此外，可使用计算机程序来决定同一性百分数。作为这种计算机程序，例如可例举BLAST、FASTA(Altschul等、J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))、及ClustalW等。特别是BLAST程序的同一性检索的各种条件(参数)，已由Altschul等(Nucl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)作了记载，所以可从美国国立生物技术信息中心(NCBI)、日本DNA数据库(DDBJ)的网站公开获得(BLAST指南、Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda，MD 20894；Altschul等)。此外，也可使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX)、DINASIS Pro(日立软件)、Vector NTI(Infomax)等程序来决定。
使多个氨基酸序列并列的特定的比对图，因为也可以显示序列中特定的短区域的匹配，所以即使使用的序列的全长序列间没有显著性的关系，在这种区域，也可检测出特定的序列同一性非常高的区域。并且，BLAST算法可使用BLOSUM62氨基酸打分矩阵，作为选择参数，还可使用以下：(A)包括将具有低组成复杂性的查询序列的片段(由Wootton及Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry，1993)决定；也可参照Wootton及Federhen，1996“序列数据库组成偏向性区域的分析(Analysis of compositionally biased regionsin sequence databases)”，Methods Enzymol.，266：544-71)、或短周期内部重复序列组成的片段(Claverie及States(Computers and Chemistry，1993)的XNU程序决定)遮蔽的过滤器，以及(B)用于报告相对于数据库序列的一致性的统计学显著性阈值、或根据E-score(Karlin及Altschul，1990)的统计学模型，仅偶然性发现的一致性期望概率，因某种一致性引起的统计学显著差异大于E-score阈值时，不报告该一致性。
(e)碱基序列，其与编码由序列号2表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。
本发明的核酸中含有的碱基序列，包括与编码由序列号2表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质及杂交条件如上所述。作为本发明的核酸中含有的碱基序列，可例举与编码由序列号2表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
此外，本发明的核酸还包括：由序列号4组成的碱基序列中1个或多个碱基发生缺失、取代或添加后的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。具体可使用含有以下碱基序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸，
(i)序列号4表示的碱基序列中1个或多个(优选1个或数个(例如1～540个、1～500个、1～400个、1～300个、1～200个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、更优选1～5个))碱基发生缺失后的碱基序列，
(ii)序列号4表示的碱基序列中1个或多个(优选1个或数个(例如1～540个、1～500个、1～400个、1～300个、1～200个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、更优选1～5个))碱基用其他碱基取代后的碱基序列，
(iii)序列号4表示的碱基序列中添加1个或多个(优选1个或数个(例如1～540个、1～500个、1～400个、1～300个、1～200个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、更优选1～5个))其他碱基后的碱基序列，
(iv)将上述(i)～(iii)组合后的碱基序列。
作为本发明的核酸的优选形态，也包括含有以下(a)～(c)中任一项所述的碱基序列的片段的核酸，
(a)序列号4表示的碱基序列，
(b)编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，
(c)序列号1表示的碱基序列。
对于(a)序列号4表示的碱基序列、(b)编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列、(c)序列号1表示的碱基序列，如表1所述。上述序列的片段，包括上述碱基序列中含有的ORF、CDS、具有生物学活性的区域、作为以下记载的引物使用的区域、可作为探针的区域，可来自天然，也可由人工制作。
本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白质
本发明的蛋白质，包括由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质及具有与上述蛋白质同等功能的蛋白质，可来自天然，也可由人工制作。对于由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质，如上所述。“具有同等功能的蛋白质”，如上述“编码本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶的核酸”项目中所述，是指具有「本发明的上述活性」的蛋白质。
在本发明中，作为与由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质，可例举以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，
(a)蛋白质，其由序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或添加后的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性，
(b)蛋白质，其是由与序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质，且具有本发明的上述活性。
其中，对于序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或添加后的氨基酸序列、或与序列号2组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列，如上述“编码本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶的核酸”项目中所述。此外，上述“具有本发明的上述活性的蛋白质”，是由含有序列号4的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体，或序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失或添加等经过多种修饰发生突变的蛋白质、或氨基酸侧链等被修饰的修饰蛋白质、与其他蛋白质融合的蛋白质，且是具有GPAT活性的蛋白质，及/或具有可形成本发明的GPAT的脂肪酸组成活性的蛋白质。
此外，本发明的蛋白质，也可是人工制作的蛋白质，此时可通过Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司制、Protein TechnologyInstruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所(島津製作所)制等的肽合成仪进行化学合成。
GPAT的核酸的克隆
本发明的GPAT的核酸，例如可通过使用适当的探针从cDNA文库中筛选，进行克隆。此外，可通过用适当的引物通过PCR反应进行扩增并和适当的载体连接进行克隆。并且还可亚克隆到其他载体上。
例如可使用pBlue-ScriptTM SK(+)(Stratagene)、pGEM-T(Promega)、pAmp(TM：Gibco-BRL)、p-Direct(Clontech)、pCR2.1-TOPO(Invitrogene)等市售的质粒载体。此外，通过PCR反应进行扩增时，引物可使用上述序列号1等表示的碱基序列的任意部分。例如对于序列号1，可使用
作为上游侧用引物：E-1：5’-CTGACTACCAAAACCAGCTGGACTTC-3’(序列号6)，
作为下游侧用引物：E-2：5’-GGCAATTTCATCCAAGTTGTCCTCC-3’(序列号7)等。
接着在由M.alpina菌体制备的cDNA中，使上述引物及碱基序列聚合酶等作用进行PCR反应。上述方法，根据《Molecular Cloning，A Laboratory Manual 3rd ed.》(Cold SpringHarbor Press(2001)”等，本领域技术人员可容易地实施。作为本发明的PCR反应条件，例如可例举以下条件：
变性温度：90～95℃
退火温度：40～60℃
延伸温度：60～75℃
循环数：10次以上
将获得的PCR产物进行纯化时，可使用公知的方法。例如有使用GENECLEAN(Funakoshi)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT(GE Healthcare Bio-Sciences)等试剂盒的方法、使用DEAE-纤维素滤纸的方法、使用透析管的方法等。使用琼脂糖凝胶时，进行琼脂糖凝胶电泳，将碱基序列片段从琼脂糖凝胶中切出，可通过GENECLEAN(Funakoshi)、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、Freeze & Squeeze法等进行纯化。
已克隆的核酸的碱基序列，用碱基序列测序仪来确定碱基序列。
GPAT表达用载体构建及转化体的制作
本发明还提供含有编码本发明的GPAT2的核酸的重组载体。本发明还进一步提供被上述重组载体转化的转化体。
这种重组载体及转化体可通过以下方法获得。即：将含有编码本发明GPAT的核酸的质粒用限制性内切酶进行酶切。作为使用的限制性内切酶，例如可例举EcoRI、KpnI、BamHI及SalI等，但不限于这些。此外，也可通过T4聚合酶处理进行末端平滑化。酶切后的碱基序列片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。通过用公知的方法将该碱基序列片段重组到表达用载体内，可获得GPAT表达用载体。将该表达载体导入宿主内制作转化体，供给目的蛋白质的表达。
此时，表达载体及宿主，只要可使目的蛋白质表达，没有特别限定，例如作为宿主，可例举真菌、细菌、植物、动物或其细胞等。作为真菌，可例举脂质生产菌M.alpina等丝状菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母等。此外，作为细菌，可例举大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。进而作为植物，可例举油菜子、大豆、棉花、红花、亚麻等油料植物等。
作为脂质生产菌，例如可使用MYCOTAXON，Vol.XLIV，NO.2，pp.257-265(1992)所记载的菌株，具体来说属于被孢霉属(Mortierella)的微生物，例如可例举长孢被孢霉(Mortierella elongate)IFO8570、Mortierella exigua IFO8571、Mortierellahygrophila IFO5941、高山被孢霉(Mortierella alpine)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等属于被孢霉亚属(subgenus Mortierella)的微生物，或者深黄被孢霉(Mortierella isabellina)CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、Mortierella nana IFO8190、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、葡酒色被孢霉(Mortierella vinacea)CBS236.82等属于Micromucor亚属(subgenus Micromucor)的微生物等。特别优选高山被孢霉(Mortierella alpina)。
将真菌类作为宿主使用时，优选本发明的核酸可在宿主中自主复制，或者是可插入该菌的染色体上的结构。与此同时，优选为含有启动子、终止子的组成。使用M.alpina作为宿主时，作为表达载体，例如可例举pD4、pDuraSC、pDura5等。作为启动子，只要能够在宿主中表达，可使用任何启动子，例如可使用histonH4.1基因启动子、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子、TEF(翻译延伸因子)基因启动子等来自M.alpina的启动子。
作为向M.alpina等丝状菌内导入重组载体的方法，例如可例举电穿孔法、原生质球法、粒子轰击法(particle delivery)以及向核内直接显微注射DNA等。使用营养缺陷型的宿主株时，通过选择在缺少其营养的选择培养基上生长繁殖的菌株，可获得转化体。此外，转化时使用抗药性标记基因时，在含有该药剂的选择性培养基上进行培养，可获得显示抗药性的细胞菌落。
使用酵母作为宿主时，作为表达载体，例如可例举pYE22m等。此外，也可使用pYES(Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等市售的酵母表达用载体。此外，作为适合于本发明的宿主，可例举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EH13-15株(trp1，MATα)等，但并不限于这些。作为启动子，例如可使用GAPDH启动子、gal1启动子、gal10启动子等来自酵母的启动子。
作为向酵母内导入重组载体的方法，例如可例举乙酸锂法、电穿孔法、原生质球法、葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、脂质体中的多核苷酸(单数或复数)的包裹、以及在核内直接显微注射DNA等。
使用大肠杆菌等细菌作为宿主时，作为表达载体，例如可例举Pharmacia公司的pGEX、pUC18等。作为启动子，例如可使用trp启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子。作为向细菌内导入重组载体的方法，例如可使用电穿孔法、氯化钙法。
本发明的脂肪酸组合物的制造方法
本发明提供从上述转化体中制造脂肪酸组合物的方法。即：培养上述转化体，从获得的培养物中制造脂肪酸组合物的方法。具体可用以下方法制造。但是，对于本制造方法来说，并不限于该方法，可采用通常公知的其他方法进行。
用于培养使GPAT表达的生物的培养基，只要是具有适当的pH及渗透压，含有各宿主增殖所必需的营养素、微量成分、血清、抗生素等生物材料的培养液(培养基)，可使用任意的培养液。例如转化酵母使GPAT表达时，可使用SC-Trp培养基、YPD培养基、YPD5培养基等，但并不限于这些。作为具体的培养基的组成，例示SC-Trp培养基：每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)1.3g。
