麻疯树微苗组培快速繁殖及生根的方法

摘要

本发明公开的麻疯树微苗组培快速繁殖及生根的方法，是将消毒灭菌后麻疯树种子中的胚置于pH5.4－6.0的基础培养基中，在培养温度25－35℃，光照强度1500－3000lx，光照时间12h/d下培养5天后胚萌发为无菌苗；将无菌苗分切的单芽茎段置于快速繁殖培养基中，继续培养7天后即可诱导出丛生芽；将生长至2－3cm长的丛生芽切下接种于生根培养基中，再继续培养5天开始生根，15天后根长达到2－3cm的壮苗即可移栽。用本发明方法从种子萌发到第1次增殖苗生根完成只需66天，增殖快；培养过程所用激素浓度小，接触时间短，变异几率小；用一粒种子3周时间，可获得4.25棵小苗，繁殖系数高；所用试剂种类单一，用量少，价格便宜，成本低。

说明书

技术领域

本发明属于麻疯树植物组织培养快速繁殖技术领域，具体涉及一种麻疯树微苗组培快速繁殖及生根的方法。

技术背景

麻疯树是大戟科麻疯树属植物，主要分布于热带、亚热带地区。麻疯树具有散淤、止痛作用，常被用于治疗跌打损伤、皮肤痉痒和肠胃炎。近年来研究发现，麻疯树除还含有抗癌、抗病、抗虫成分，在新药开发上具有潜在的重要价值外，其油脂含量也很高，且其