培养条件，只要是适合宿主增殖、且适于生成的酶保持稳定的条件，可以为任意的条件，具体可调节厌氧度、培养时间、温度、湿度、静置培养或振荡培养等各种条件。培养方法，可以为同一条件下的培养(1段培养)，也可以为使用2个以上不同培养条件即2段培养或3段培养，进行大量培养时，优选培养效率良好的2段培养等。
以下，作为本发明的脂肪酸组合物的具体制造方法，以使用酵母作为宿主进行2段培养为例进行说明。即：作为预培养，将上述获得的菌落接种到如上述SC-Trp培养基等中，在30℃下振荡培养2天。然后，作为本培养，在YPD5(2％酵母膏、1％多聚蛋白胨、5％葡萄糖)培养基10ml中添加预培养液500μl，在30℃下振荡培养2天。
本发明的脂肪酸组合物
本发明还提供在本发明的GPAT2已表达的细胞中的1种或1种以上脂肪酸的集合体脂肪酸组合物。脂肪酸可以是游离脂肪酸，也可以是三甘油酯、磷脂质等。特别是，本发明的脂肪酸组合物的特征在于，在其脂肪酸组成中，以下
i)油酸含量
ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率
iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率，以及
iv)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率中的至少一项以上比培养未用本发明的重组载体转化的宿主而获得的培养物的上述比率高。在此，“未用本发明的重组载体转化的宿主”是指，例如使用未整合本说明书中的“编码本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶的核酸”项目中所记载的核酸的载体(空载体)转化的宿主。
作为本发明脂肪酸组合物中含有的脂肪酸，是指长链烃的链状或分支状的单羧酸，例如可例举肉豆蔻酸(myristic acid)(十四烷酸)(14:0)、肉豆蔻烯酸(myristoleic acid)(十四碳烯酸)(14:1)、棕榈酸(十六烷酸)(16:0)、棕榈油酸(9-十六碳烯酸)(16:1)、硬脂酸(十八烷酸)(18:0)、油酸(顺式-9-十八碳烯酸)(18:1(9))、异油酸(11-十八碳烯酸)(18:1(11))、亚油酸(顺式，顺式-9，12十八碳二烯酸)(18:2(9，12))、α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)(18:3(9，12，15))、γ-亚麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)(18:3(6，9，12))、亚麻油酸(Stearidonic acid)(6，9，12，15-十八碳四烯酸)(18:4(6，9，12，15))、花生酸(二十烷酸)(20:0)、(8，11-二十碳二烯酸)(20:2(8，11))、Mead酸(5，8，11-二十碳三烯酸)(20:3(5，8，11))、二高-γ-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)(20:3(8，11，14))、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)(20:4(5，8，11，14))、二十碳四烯酸(5，11，14，17-二十碳四烯酸)(20:4(5，11，14，17)、二十碳五烯酸(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)(20:5(5，8，11，14，17))、山萮酸(二十二烷酸)(22:0)、(7，10，13，16-二十二碳四烯酸)(22:4(7，10，13，16))、(4，7，13，16，19-二十二碳五烯酸)(22:5(4，7，13，16，19))、(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)(22:5(4，7，10，13，16))、(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)(22:6(4，7，10，13，16，19))、木质素酸(二十四烷酸)(24:0)、神经酸(顺式-15-二十四碳烯酸)(24:1)、蜡酸(二十六烷酸)(26:0)等，但并不限于这些。此外，上述物质名称是采用IUPAC生物化学命名法定义的通用名称，括号内记载了系统名称以及表示碳原子数量和双键位置的数值。
本发明的脂肪酸组合物，只要是上述脂肪酸中的1种或1种以上的脂肪酸的组合，可以是由任意数量、任意种类的脂肪酸组成的组合物。
为了证明已获得了这种本发明的脂肪酸组合物，即证明本发明的GPAT2已表达，可使用公知的通常的方法进行。例如用酵母表达GPAT时，可通过脂肪酸组成的变化来确认。即：在通过上述本发明的脂肪酸组合物的制造方法获得的冷冻干燥菌体中，添加以适当比率调整的氯仿：甲醇并搅拌后，加热处理适当时间，进而通过离心分离将菌体分离，回收溶剂，这样重复数次。然后使用适当的方法使脂质干燥固化，添加氯仿等溶剂使脂质溶解。将该试样分取适当量，通过盐酸甲醇法使菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷，用气相色谱法进行分析。
其结果，在获得了具有上述脂肪酸组成的脂肪酸组合物时，可判断获得了本发明的脂肪酸组合物。此外，因为本发明的GPAT，与公知的GPAT脂肪酸组合物的脂肪酸组成在脂肪酸组成上不同，由此表明本发明的GPAT与公知的GPAT的底物特异性不同。
含有本发明的脂肪酸组合物的食品等
此外，本发明提供含有上述脂肪酸组合物的食品。本发明的脂肪酸组合物，根据通常方法，例如可利用于含有油脂的食品、工业原料(化妆料、医药(例如皮肤外用药)、肥皂等的原料)的制造等用途中。作为化妆料(组合物)或医药(组合物)的剂型，可例举溶液状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型，但并不限于这些。此外，作为食品的形态，可例举胶囊等医药制剂的形态，或在蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类、乳化剂、香料等中配合了本发明的脂肪酸组合物的自然流食、半消化状态营养食品、以及成分营养食品、保健饮料、经肠营养剂等加工形态。
进而，作为本发明的食品例，可例举营养辅助食品、保健食品、功能性食品、幼儿用食品、婴儿用配方乳、早产儿用配方乳、老人用食品等，但不限于这些。在本说明书中，食品是固体、流体、及液体及其混合物，是可摄取食用的物质的总称。
营养辅助食品是指强化了特定营养成分的食品，保健食品是指被认为是健康的或对健康有益的食品，包括营养辅助食品、天然食品、减肥食品等。功能性食品是指用来补充发挥身体的调节功能的营养成分的食品，与特定保健用途食品含义相同。幼儿用食品是指供给约6岁以下的儿童用的食品，老人用食品是指处理成与无处理的食品相比，容易消化吸收的食品。婴儿用配方乳是指供给大约1岁以下的儿童用的配方乳。早产儿用配方乳是指供给早产儿出生后到约6个月为止所用的配方乳。
作为这些食品，可例举肉、鱼、果仁等天然食品(用油脂处理过的食品)；中华料理、拉面、汤等制作时加入油脂的食品；天麸罗、油炸食品、油炸豆腐、炒饭、炸面圈、油炸糖点心等用油脂作热介质的食品；黄油、人造黄油、蛋黄酱、调味料、巧克力、方便面、奶糖、饼干、曲奇、蛋糕、冰淇淋等油脂食品或加工时加入油脂的加工食品；(烤)年糕片、硬饼干、豆沙面包等加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等。但是，本发明的食品并不限于含油脂的食品，例如可例举面包、面条类、米饭、点心类(糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、日式点心)、豆腐及其加工品等农产食品；清酒、药用酒、甜料酒、食用醋、酱油、黄酱等发酵食品；酸奶、火腿、培根、香肠等畜产食品；鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品；果汁饮料、清凉饮料、运动饮料、酒精饮料、茶等。
使用编码本发明的GPAT的核酸或GPAT蛋白质的菌株的评价·选择方法
本发明还提供使用编码本发明的GPAT的核酸或GPAT蛋白质，进行评价、选择脂质生产菌的方法。具体如下所示。
(1)评价方法
作为本发明的一个实施方式，可例举使用编码本发明的GPAT的核酸或GPAT蛋白质，进行评价脂质生产菌的方法。作为本发明的上述评价方法，首先例举使用根据本发明的碱基序列设计的引物或探针，对作为被测菌株的脂质生产菌株的本发明的上述活性进行评价的方法。这种评价方法的通常方法是公知的，例如在国际专利申请文本WO01/040514号、日本特开平8-205900号公报等中均有记载。以下对该评价方法进行简单说明。
首先制备被测菌株的基因组。制备方法可使用Hereford法、乙酸钾法等任何公知的方法(例如参照Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p130(1990))。
根据本发明的碱基序列，优选根据序列号4设计引物或探针。上述引物或探针可使用本发明的碱基序列的任意部分，并且可使用公知的方法进行其设计。作为引物使用的多核苷酸的碱基数，通常为10个碱基以上，优选为15～25个碱基。此外，夹在两引物间的碱基数通常以300～2000个碱基为宜。
使用上述构建的引物或探针，检测上述被测菌体的基因组中是否存在本发明的碱基序列的特异性序列。本发明的碱基序列的特异性序列的检测可采用公知的方法进行。例如，用含有本发明的碱基序列的特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物，用含有该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为另一个引物，例如通过PCR法等扩增被测菌株的核酸，可以测定扩增产物的有无、扩增产物的分子量大小等。
适合本发明方法的PCR法的反应条件，没有特别限定，例如可例举以下条件，
变性温度：90～95℃
退火温度：40～60℃
延伸温度：60～75℃
循环数：10次以上
等条件。将获得的反应生成物，通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，可以测定扩增产物的分子量。因此通过确认扩增产物的分子量是否是含有相当于本发明的碱基序列的特异区域的核酸分子的大小，可以预测或评价被测菌株的本发明的上述活性。此外，通过用上述方法等分析上述扩增产物的碱基序列，可以进一步更正确地预测或评价本发明的上述活性。此外，本发明的上述活性的评价方法如上所述。
此外，作为本发明的上述评价方法，通过培养被测菌株，测定序列号4等本发明的碱基序列编码的GPAT的表达量，可以评价被测菌株的本发明的上述活性。此外，GPAT的表达量，可以通过在适当的条件下培养被测菌株，对GPAT的mRNA或蛋白质定量来测定。mRNA或蛋白质的定量，可使用公知的方法进行。mRNA的定量，例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons 1994-2003)。此外，作为上述活性的评价方法，可例举测定本发明的GPAT产生的脂肪酸组合物的组成的方法。脂肪酸组合物的组成的测定方法如上所述。
(2)选择方法
作为本发明的其他实施方式，可例举使用编码本发明的GPAT的核酸或GPAT蛋白质进行选择脂质生产菌的方法。作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，测定序列号4等本发明的碱基序列编码的GPAT的表达量，选择目的表达量的菌株，可以选择出具有期望活性的菌株。此外，设定作为标准的菌株，分别培养该标准菌株和被测菌株，测定各菌株的上述表达量，比较标准菌株和被测菌株的表达量，也可以选择出期望的菌株。具体来说，例如将标准菌株和被测菌株在适当的条件下培养，测定各菌株的表达量，通过选择与标准菌株相比较，被测菌株为高表达、或低表达的被测菌株，可以选择具有期望活性的菌株。对于期望的活性，如上所述可例举测定GPAT的表达量及GPAT产生的脂肪酸组合物的组成的方法。
此外，作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，选择本发明的上述活性高或低的菌株，可以选择具有期望活性的被测菌株。对于期望活性，如上所述，可例举测定GPAT的表达量及GPAT产生的脂肪酸组合物的组成的方法。
作为被测菌株或标准菌株，例如可使用导入上述本发明的载体的菌株、上述本发明的核酸的表达受到抑制的菌株、实施突变处理的菌株、发生自然突变的菌株等，但并不限于这些。此外，本发明的GPAT活性及可形成GPAT的脂肪酸组合物的活性，例如可通过本说明书中的“编码本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶的核酸”、“本发明的脂肪酸组合物”项目中记载的方法进行测定。作为突变处理，例如可例举紫外线照射、放射线照射等物理方法，EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等试剂处理的化学方法等(如参照大嶋泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等)(日语原名：大嶋泰治编著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p 67-75、学会出版センタ一)。但不限于这些。
此外，作为本发明的标准菌株、被测菌株使用的菌株，可例举上述脂质生产菌或酵母等，但并不限于这些。具体来说，标准菌株、被测菌株，可将属于不同属、种的任意菌株组合使用，被测菌株也可同时使用1个或1个以上的菌株。
实施例
以下根据实施例更加具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
(1)EST分析
将M.alpina 1S-4株接种到100ml的培养基(1.8％葡萄糖、1％酵母膏、pH6.0)中，在28℃预培养3天。在10L培养槽(Able Co.，东京)中加入5L培养基(1.8％葡萄糖、1％大豆粉、0.1％橄榄油、0.01％Adecanol、0.3％KH2PO4、0.1％Na2SO4、0.05％CaCl2·2H2O、0.05％MgCl2·6H2O、pH6.0)，接种全部预培养物，在300rpm、1vvm、26℃的条件下通气搅拌培养8天。在培养的第1、2、及3天分别添加相当于2％、2％、及1.5％的葡萄糖。在培养的第1、2、3、6、及8天的各阶段回收菌体，用盐酸胍/氯化铯法制备总RNA。
使用Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(TaKaRa Bio)，从总RNA中纯化poly(a)+RNA。使用ZAP-cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE)，构建各阶段的cDNA文库，进行cDNA的5’端一步法序列分析(8000克隆×5步)。将获得的序列进行聚类。其结果，获得约5000序列。
(2)GPAT基因同源物的检索
将通过EST分析获得的碱基序列，相对于在GENEBANK注册的氨基酸序列使用同源性检索程序BLASTX进行检索，提取出GPAT基因的同源物。其结果发现1个GPAT同源物的序列(序列号5)。
在上述检索中，同一性最高的蛋白质是来自酿酒酵母S.cerevisiae的甘油-3-磷酸酰基转移酶的Sct1p(由YBL011w编码的蛋白质)。
对于M.alpina的GPAT同源物，早已在美国专利申请公开第US2006/0094091号说明书中记载，将该已知的来自M.alpina的序列(称为GPAT1)和上述获得的序列进行比较，发现与序列号5没有显著同一性。因此，认为序列号5和M.alpina的公知的GPAT是其它同源物的EST，将该GPAT同源物称为GPAT2。
实施例2
(1)GPAT同源物的克隆
因为序列号5中不存在认为是编码GPAT同源物的CDS，因此为了克隆编码这些基因的全长的cDNA，根据序列号5的序列构建以下引物。
根据序列号5设计的引物：
引物E-1：CTGACTACCAAAACCAGCTGGACTTC(序列号6)
引物E-2：GGCAATTTCATCCAAGTTGTCCTCC(序列号7)
使用该引物对，将含有构成序列号5的EST的第8天的cDNA文库作为模板，使用ExTaq(TaKaRa Bio)进行PCR反应。将获得的DNA片段用TOPO-TA cloning Kit(INVITROGENCORPORATION)进行TA-克隆，确定插入部分的碱基序列。
其结果，确认含有序列号5的第5位到第243位的碱基序列的DNA片段已被克隆，将该质粒作为pCR-E-P。接着，将该质粒作为模板，使用上述引物进行PCR反应。反应中虽然使用了ExTaq(TaKaRa Bio)，但用PCR标记用混合物(Roche Diagnostics公司)代替添附的dNTP混合物，将扩增的DNA用地高辛(DIG)标记，构建用于筛选cDNA文库的探针。使用该探针，对用EST分析获得的构成序列号5的EST的cDNA文库进行筛选。
杂交条件如下所示。
缓冲液：5×SSC、1％SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5)、50％甲酰胺；
温度：42℃(一夜)；
洗涤：在0.2×SSC、0.1％SDS溶液中(65℃)，20分钟×3次；
检测，使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)进行。从经过筛选获得的噬菌体克隆中，通过体内切割，切出质粒，获得质粒DNA。
筛选含有序列号5的cDNA，获得的克隆的插入碱基序列用序列号1表示。序列号1中含有从第113位到第1891位的1779bp所组成的CDS，所以认为获得了编码GPAT同源物(GPAT2)全长的序列。由该基因编码的蛋白质的推定氨基酸序列用序列号2表示。将含有序列号1的质粒作为pB-GPAT2。
另一方面，为了克隆来自M.alpina 1S-4株的GPAT1，根据美国专利申请公开第2006/0094091号说明书的序列号1所示的GPAT同源物的ORF序列，构建以下引物。
引物GPAT1-1ggatccatggcccttcagatctacga(序列号8)
引物GPAT1-2gtcgacctaaatgtcttttgacttggc(序列号9)
上述引物的下划线部分，是附加的限制性内切酶识别位点。
使用上述引物，以cDNA文库为模板，通过KOD-Plus-(东洋纺织)进行PCR。将扩增的片段亚克隆到pCR4Blunt-TOPO(Invitrogen)上，确定碱基序列，将认为是该基因的正确碱基序列的克隆作为pCR4-GPAT1。将这样被克隆的来自M.alpina 1S-4株的GPAT1的cDNA的碱基序列用序列号10表示，而且将被该cDNA编码的GPAT1的推定氨基酸序列用序列号11表示。
(2)序列分析
将上述获得的来自M.alpina的GPAT同源物(GPAT2)的cDNA序列，相对于在GENEBANK注册的氨基酸序列，使用BLASTX进行同源性分析。其结果是，相对于该同源物的序列E-value最低、即同一性最高的氨基酸序列是来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶样的推定蛋白质的序列(GB注册号No.EAA62242)。功能明确的蛋白质中同一性最高的是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甘油3-磷酸酰基转移酶Sct1p(GB注册号No.CAC85390)。将该同源物序列的ORF和上述同一性高的序列相关的碱基序列的同一性、以及氨基酸序列的同一性用clustalW计算。其结果，ORF的碱基序列的同一性分别为36.9％和36.6％，氨基酸序列的同一性分别为17.0％和15.0％。
克隆的序列号1的碱基序列及其推定氨基酸序列的序列号2，与已知的碱基序列及氨基酸序列比较，同一性并不显著高，认为是来自M.alpina的新型GPAT。
另一方面，将上述克隆化的来自M.alpina 1S-4株的GPAT1(cDNA序列用序列号10表示，其推定氨基酸序列用序列号11表示)和来自M.alpina(ATCC#16266)的GPAT1(美国专利申请公开第2006/0094091号说明书)进行比较，确认碱基序列同一性为90.4％、氨基酸序列同一性为97.9％。
实施例3
酵母表达载体的构建
为了使GPAT2在酵母中表达，如下所述构建酵母表达载体。即：将质粒pB-GPAT2用限制性内切酶KpnI酶切后，用限制性内切酶SacI部分酶切获得约2kb的DNA片段，将该DNA片段插入酵母用表达载体pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.，59，1221-1228，1995)的SacI-KpnI位点，构建质粒pYE-MAGPAT2。
另一方面，为了使GPAT1在酵母中表达，如下所述构建酵母表达载体。将质粒pCR4-GPAT1用限制性内切酶BamH I和Sal I酶切获得约2.2kb的DNA片段，将该DNA片段插入酵母用表达载体pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.，59，1221-1228，1995)的BamH I-Sal I位点，构建质粒pYE-MAGPAT1。
实施例4
酵母的转化
用质粒pYE22m、pYE-MAGPAT1或pYE-MAGPAT2，通过乙酸锂法转化入酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EH13-15株(trp1，MATα)(Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，515-520，1989)中。转化株选择在SC-Trp(每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogenbase w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)为1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)上生长繁殖的菌株。
实施例5
酵母的培养
分别选择使用酵母表达载体的转化株中的任意2株(c-1株、c-2株、GPAT1-1株及GPAT1-2株、以及GPAT2-1株、GPAT2-2株)，在以下条件下培养。
即：作为预培养，从平板上取1白金耳酵母接种到SC-Trp培养基10ml中，在30℃下振荡培养2天。本培养是在YPD5(酵母膏2％、多聚蛋白胨1％、葡萄糖5％)培养基10ml中添加预培养液500μl，30℃下振荡培养2天。
实施例6
酵母的脂肪酸分析
通过离心分离酵母的培养液，回收菌体。用10ml灭菌水洗涤，通过离心分离再回收菌体，进行冷冻干燥。在冷冻干燥菌体中添加氯仿∶甲醇(2∶1)4ml，剧烈搅拌后，70℃下处理1小时。通过离心分离分离菌体，回收溶剂。在残留的菌体中再次添加氯仿∶甲醇(2∶1)4ml，同样回收溶剂。在离心浓缩仪中使脂质干燥固化后，添加2ml氯仿溶解脂质。从该试样中分取200μl，通过盐酸甲醇法使菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷，通过气相色谱法进行分析。
其结果如表2所示。
表2转化株的脂肪酸组成(宿主EH13-15)
比较导入来自M.alpina的2个GPAT同源物的酵母和对照酵母的脂肪酸组成。导入GPAT1的酵母的脂肪酸组成，棕榈酸的比例与对照株相比升高，而棕榈油酸的比例降低。此外，硬脂酸和油酸的比例与对照株为同等程度。因此，棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率、油酸含量相对于棕榈酸含量的比率、以及硬脂酸和油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率，均低于对照株。
另一方面，导入GPAT2的酵母中，油酸的比例与对照株相比升高10％以上。棕榈酸、棕榈油酸的比例与对照株相比均减少，而棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比例与对照株相比有一些升高。此外，导入GPAT2的酵母中油酸含量相对于棕榈酸含量的比率、以及硬脂酸和油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率，与对照株相比均升高。此外，导入GPAT2的酵母中碳原子数18的脂肪酸相对于碳原子数16的脂肪酸的比例升高，生成了更长链的脂肪酸。
以上结果表明，来自M.alpina的2个GPAT同源物，因为其底物酰基特异性不同，所以导入这些基因的酵母中各同源物的脂肪酸组成不同。并且表明，通过将上述同源物适时分开使用，能够育种目的脂肪酸组成的生物。
实施例7
花生四烯酸生产酵母中的表达分析
(1)花生四烯酸生产酵母的育种
为了育种花生四烯酸生产酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，构建以下质粒。
首先，将从M.alpina lS-4株中制备的cDNA作为模板，使用Δ12-f和Δ12-r、Δ6-f和Δ6-r、GLELO-f和GLELO-r或Δ5-f和Δ5-r的引物组合，使用ExTaq进行PCR，扩增M.alpina 1S-4株的Δ12脂肪酸去饱和酶基因、Δ6脂肪酸去饱和酶基因、GLELO脂肪酸链延长酶基因以及Δ5脂肪酸去饱和酶基因。
Δ12-f：TCTAGAatggcacctcccaacactattg(序列号12)
Δ12-r：AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC(序列号13)
Δ6-f：TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag(序列号14)
Δ6-r：AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG(序列号15)
GLELO-f：TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc(序列号16)
GLELO-r：GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(序列号17)
Δ5-f：TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc(序列号18)
Δ5-r：AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC(序列号19)
将这些通过TOPO-TA-cloning Kit进行克隆。确认碱基序列，将含有序列号20～23的碱基序列的克隆，分别作为质粒pCR-MAΔ12DS(含有序列号20的碱基序列)、pCR-MAΔ6DS(含有序列号21的碱基序列)、pCR-MAGLELO(含有序列号22的碱基序列)、pCR-MAΔ5DS(含有序列号23的碱基序列)。
另一方面，将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pURA34(日本特开2001-120276号公报)后获得的约1.2kb的DNA片段，插入用限制性内切酶EcoRI和SphI酶切载体pUC18后进行末端平滑化，通过自我连接作用获得的载体的HindIII位点，将载体的EcoRI位点侧为URA3的5’端的克隆作为pUC-URA3。并且，将用限制性内切酶SalI和XhoI酶切YEp13获得的约2.2kb的DNA片段插入载体pUC18的SalI位点，将载体的EcoRI侧为LUE2的5’端的克隆作为pUC-LEU2。
接着，将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pCR-MAΔ12DS并且进行末端平滑化后用限制性内切酶XbaI酶切获得的约1.2kbp的DNA片段，与用限制性内切酶SacI酶切载体pESC-URA(STRATAGENE)并且进行末端平滑化后，用限制性内切酶SpeI酶切后的约6.6kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-U-Δ12。将用限制性内切酶XbaI酶切质粒pCR-MAΔ6DS并且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切获得的约1.6kbp的DNA片段，与用限制性内切酶SalI酶切质粒pESC-U-Δ12并且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切后的约8kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-U-Δ12:Δ6。将其用限制性内切酶PvuII部分酶切获得的约4.2kb的片段插入pUC-URA3的SmaI位点，获得质粒pUC-URA-Δ12:Δ6。
此外，将用限制性内切酶XbaI和SacI酶切质粒pCR-MAGLELO获得的约0.95kbp的DNA片段，与用限制性内切酶XbaI和SacI酶切载体pESC-LEU(STRATAGENE)获得的约7.7kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-L-GLELO。将用限制性内切酶XbaI酶切质粒pCR-MAΔ5DS并且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切获得的约1.3kbp的DNA片段，与用限制性内切酶ApaI酶切质粒pESC-L-GLELO并且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切后获得的约8.7kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-L-GLELO:Δ5。将其用限制性内切酶PvuII酶切获得的约3.2kb片段插入pUC-LEU2的SmaI位点，获得质粒pUC-LEU-GLELO:Δ5。将S.cerevisiae YPH499株(STRATAGENE)用质粒pUC-URA-Δ12:Δ6和质粒pUC-LEU-GLELO:Δ5进行共转化。转化株选择在SC-Leu，Ura(每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g的混合物)为1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)上生长繁殖的菌株。将这样获得的菌株中的任意一株作为ARA3-1株。
(2)花生四烯酸生产酵母的转化株的获得与分析
将ARA3-1株用质粒pYE22m、pYE-MAGPAT1、pYE-MAGPAT2分别转化。转化株选择在SC-Trp、Leu、Ura(每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)为1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)上生长繁殖的菌株。从导入各质粒的菌株中分别选择任意4株。
将这些菌株在上述SC-Trp、Leu、Ura液体培养基10ml中30℃、培养1天，取其中1ml在SG-Trp、Leu、Ura(每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、半乳糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)为1.3g)液体培养基10ml中15℃、培养7天，进行菌体的脂肪酸分析。菌体的脂肪酸组成如表3所示，菌体内的油脂含有率如表4所示。
表3
菌体内脂肪酸含有率(％)
表4
DGLA和ARA在总脂肪酸中占有的比率(％)
在花生四烯酸生产酵母中使来自M.alpina的GPAT23表达时，与对照相比较，DGLA、花生四烯酸等PUFA的比率增高。并且，菌体内的脂肪酸含有率增高。
实施例8
M.alpina表达用载体的构建
作为M.alpina表达用载体，使用由GAPDH启动子使目的基因表达的pDuraSC和由组蛋白启动子使目的基因表达的pDuraMCS。
为了使GPAT2在M.alpina中表达，按以下所述构建载体。用限制性内切酶PstI酶切质粒pB-GPAT2，接着用限制性内切酶XhoI部分分解，从获得的DNA片段中切出约1.7kb的片段，插入载体pDuraSC或载体pDura5MCS的多克隆位点的PstI位点、XhoI位点，分别将这些作为质粒pDuraSC-GPAT2、质粒pDura5MCS-GPAT2。
M.alpina转化株的获得
使用这些质粒，利用M.alpina，将根据专利文献(WO2005/019437“脂质生产菌的育种方法”)中记载的方法诱导的尿嘧啶缺陷型株Δura-3作为宿主，利用粒子轰击法进行转化。选择转化株时，使用SC琼脂培养基(无氨基酸酵母氮源(不含硫酸胺)(Yeast Nitrogen Basew/o Amino Acids and Ammonium Sulfate](Difco)0.5％、硫酸铵0.17％、葡萄糖2％、腺嘌呤0.002％、酪氨酸0.003％、蛋氨酸0.0001％、精氨酸0.0002％、组氨酸0.0002％、赖氨酸0.0004％、色氨酸0.0004％、苏氨酸0.0005％、异亮氨酸0.0006％、亮氨酸0.0006％、苯丙氨酸0.0006％、琼脂2％)。
转化M.alpina的评价
将获得的转化株，接种到GY培养基(葡萄糖2％、酵母膏1％)4ml中，28℃下振荡培养3天或4天。通过过滤回收菌体，使用RNeasy plant kit(QIAGEN)提取RNA。通过SuperScriptFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)合成cDNA。为了确认导入的构建物中的各基因的表达、总的各基因的表达，用以下引物的组合进行RT-PCR。
○质粒pDuraSC-GPAT2导入株
从导入构建物中确认表达时使用的引物
MaGAPDHpfw：CACACCACACATTCAACATC(序列号24)
E2：GGCAATTTCATCCAAGTTGTCCTCC(序列号25)
确认总的GPAT2表达时使用的引物
E1：CTGACTACCAAAACCAGCTGGACTTC(序列号26)
E2
○质粒pDura5MCS-GPAT2导入株
从导入的构建物中确认表达时使用的引物
PD4P：CGCATCCCGCAAACACACAC(序列号27)和引物E2、
确认总的GPAT2的表达时使用的引物
引物E1和引物E2
根据上述RT-PCR的结果，作为各基因导入构建物中的表达及总表达高的菌株，从质粒pDuraSC-GPAT2导入株中筛选出Gp-GPAT2-30株，从质粒pDura5MCS-GPAT2导入株中筛选出Hp-GPAT2-9株。
将这些菌株接种于GY培养基4ml中，28℃、125rpm下振荡培养。培养第3天，添加20％葡萄糖400μl，并继续培养。或在培养的第6天将全部菌体过滤回收，进行冷冻干燥。取部分干燥菌体(约10-20mg左右)，通过盐酸甲醇法将菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷，用气相色谱法进行分析。菌体内的脂肪酸含有率和每单位培养基的花生四烯酸生产量总结于以下表5-6中。
表5
菌体内脂肪酸含有率(％)
表6
每单位培养基的花生四烯酸生产量(g/L)
由此可见，通过使GPAT2基因在M.alpina中进行高表达，菌体内的脂肪酸含有率升高，也可使每单位培养基的花生四烯酸的生产量增加。
序列表FREETEXT
序列号6：引物
序列号7：引物
序列号8：引物
序列号9：引物
序列号12：引物
序列号13：引物
序列号14：引物
序列号15：引物
序列号16：引物
序列号17：引物
序列号18：引物
序列号19：引物
序列号24：引物
序列号25：引物
序列号26：引物
序列号27：引物
序列表
(SEQUENCE LISTING)
<110>三得利株式会社(SUNTORY LIMITED.)
<120>甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)同源物及其应用
A glycerol-3-phosphate acyltransferase(GPAT)homolog and use thereof
<130>YCT1366
<150>JP 2007-160042
<151>2007-06-18
<160>27
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1942
<212>DNA
<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)
<220>
<221>CDS
<222>(113)..(1891)
<223>
<400>1
gcttccctcc acacttccct ttccttcaac accaaaccct atccgaaccc tctgtctcat 60
ttttctctct ctctccctat ctctctctct ctctatcctc acatatatcc tc atg gcc 118
Met Ala
1
aaa ctt cgg aag cgg acc tcc cag tca aag gag ggc gcc gct gac acc 166
Lys Leu Arg Lys Arg Thr Ser Gln Ser Lys Glu Gly Ala Ala Asp Thr
5 10 15
aac ggc aca agg cga gac agc gtc gat gac acg aac agc gtc ggc agc 214
Asn Gly Thr Arg Arg Asp Ser Val Asp Asp Thr Asn Ser Val Gly Ser
20 25 30
tac gat cca cgc gcc ctc tcc aac gat cca cca aag atg tac agg gcg 262
Tyr Asp Pro Arg Ala Leu Ser Asn Asp Pro Pro Lys Met Tyr Arg Ala
35 40 45 50
atc cgg ttc ttc ttc aag atg tgc ctg cac tcc ttc tat ggc cat gtg 310
Ile Arg Phe Phe Phe Lys Met Cys Leu His Ser Phe Tyr Gly His Val
55 60 65
gag gtc gag ggc acc gag aat att gca cca aac aac tac cct gct atc 358
Glu Val Glu Gly Thr Glu Asn Ile Ala Pro Asn Asn Tyr Pro Ala Ile
70 75 80
ctt gtt gcg aac cac agc aac agt ttg acg gat gcg att gcc att atg 406
Leu Val Ala Asn His Ser Asn Ser Leu Thr Asp Ala Ile Ala Ile Met
85 90 95
tcg act gtt cct ccc aag agc agg agc atg att agg atg acc gca aag 454
Ser Thr Val Pro Pro Lys Ser Arg Ser Met Ile Arg Met Thr Ala Lys
100 105 110
gac acg ttt tgg cat aag cca ggc gtc ttc aat tat gtc atc aaa aac 502
Asp Thr Phe Trp His Lys Pro Gly Val Phe Asn Tyr Val Ile Lys Asn
115 120 125 130
gct ggc act gtc ccg atc aaa aga cgc aag gat tat gag aac caa aag 550
Ala Gly Thr Val Pro Ile Lys Arg Arg Lys Asp Tyr Glu Asn Gln Lys
135 140 145
gtc gac aac act gac gcg atg ggt gca ttg atc gat acc ctt gga gca 598
Val Asp Asn Thr Asp Ala Met Gly Ala Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ala
150 155 160
gga agt tgt gta tgc atg ttc ccg gag ggc atc tcg cgc tat cac cca 646
Gly Ser Cys Val Cys Met Phe Pro Glu Gly Ile Ser Arg Tyr His Pro
165 170 175
caa ctt gct ccg ttc aag gcc ggt gtc gcc atg att gcc agc gat acg 694
Gln Leu Ala Pro Phe Lys Ala Gly Val Ala Met Ile Ala Ser Asp Thr
180 185 190
ctc tcc cgg ttt caa gac acg ccc gat ttt tct ctc acg ctc atg aca 742
Leu Ser Arg Phe Gln Asp Thr Pro Asp Phe Ser Leu Thr Leu Met Thr
195 200 205 210
gcg tcg atc aac tat ctt cac cgt gaa aag ttc cga tct gat gtt ctc 790
Ala Ser Ile Asn Tyr Leu His Arg Glu Lys Phe Arg Ser Asp Val Leu
215 220 225
gtc acg ttc cat gca ccc att gtg cta acc ccg caa caa gac tcg aag 838
Val Thr Phe His Ala Pro Ile Val Leu Thr Pro Gln Gln Asp Ser Lys
230 235 240
ctg ttt tcg act gac ctg gaa gtc aag aag gaa gcg atc cga aaa ctg 886
Leu Phe Ser Thr Asp Leu Glu Val Lys Lys Glu Ala Ile Arg Lys Leu
245 250 255
aca gag ttg ctc gag ggc acc gtc cga tca act cta ctg gat gcc gag 934
Thr Glu Leu Leu Glu Gly Thr Val Arg Ser Thr Leu Leu Asp Ala Glu
260 265 270
gac tgg caa aca gtc cga gtg ggt cat gtt gcc agg aag ctc tat gct 982
Asp Trp Gln Thr Val Arg Val Gly His Val Ala Arg Lys Leu Tyr Ala
275 280 285 290
ggc gat ctg gga act cgg att tcg ctg gga cag tac gtg cgt ttg acc 1030
Gly Asp Leu Gly Thr Arg Ile Ser Leu Gly Gln Tyr Val Arg Leu Thr
295 300 305
agg aag ttt gtc acg gcg ttc agt cag cac aag cag gag gag gag gca 1078
Arg Lys Phe Val Thr Ala Phe Ser Gln His Lys Gln Glu Glu Glu Ala
310 315 320
gcg gtc gat gac gag cgt tat ggt cag gag aag cac ggg ggc ggt gcc 1126
Ala Val Asp Asp Glu Arg Tyr Gly Gln Glu Lys His Gly Gly Gly Ala
325 330 335
gag agg aat ggt gat tct ttg gag atg agg cat cct gag cgc atg gat 1174
Glu Arg Asn Gly Asp Ser Leu Glu Met Arg His Pro Glu Arg Met Asp
340 345 350
aag gcg act aga aag aaa atc gac gag ctc gcc agg gat ttg gct gac 1222
Lys Ala Thr Arg Lys Lys Ile Asp Glu Leu Ala Arg Asp Leu Ala Asp
355 360 365 370
tac caa aac cag ctg gac ttc tat cac ctc aag gac tat cgt atc aag 1270
Tyr Gln Asn Gln Leu Asp Phe Tyr His Leu Lys Asp Tyr Arg Ile Lys
375 380 385
caa ggc aag cca agt gca aag att ctt atc gga cgt ctt ttc caa aga 1318
Gln Gly Lys Pro Ser Ala Lys Ile Leu Ile Gly Arg Leu Phe Gln Arg
390 395 400
ttc ttg ctt gct tgc ctt ttg tcg acc att tgc att cct gga ctg ttc 1366
Phe Leu Leu Ala Cys Leu Leu Ser Thr Ile Cys Ile Pro Gly Leu Phe
405 410 415
ctt tgg gca cct gtg ttt atc gcc gtg aag tac aaa gag agt cag ctt 1414
Leu Trp Ala Pro Val Phe Ile Ala Val Lys Tyr Lys Glu Ser Gln Leu
420 425 430
agg cgc aag gga ccc ttg gag gac aac ttg gat gaa att gcc cag tac 1462
Arg Arg Lys Gly Pro Leu Glu Asp Asn Leu Asp Glu Ile Ala Gln Tyr
435 440 445 450
aag ttg atg atc tcg act ttc ttc ttg ccg atc atc tgg ggg ttc tgg 1510
Lys Leu Met Ile Ser Thr Phe Phe Leu Pro Ile Ile Trp Gly Phe Trp
455 460 465
atc gta atg acc ttg cca att gcg ctc ttt agc gcg ccg ggc atc gtt 1558
Ile Val Met Thr Leu Pro Ile Ala Leu Phe Ser Ala Pro Gly Ile Val
470 475 480
gtt ctg atg tgg ctt acg atc cgc tgg ctt gag gac ttg atc cac aac 1606
Val Leu Met Trp Leu Thr Ile Arg Trp Leu Glu Asp Leu Ile His Asn
485 490 495
gcg aaa tcg atg ttg tcc ctt ttg cga ttg ctg ttt atg acg gag gat 1654
Ala Lys Ser Met Leu Ser Leu Leu Arg Leu Leu Phe Met Thr Glu Asp
500 505 510
acc atg tac tcg ttg aga gac tac cgt cag ggg ctg gcg cat cgt gtg 1702
Thr Met Tyr Ser Leu Arg Asp Tyr Arg Gln Gly Leu Ala His Arg Val
515 520 525 530
cac gat ttt gcg gtc gat cat ctg aag ttg cct gag gac cct gag gtt 1750
His Asp Phe Ala Val Asp His Leu Lys Leu Pro Glu Asp Pro Glu Val
535 540 545
ctg gtc aag gag aac aag acc aag aag gtc gac agt ggc tgg atg ggc 1798
Leu Val Lys Glu Asn Lys Thr Lys Lys Val Asp Ser Gly Trp Met Gly
550 555 560
aag ttg tcg ggc agc tac ttc tcg atc aag agg aga aga aga aag gac 1846
Lys Leu Ser Gly Ser Tyr Phe Ser Ile Lys Arg Arg Arg Arg Lys Asp
565 570 575
tgg aac gag gtt atg cga ttg cac gat gtt tct cac tat gac tga 1891
Trp Asn Glu Val Met Arg Leu His Asp Val Ser His Tyr Asp
580 585 590
agctgagatc gtccttgaat aaaagcagat aacgcgtgga gtaactgagg g 1942
<210>2
<211>592
<212>PRT
<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)
<400>2
Met Ala Lys Leu Arg Lys Arg Thr Ser Gln Ser Lys Glu Gly Ala Ala
1 5 10 15
Asp Thr Asn Gly Thr Arg Arg Asp Ser Val Asp Asp Thr Asn Ser Val
20 25 30
Gly Ser Tyr Asp Pro Arg Ala Leu Ser Asn Asp Pro Pro Lys Met Tyr
35 40 45
Arg Ala Ile Arg Phe Phe Phe Lys Met Cys Leu His Ser Phe Tyr Gly
50 55 60
His Val Glu Val Glu Gly Thr Glu Asn Ile Ala Pro Asn Asn Tyr Pro
65 70 75 80
Ala Ile Leu Val Ala Asn His Ser Asn Ser Leu Thr Asp Ala Ile Ala
85 90 95
Ile Met Ser Thr Val Pro Pro Lys Ser Arg Ser Met Ile Arg Met Thr
100 105 110
Ala Lys Asp Thr Phe Trp His Lys Pro Gly Val Phe Asn Tyr Val Ile
115 120 125
Lys Asn Ala Gly Thr Val Pro Ile Lys Arg Arg Lys Asp Tyr Glu Asn
130 135 140
Gln Lys Val Asp Asn Thr Asp Ala Met Gly Ala Leu Ile Asp Thr Leu
145 150 155 160
Gly Ala Gly Ser Cys Val Cys Met Phe Pro Glu Gly Ile Ser Arg Tyr
165 170 175
His Pro Gln Leu Ala Pro Phe Lys Ala Gly Val Ala Met Ile Ala Ser
180 185 190
Asp Thr Leu Ser Arg Phe Gln Asp Thr Pro Asp Phe Ser Leu Thr Leu
195 200 205
Met Thr Ala Ser Ile Asn Tyr Leu His Arg Glu Lys Phe Arg Ser Asp
210 215 220
Val Leu Val Thr Phe His Ala Pro Ile Val Leu Thr Pro Gln Gln Asp
225 230 235 240
Ser Lys Leu Phe Ser Thr Asp Leu Glu Val Lys Lys Glu Ala Ile Arg
245 250 255
Lys Leu Thr Glu Leu Leu Glu Gly Thr Val Arg Ser Thr Leu Leu Asp
260 265 270
Ala Glu Asp Trp Gln Thr Val Arg Val Gly His Val Ala Arg Lys Leu
275 280 285
Tyr Ala Gly Asp Leu Gly Thr Arg Ile Ser Leu Gly Gln Tyr Val Arg
290 295 300
Leu Thr Arg Lys Phe Val Thr Ala Phe Ser Gln His Lys Gln Glu Glu
305 310 315 320
Glu Ala Ala Val Asp Asp Glu Arg Tyr Gly Gln Glu Lys His Gly Gly
325 330 335
Gly Ala Glu Arg Asn Gly Asp Ser Leu Glu Met Arg His Pro Glu Arg
340 345 350
Met Asp Lys Ala Thr Arg Lys Lys Ile Asp Glu Leu Ala Arg Asp Leu
355 360 365
Ala Asp Tyr Gln Asn Gln Leu Asp Phe Tyr His Leu Lys Asp Tyr Arg
370 375 380
Ile Lys Gln Gly Lys Pro Ser Ala Lys Ile Leu Ile Gly Arg Leu Phe
385 390 395 400
Gln Arg Phe Leu Leu Ala Cys Leu Leu Ser Thr Ile Cys Ile Pro Gly
405 410 415
Leu Phe Leu Trp Ala Pro Val Phe Ile Ala Val Lys Tyr Lys Glu Ser
420 425 430
Gln Leu Arg Arg Lys Gly Pro Leu Glu Asp Asn Leu Asp Glu Ile Ala
435 440 445
Gln Tyr Lys Leu Met Ile Ser Thr Phe Phe Leu Pro Ile Ile Trp Gly
450 455 460
Phe Trp Ile Val Met Thr Leu Pro Ile Ala Leu Phe Ser Ala Pro Gly
465 470 475 480
Ile Val Val Leu Met Trp Leu Thr Ile Arg Trp Leu Glu Asp Leu Ile
485 490 495
His Asn Ala Lys Ser Met Leu Ser Leu Leu Arg Leu Leu Phe Met Thr
500 505 510
Glu Asp Thr Met Tyr Ser Leu Arg Asp Tyr Arg Gln Gly Leu Ala His
515 520 525
Arg Val His Asp Phe Ala Val Asp His Leu Lys Leu Pro Glu Asp Pro
530 535 540
Glu Val Leu Val Lys Glu Asn Lys Thr Lys Lys Val Asp Ser Gly Trp
545 550 555 560
Met Gly Lys Leu Ser Gly Ser Tyr Phe Ser Ile Lys Arg Arg Arg Arg
565 570 575
Lys Asp Trp Asn Glu Val Met Arg Leu His Asp Val Ser His Tyr Asp
580 585 590
<210>3
<211>1779
<212>DNA
<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)
<400>3
atggccaaac ttcggaagcg gacctcccag tcaaaggagg gcgccgctga caccaacggc 60
acaaggcgag acagcgtcga tgacacgaac agcgtcggca gctacgatcc acgcgccctc 120
tccaacgatc caccaaagat gtacagggcg atccggttct tcttcaagat gtgcctgcac 180
tccttctatg gccatgtgga ggtcgagggc accgagaata ttgcaccaaa caactaccct 240
gctatccttg ttgcgaacca cagcaacagt ttgacggatg cgattgccat tatgtcgact 300
gttcctccca agagcaggag catgattagg atgaccgcaa aggacacgtt ttggcataag 360
ccaggcgtct tcaattatgt catcaaaaac gctggcactg tcccgatcaa aagacgcaag 420
gattatgaga accaaaaggt cgacaacact gacgcgatgg gtgcattgat cgataccctt 480
ggagcaggaa gttgtgtatg catgttcccg gagggcatct cgcgctatca cccacaactt 540
gctccgttca aggccggtgt cgccatgatt gccagcgata cgctctcccg gtttcaagac 600
acgcccgatt tttctctcac gctcatgaca gcgtcgatca actatcttca ccgtgaaaag 660
ttccgatctg atgttctcgt cacgttccat gcacccattg tgctaacccc gcaacaagac 720
tcgaagctgt tttcgactga cctggaagtc aagaaggaag cgatccgaaa actgacagag 780
ttgctcgagg gcaccgtccg atcaactcta ctggatgccg aggactggca aacagtccga 840
gtgggtcatg ttgccaggaa gctctatgct ggcgatctgg gaactcggat ttcgctggga 900
cagtacgtgc gtttgaccag gaagtttgtc acggcgttca gtcagcacaa gcaggaggag 960
gaggcagcgg tcgatgacga gcgttatggt caggagaagc acgggggcgg tgccgagagg 1020
aatggtgatt ctttggagat gaggcatcct gagcgcatgg ataaggcgac tagaaagaaa 1080
atcgacgagc tcgccaggga tttggctgac taccaaaacc agctggactt ctatcacctc 1140
aaggactatc gtatcaagca aggcaagcca agtgcaaaga ttcttatcgg acgtcttttc 1200
caaagattct tgcttgcttg ccttttgtcg accatttgca ttcctggact gttcctttgg 1260
gcacctgtgt ttatcgccgt gaagtacaaa gagagtcagc ttaggcgcaa gggacccttg 1320
gaggacaact tggatgaaat tgcccagtac aagttgatga tctcgacttt cttcttgccg 1380
atcatctggg ggttctggat cgtaatgacc ttgccaattg cgctctttag cgcgccgggc 1440
atcgttgttc tgatgtggct tacgatccgc tggcttgagg acttgatcca caacgcgaaa 1500
tcgatgttgt cccttttgcg attgctgttt atgacggagg ataccatgta ctcgttgaga 1560
gactaccgtc aggggctggc gcatcgtgtg cacgattttg cggtcgatca tctgaagttg 1620
cctgaggacc ctgaggttct ggtcaaggag aacaagacca agaaggtcga cagtggctgg 1680
atgggcaagt tgtcgggcag ctacttctcg atcaagagga gaagaagaaa ggactggaac 1740
gaggttatgc gattgcacga tgtttctcac tatgactga 1779
<210>4
<211>1776
<212>DNA
<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)
<400>4
atggccaaac ttcggaagcg gacctcccag tcaaaggagg gcgccgctga caccaacggc 60
acaaggcgag acagcgtcga tgacacgaac agcgtcggca gctacgatcc acgcgccctc 120
tccaacgatc caccaaagat gtacagggcg atccggttct tcttcaagat gtgcctgcac 180
tccttctatg gccatgtgga ggtcgagggc accgagaata ttgcaccaaa caactaccct 240
gctatccttg ttgcgaacca cagcaacagt ttgacggatg cgattgccat tatgtcgact 300
gttcctccca agagcaggag catgattagg atgaccgcaa aggacacgtt ttggcataag 360
ccaggcgtct tcaattatgt catcaaaaac gctggcactg tcccgatcaa aagacgcaag 420
gattatgaga accaaaaggt cgacaacact gacgcgatgg gtgcattgat cgataccctt 480
ggagcaggaa gttgtgtatg catgttcccg gagggcatct cgcgctatca cccacaactt 540
gctccgttca aggccggtgt cgccatgatt gccagcgata cgctctcccg gtttcaagac 600
acgcccgatt tttctctcac gctcatgaca gcgtcgatca actatcttca ccgtgaaaag 660
ttccgatctg atgttctcgt cacgttccat gcacccattg tgctaacccc gcaacaagac 720
tcgaagctgt tttcgactga cctggaagtc aagaaggaag cgatccgaaa actgacagag 780
ttgctcgagg gcaccgtccg atcaactcta ctggatgccg aggactggca aacagtccga 840
gtgggtcatg ttgccaggaa gctctatgct ggcgatctgg gaactcggat ttcgctggga 900
cagtacgtgc gtttgaccag gaagtttgtc acggcgttca gtcagcacaa gcaggaggag 960
gaggcagcgg tcgatgacga gcgttatggt caggagaagc acgggggcgg tgccgagagg 1020
aatggtgatt ctttggagat gaggcatcct gagcgcatgg ataaggcgac tagaaagaaa 1080
atcgacgagc tcgccaggga tttggctgac taccaaaacc agctggactt ctatcacctc 1140
aaggactatc gtatcaagca aggcaagcca agtgcaaaga ttcttatcgg acgtcttttc 1200
caaagattct tgcttgcttg ccttttgtcg accatttgca ttcctggact gttcctttgg 1260
gcacctgtgt ttatcgccgt gaagtacaaa gagagtcagc ttaggcgcaa gggacccttg 1320
gaggacaact tggatgaaat tgcccagtac aagttgatga tctcgacttt cttcttgccg 1380
atcatctggg ggttctggat cgtaatgacc ttgccaattg cgctctttag cgcgccgggc 1440
atcgttgttc tgatgtggct tacgatccgc tggcttgagg acttgatcca caacgcgaaa 1500
tcgatgttgt cccttttgcg attgctgttt atgacggagg ataccatgta ctcgttgaga 1560
gactaccgtc aggggctggc gcatcgtgtg cacgattttg cggtcgatca tctgaagttg 1620
cctgaggacc ctgaggttct ggtcaaggag aacaagacca agaaggtcga cagtggctgg 1680
atgggcaagt tgtcgggcag ctacttctcg atcaagagga gaagaagaaa ggactggaac 1740
gaggttatgc gattgcacga tgtttctcac tatgac 1776
<210>5
<211>485
<212>DNA
<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)
<400>5
ttggctgact accaaaacca gctggacttc tatcacctca aggactatcg tatcaagcaa 60
ggcaagccaa gtgcaaagat tcttatcgga cgtcttttcc aaagattctt gcttgcttgc 120
cttttgtcga ccatttgcat tcctggactg ttcctttggg cacctgtgtt tatcgccgtg 180
aagtacaaag agagtcagct taggcgcaag ggacccttgg aggacaactt ggatgaaatt 240
gcccagtaca agttgatgat ctcgactttc ttcttgccga tcatctgggg gttctggatc 300
gtaatgacct tgccaattgc gctctttagc gcgccgggca tcgttgttct gatgtggctt 360
acgatccgct ggcttgagga cttgatccac aacgcgaaat cgatgttgtc ccttttgcga 420
ttgctgtata tgacggagga taccatgtac tcgttgagag actaccgtca ggggctggag 480
catcg 485
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)E-1
<400>6
ctgactacca aaaccagctg gacttc 26
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)E-2
<400>7
ggcaatttca tccaagttgt cctcc 25
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)GPAT1-1
<400>8
ggatccatgg cccttcagat ctacga 26
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)GPAT1-2
<400>9
gtcgacctaa atgtcttttg acttggc 27
<210>10
<211>2154
<212>DNA
<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2154)
<223>
<400>10
atg gcc ctt cag atc tac gac ttc gtg tcg ttc ttc ttc act atc ctg 48
Met Ala Leu Gln Ile Tyr Asp Phe Val Ser Phe Phe Phe Thr Ile Leu
1 5 10 15
ctc gac atc ttc ttc agg gag att cgt ccc aga ggc gca cac aaa att 96
Leu Asp Ile Phe Phe Arg Glu Ile Arg Pro Arg Gly Ala His Lys Ile
20 25 30
cca caa aaa gga ccc gtg atc ttt gtt gcc gct cct cat gcc aat cag 144
Pro Gln Lys Gly Pro Val Ile Phe Val Ala Ala Pro His Ala Asn Gln
35 40 45
ttt gtc gat cct ctc gtc ttg atg cgt gag tgt ggc cgt aga gtc tca 192
Phe Val Asp Pro Leu Val Leu Met Arg Glu Cys Gly Arg Arg Val Ser
50 55 60
ttc ctt gcg gcc aaa aag tct atg gac cgc cgg tgg att ggt gct atg 240
Phe Leu Ala Ala Lys Lys Ser Met Asp Arg Arg Trp Ile Gly Ala Met
65 70 75 80
gca cgc tcg atg aat gcg att cct gtt gaa cgc ccg cag gat ctt gct 288
Ala Arg Ser Met Asn Ala Ile Pro Val Glu Arg Pro Gln Asp Leu Ala
85 90 95
aaa gcg ggt tcg gga gtc atc aaa ctt ttg gat cgc tat ggt gat cct 336
Lys Ala Gly Ser Gly Val Ile Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Gly Asp Pro
100 105 110
ctt cga gtg aca ggt gtc ggc act aaa ttc aca aag gag cta ctt gtg 384
Leu Arg Val Thr Gly Val Gly Thr Lys Phe Thr Lys Glu Leu Leu Val
115 120 125
gga gat cag ata tct ctc cca aag gac gtt ggc tcc tca gcc gtg gtc 432
Gly Asp Gln Ile Ser Leu Pro Lys Asp Val Gly Ser Ser Ala Val Val
130 135 140
gag atc ata tct gat acc gag ctg att gtc aag aag gaa ttc aag gag 480
Glu Ile Ile Ser Asp Thr Glu Leu Ile Val Lys Lys Glu Phe Lys Glu
145 150 155 160
ctc aag gcc ctc gaa tta ttg acc agc cct gat gga acc aag tat aaa 528
Leu Lys Ala Leu Glu Leu Leu Thr Ser Pro Asp Gly Thr Lys Tyr Lys
165 170 175
tgc cta cct cac atg gac cag acg aat gta tac aaa act gtc ttt gag 576
Cys Leu Pro His Met Asp Gln Thr Asn Val Tyr Lys Thr Val Phe Glu
180 185 190
cgc ctc aac gct gga cat tgc gtt ggc att ttc ccc gaa ggt gga tcc 624
Arg Leu Asn Ala Gly His Cys Val Gly Ile Phe Pro Glu Gly Gly Ser
195 200 205
cac gat cgc gct gag atg ctg cca ttg aaa gct gga gtc acc atc atg 672
His Asp Arg Ala Glu Met Leu Pro Leu Lys Ala Gly Val Thr Ile Met
210 215 220
gct ctg ggc gcg ttg gcc gcc aac cct tcg ttg gac ctc aag att gtc 720
Ala Leu Gly Ala Leu Ala Ala Asn Pro Ser Leu Asp Leu Lys Ile Val
225 230 235 240
acc tgc ggc ctc aac tac ttt cat cct cat cgc ttc cgc tcg cgt gca 768
Thr Cys Gly Leu Asn Tyr Phe His Pro His Arg Phe Arg Ser Arg Ala
245 250 255
gtg gtc gag ttt ggc gag cca ctg acg gtc cct cct gag ctg gtc gaa 816
Val Val Glu Phe Gly Glu Pro Leu Thr Val Pro Pro Glu Leu Val Glu
260 265 270
atg tac aag cga ggc ggg gct gag aag cgt gaa gcg tgc gga aag ttg 864
Met Tyr Lys Arg Gly Gly Ala Glu Lys Arg Glu Ala Cys Gly Lys Leu
275 280 285
ctg gat aca atc tat gag gct ctt cgc ggt gtc act ctc aat gca cct 912
Leu Asp Thr Ile Tyr Glu Ala Leu Arg Gly Val Thr Leu Asn Ala Pro
290 295 300
gat tac gaa acg ttg atg gtc att caa gcg gcc cgt cgc ctt tac aag 960
Asp Tyr Glu Thr Leu Met Val Ile Gln Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Lys
305 310 315 320
ccc act cat cgc aag ctg cag atc tca caa gtc gtg gag ttg aac cgc 1008
Pro Thr His Arg Lys Leu Gln Ile Ser Gln Val Val Glu Leu Asn Arg
325 330 335
agg ttc gtc gca gga tac atg cac ttc aag gac aac cct aaa gtc att 1056
Arg Phe Val Ala Gly Tyr Met His Phe Lys Asp Asn Pro Lys Val Ile
340 345 350
gaa gcc aag gac aag gtc atg cat tac aac act caa ctt cga tac cat 1104
Glu Ala Lys Asp Lys Val Met His Tyr Asn Thr Gln Leu Arg Tyr His
355 360 365
gga ctg cgc gat cat cag gtg aac att cgc aca acc agg aaa cac gct 1152
Gly Leu Arg Asp His Gln Val Asn Ile Arg Thr Thr Arg Lys His Ala
370 375 380
atc ggc atg ctc atc tca cgg ctc att cag atg atc ttt ttg agt tgt 1200
Ile Gly Met Leu Ile Ser Arg Leu Ile Gln Met Ile Phe Leu Ser Cys
385 390 395 400
ctg gct cta cct gga acc ctg atg aat ctt ccg gtc gct att gtc gct 1248
Leu Ala Leu Pro Gly Thr Leu Met Asn Leu Pro Val Ala Ile Val Ala
405 410 415
cgt gtc atc agc aac aag aag gcc aaa gag gcg ctg gct gcc tcg aca 1296
Arg Val Ile Ser Asn Lys Lys Ala Lys Glu Ala Leu Ala Ala Ser Thr
420 425 430
gtc aag att gct gga agg gat gtc ctg gct aca tgg aag ctg ctg gtc 1344
Val Lys Ile Ala Gly Arg Asp Val Leu Ala Thr Trp Lys Leu Leu Val
435 440 445
gct cta gga ttg atg cct gtc ctc tac ttc aca tat tcc gtc atg gtc 1392
Ala Leu Gly Leu Met Pro Val Leu Tyr Phe Thr Tyr Ser Val Met Val
450 455 460
ttt atc tat tgt ggc cgc ttc gac ata tcg ttc aag tcg cgt ctc ttg 1440
Phe Ile Tyr Cys Gly Arg Phe Asp Ile Ser Phe Lys Ser Arg Leu Leu
465 470 475 480
atc gct tgg gca gca tgg gcg cta att cct ttc gta acg tat gca agc 1488
Ile Ala Trp Ala Ala Trp Ala Leu Ile Pro Phe Val Thr Tyr Ala Ser
485 490 495
ata cgc ttc ggt gaa gtt ggt atc gat att ttc aaa tct atc cgc cca 1536
Ile Arg Phe Gly Glu Val Gly Ile Asp Ile Phe Lys Ser Ile Arg Pro
500 505 510
ttg ttc ttg tcc atc atc cca ggt gaa gag agc acg atc aac gac ttg 1584
Leu Phe Leu Ser Ile Ile Pro Gly Glu Glu Ser Thr Ile Asn Asp Leu
515 520 525
cgc aaa gcc cga gcg gaa ctc cag aag act atc acc aat ctt atc aat 1632
Arg Lys Ala Arg Ala Glu Leu Gln Lys Thr Ile Thr Asn Leu Ile Asn
530 535 540
gag ctg gcg ccg cag att tat ccc gac ttt gat tcg aag cgc atc ctc 1680
Glu Leu Ala Pro Gln Ile Tyr Pro Asp Phe Asp Ser Lys Arg Ile Leu
545 550 555 560
gat ccg tct cct gca gat cgc ccc agc cgc tcg gca tca ggt acc aac 1728
Asp Pro Ser Pro Ala Asp Arg Pro Ser Arg Ser Ala Ser Gly Thr Asn
565 570 575
ctt gca cag aca atc ttc aac acg gcc gct cag cct ttg aac caa tgg 1776
Leu Ala Gln Thr Ile Phe Asn Thr Ala Ala Gln Pro Leu Asn Gln Trp
580 585 590
cta ggc aag gac ggc cgc ttt gaa tgg gag cgc acc gag gat tcg gat 1824
Leu Gly Lys Asp Gly Arg Phe Glu Trp Glu Arg Thr Glu Asp Ser Asp
595 600 605
gca gat gat gtg ttc ttc ttt ttg gac cca gca aga gga att ctt gga 1872
Ala Asp Asp Val Phe Phe Phe Leu Asp Pro Ala Arg Gly Ile Leu Gly
610 615 620
cgg tcg agg gcg tcg tcc tgg gga gga ggg gca ttt aca cct gcc gcc 1920
Arg Ser Arg Ala Ser Ser Trp Gly Gly Gly Ala Phe Thr Pro Ala Ala
625 630 635 640
gat ggg tcg cga tcc cgg aat cgg agc agg aca agc agc ttc acg tcg 1968
Asp Gly Ser Arg Ser Arg Asn Arg Ser Arg Thr Ser Ser Phe Thr Ser
645 650 655
gga cag atc cag ctt ggc gag ggc ttc aaa ctc gag gca ttg acg gaa 2016
Gly Gln Ile Gln Leu Gly Glu Gly Phe Lys Leu Glu Ala Leu Thr Glu
660 665 670
ctg ccg agg gac aag cct ttt gca gag gtg acg agg cgg ctg agt gtg 2064
Leu Pro Arg Asp Lys Pro Phe Ala Glu Val Thr Arg Arg Leu Ser Val
675 680 685
agc cgc atg cag aga tac ggg ttg gag ggt atg acg cgc tcg gac acg 2112
Ser Arg Met Gln Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Met Thr Arg Ser Asp Thr
690 695 700
gac gaa aac gaa ggc tct aca gcc aag tca aaa gac att tag 2154
Asp Glu Asn Glu Gly Ser Thr Ala Lys Ser Lys Asp Ile
705 710 715
<210>11
<211>717
<212>PRT
<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)
<400>11
Met Ala Leu Gln Ile Tyr Asp Phe Val Ser Phe Phe Phe Thr Ile Leu
1 5 10 15
Leu Asp Ile Phe Phe Arg Glu Ile Arg Pro Arg Gly Ala His Lys Ile
20 25 30
Pro Gln Lys Gly Pro Val Ile Phe Val Ala Ala Pro His Ala Asn Gln
35 40 45
Phe Val Asp Pro Leu Val Leu Met Arg Glu Cys Gly Arg Arg Val Ser
50 55 60
Phe Leu Ala Ala Lys Lys Ser Met Asp Arg Arg Trp Ile Gly Ala Met
65 70 75 80
Ala Arg Ser Met Asn Ala Ile Pro Val Glu Arg Pro Gln Asp Leu Ala
85 90 95
Lys Ala Gly Ser Gly Val Ile Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Gly Asp Pro
100 105 110
Leu Arg Val Thr Gly Val Gly Thr Lys Phe Thr Lys Glu Leu Leu Val
115 120 125
Gly Asp Gln Ile Ser Leu Pro Lys Asp Val Gly Ser Ser Ala Val Val
130 135 140
Glu Ile Ile Ser Asp Thr Glu Leu Ile Val Lys Lys Glu Phe Lys Glu
145 150 155 160
Leu Lys Ala Leu Glu Leu Leu Thr Ser Pro Asp Gly Thr Lys Tyr Lys
165 170 175
Cys Leu Pro His Met Asp Gln Thr Asn Val Tyr Lys Thr Val Phe Glu
180 185 190
Arg Leu Asn Ala Gly His Cys Val Gly Ile Phe Pro Glu Gly Gly Ser
195 200 205
His Asp Arg Ala Glu Met Leu Pro Leu Lys Ala Gly Val Thr Ile Met
210 215 220
Ala Leu Gly Ala Leu Ala Ala Asn Pro Ser Leu Asp Leu Lys Ile Val
225 230 235 240
Thr Cys Gly Leu Asn Tyr Phe His Pro His Arg Phe Arg Ser Arg Ala
245 250 255
Val Val Glu Phe Gly Glu Pro Leu Thr Val Pro Pro Glu Leu Val Glu
260 265 270
Met Tyr Lys Arg Gly Gly Ala Glu Lys Arg Glu Ala Cys Gly Lys Leu
275 280 285
Leu Asp Thr Ile Tyr Glu Ala Leu Arg Gly Val Thr Leu Asn Ala Pro
290 295 300
Asp Tyr Glu Thr Leu Met Val Ile Gln Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Lys
305 310 315 320
Pro Thr His Arg Lys Leu Gln Ile Ser Gln Val Val Glu Leu Asn Arg
325 330 335
Arg Phe Val Ala Gly Tyr Met His Phe Lys Asp Asn Pro Lys Val Ile
340 345 350
Glu Ala Lys Asp Lys Val Met His Tyr Asn Thr Gln Leu Arg Tyr His
355 360 365
Gly Leu Arg Asp His Gln Val Asn Ile Arg Thr Thr Arg Lys His Ala
370 375 380
Ile Gly Met Leu Ile Ser Arg Leu Ile Gln Met Ile Phe Leu Ser Cys
385 390 395 400
Leu Ala Leu Pro Gly Thr Leu Met Asn Leu Pro Val Ala Ile Val Ala
405 410 415
Arg Val Ile Ser Asn Lys Lys Ala Lys Glu Ala Leu Ala Ala Ser Thr
420 425 430
Val Lys Ile Ala Gly Arg Asp Val Leu Ala Thr Trp Lys Leu Leu Val
435 440 445
Ala Leu Gly Leu Met Pro Val Leu Tyr Phe Thr Tyr Ser Val Met Val
450 455 460
Phe Ile Tyr Cys Gly Arg Phe Asp Ile Ser Phe Lys Ser Arg Leu Leu
465 470 475 480
Ile Ala Trp Ala Ala Trp Ala Leu Ile Pro Phe Val Thr Tyr Ala Ser
485 490 495
Ile Arg Phe Gly Glu Val Gly Ile Asp Ile Phe Lys Ser Ile Arg Pro
500 505 510
Leu Phe Leu Ser Ile Ile Pro Gly Glu Glu Ser Thr Ile Asn Asp Leu
515 520 525
Arg Lys Ala Arg Ala Glu Leu Gln Lys Thr Ile Thr Asn Leu Ile Asn
530 535 540
Glu Leu Ala Pro Gln Ile Tyr Pro Asp Phe Asp Ser Lys Arg Ile Leu
545 550 555 560
Asp Pro Ser Pro Ala Asp Arg Pro Ser Arg Ser Ala Ser Gly Thr Asn
565 570 575
Leu Ala Gln Thr Ile Phe Asn Thr Ala Ala Gln Pro Leu Asn Gln Trp
580 585 590
Leu Gly Lys Asp Gly Arg Phe Glu Trp Glu Arg Thr Glu Asp Ser Asp
595 600 605
Ala Asp Asp Val Phe Phe Phe Leu Asp Pro Ala Arg Gly Ile Leu Gly
610 615 620
Arg Ser Arg Ala Ser Ser Trp Gly Gly Gly Ala Phe Thr Pro Ala Ala
625 630 635 640
Asp Gly Ser Arg Ser Arg Asn Arg Ser Arg Thr Ser Ser Phe Thr Ser
645 650 655
Gly Gln Ile Gln Leu Gly Glu Gly Phe Lys Leu Glu Ala Leu Thr Glu
660 665 670
Leu Pro Arg Asp Lys Pro Phe Ala Glu Val Thr Arg Arg Leu Ser Val
675 680 685
Ser Arg Met Gln Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Met Thr Arg Ser Asp Thr
690 695 700
Asp Glu Asn Glu Gly Ser Thr Ala Lys Ser Lys Asp Ile
705 710 715
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)12-f
<400>12
tctagaatgg cacctcccaa cactattg 28
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)12-r
<400>13
aagcttttac ttcttgaaaa agaccacgtc 30
<210>14
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)6-f
<400>14
tctagaatgg ctgctgctcc cagtgtgag 29
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)6-r
<400>15
aagcttttac tgtgccttgc ccatcttgg 29
<210>16
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)GLELO-f
<400>16
tctagaatgg agtcgattgc gcaattcc 28
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)GLELO-r
<400>17
gagctcttac tgcaacttcc ttgccttctc 30
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)5-f
<400>18
tctagaatgg gtgcggacac aggaaaaacc 30
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)5-r
<400>19
aagcttttac tcttccttgg gacgaagacc 30
<210>20
<211>1203
<212>DNA
<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)
<400>20
atggcacctc ccaacactat tgatgccggt ttgacccagc gccatatcag cacctcggcc 60
gccccaacct ctgccaagcc cgccttcgag cgcaactacc agctccctga gttcaccatc 120
aaggagatcc gtgagtgcat ccctgcacac tgctttgagc gctccggtct ccgtggtctt 180
tgccacgttg ctattgatct gacctgggcc tcgctcttgt tcctggctgc gacccagatc 240
gacaagttcg agaacccttt gatccgctac ttggcctggc ctgcgtattg gatcatgcag 300
ggtattgttt gcaccggtat ctgggtattg gcacacgaat gtggtcatca gtccttctcg 360
acctccaaga cccttaacaa cactgtcggc tggatcttgc actcgatgct cttggtccct 420
taccactcct ggagaatctc gcactcgaag caccacaagg ccactggcca catgaccaag 480
gaccaggtct ttgttcccaa gacccgctct caggttggct tgccccccaa ggagaatgtt 540
gcagttgccg ttcaggagga ggatatgtcc gtgcacctgg atgaggaggc ccccattgtg 600
actttgttct ggatggtgat tcagttcctg ttcggatggc ctgcgtacct tattatgaac 660
gcctctggtc aagactatgg ccgctggacc tcgcacttcc acacctactc tcctatcttt 720
gagccccgca actttttcga cattatcatt tcggatctcg gtgtgttggc tgctcttggt 780
accttgatct acgcctccat gcagctctcg ctcttgaccg tgaccaagta ctacattgtc 840
ccctacttgt ttgtcaactt ctggttggtc ctgatcacct tcttgcagca caccgaccct 900
aagctgcccc attaccgtga gggtgcctgg aacttccagc gtggagccct ctgcaccgtt 960
gaccgctcgt tcggcaagtt cttggaccat atgttccacg gcattgtcca tacccatgta 1020
gcccatcact tgttctcgca gatgccgttc taccatgctg aggaagccac ccatcatctc 1080
aagaaactgc tgggagagta ctacgtctat gacccatcgc cgattgttgt tgcggtctgg 1140
aggtcgttcc gtgaatgccg attcgtggaa gaccatggag acgtggtctt tttcaagaag 1200
taa 1203
<210>21
<211>1374
<212>DNA
<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)
<400>21
atggctgctg ctcccagtgt gaggacgttt actcgggccg agattttgaa tgccgaggcc 60
ctgaatgagg gcaagaagga tgccgaggca ccctttctga tgatcattga caacaaggtg 120
tacgatgtcc gcgagtttgt ccctgatcat cccggtggaa gtgtgattct cacgcacgtt 180
ggcaaggacg gcactgacgt ctttgacact ttccaccccg aggctgcttg ggagactctt 240
gccaactttt acgttggtga tattgatgag agcgatcgtg ccatcaagaa tgatgacttt 300
gcggccgagg ttcgcaagct gcgcaccttg ttccagtccc ttggctacta cgactcgtcc 360
aaggcatact atgccttcaa ggtctcgttc aacctctgca tctggggctt gtcgactttc 420
attgttgcca agtggggcca gacctcgacc ctcgccaacg tgctctcggc tgcgctcttg 480
ggtctcttct ggcagcagtg cggatggttg gcgcacgact ttttgcacca ccaggtcttc 540
caggaccgtt tctggggtga tcttttcggc gccttcttgg gaggtgtctg ccagggtttc 600
tcgtcctcct ggtggaagga caagcacaac actcaccacg ctgctcccaa cgtccacggc 660
gaggatcccg acattgacac tcaccctctg ttgacctgga gtgagcatgc tctggagatg 720
ttctcggatg ttcctgacga ggagctgacc cgtatgtggt cgcgcttcat ggtcctcaac 780
cagacctggt tctacttccc cattctctcg tttgcccgtc tgtcctggtg cctccagtcc 840
attatgcttg ttctgcccaa cggtcaggcc cacaagccct ctggagcgcg tgtgcccatt 900
tcgttggtcg agcagctgtc tctggctatg cactggacct ggtacctcgc caccatgttc 960
ctgttcatta aggatcccgt caacatgatt gtgtactttt tggtgtcgca ggctgtttgc 1020
ggcaacttgt tggcgattgt gttctcgctc aaccacaacg gcatgcctgt gatctccaag 1080
gaggaagcgg tcgatatgga cttcttcacc aagcagatca tcacgggtcg tgatgttcac 1140
cctggtctgt ttgccaactg gttcacgggt ggattgaact accagattga gcaccacttg 1200
ttcccttcga tgccccgcca caacttttca aagatccagc ctgctgtcga gactttgtgc 1260
aaaaagtacg gtgtccgata ccataccact ggtatgatcg agggaactgc agaggtcttt 1320
agccgtttga acgaggtctc caaggcggcc tccaagatgg gcaaggcaca gtaa 1374
<210>22
<211>957
<212>DNA
<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)
<400>22
atggagtcga ttgcgcaatt cctcccctca aagatgccgc aagatctgtt tattgacctt 60
gcaagggcca tcggtgtcca ggccgcaccc tatgtcgacc ctctcgaggc agcgcttgtg 120
gcccaggccg agaagttctt ccccacggtc gttcatcaca cgcgcggctt tttggtcgcg 180
gtcgagtcac ccttggcccg tgagctgccc ttgatgaacc ccttccacgt gctgttgatc 240
gcgctcgctt acttggtcac ggtctttgtg ggcatgcaga tcatgaagaa ctttgaacgg 300
ttcgaggtca agacgttctc gctcttccac aacttttgtc tggtctcgat cagtgcctac 360
atgtgcggcg ggatcttgta cgaggcttac caggccaact atggactgtt tgagaacgcg 420
gccgatcata ccgtccaggg tcttcctatg gccaagatga tctggctctt ctacttctcc 480
aagatcatgg agtttgtcga caccatgatc atggtcctta agaagaacaa ccgccagatc 540
tcgttcttgc acgtctacca ccacagctcc atcttcacca tctggtggtt ggtcaccttt 600
gttgcaccca atggtgaagc ctacttctcg gctgcgttga actcgttcat ccacgtgatc 660
atgtacggct actacttcct gtccgccttg ggcttcaagc aggtgtcgtt catcaagttc 720
tacatcacgc gttcgcagat gacgcagttc tgcatgatgt cgatccagtc ctcctgggac 780
atgtatgcca tgaaggtgct tggccgcccc ggatacccct tcttcatcac cgccctgctt 840
tggttctaca tgtggaccat gctcggactc ttctacaact tctacagaaa gaacgccaag 900
ttggccaagc aggccaagat cgatgctgcc aaggagaagg caaggaagtt gcagtaa 957
<210>23
<211>1341
<212>DNA
<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)
<400>23
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gagatgtacc acgagtttgg agctgcagag gctatcatga agaagtacta tgttggcaca 240
ctggtctcaa atgagttgcc catcttccca gagccaacgg tgttccataa gaccatcaag 300
ggcagagttg aggcatactt taaggaccgg aacatggatt ccaagaacag accagagatc 360
tggggacgat atgctctcat ctttggatcc ttgatcgcct cttactacgc gcagctcttt 420
gtaccgttcg tggtcgaacg tacatggctc caggtggtgt ttgctatcat catgggattt 480
gcgtgcgcgc aagtcggatt gaaccctctt cacgatgcct cccacttttc agtgacccac 540
aaccccaccg tttggaagat tctcggagcc acgcacgact ttttcaacgg agcatcgtat 600
ctcgtgtgga tgtaccaaca tatgctcggc catcatccct ataccaacat tgctggagct 660
gatcccgatg tgtcgacctc tgagcccgat gttcgtcgta tcaagcccaa ccaaaagtgg 720
ttcgtcaacc acatcaacca gcacatgttt gttcctttcc tgtacggact gctggcgttc 780
aaggtgcgca tccaggacat caacatcttg tactttgtca agaccaatga cgccattcgt 840
gtcaacccca tctcgacttg gcacaccgtc atgttctggg gcggaaaggc cttctttgtc 900
tggtaccgct tgatcgttcc tatgcagtat ctgcccctga gcaaggtgtt gctcttgttt 960
accgtcgcag acatggtctc ttcttactgg ctggcgctga ccttccaggc gaaccacgtt 1020
gttgaggagg ttcagtggcc attgcctgat gagaatggaa tcatccaaaa ggattgggca 1080
gccatgcagg tcgagactac tcaggattac gcccacgatt cgcacctctg gaccagcatc 1140
acgggcagct tgaactacca agccgttcat catctgttcc cgaacgtttc ccagcatcac 1200
taccctgata tcctggctat catcaaggac acctgcagcg agtacaaggt gccatacctc 1260
gtcaaggata ccttttggca agcgtttgct tcacatttgg agcacttgcg tgtgcttggt 1320
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<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)MaGAPDHpfw
<400>24
cacaccacac attcaacatc 20
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)E2
<400>25
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<210>26
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)E1
<400>26
ctgactacca aaaccagctg gacttc 26
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(primer)PD4P
<400>27
cgcatcccgc aaacacacac 20
机译： 3-甘油-磷酸-酰基转移酶（gpat）的同源物及其应用。
机译： 甘油3-磷酸酰基转移酶（GPAT）同源物及其用途
机译： 甘油3-磷酸酰基转移酶（GPAT）同源物及其用途
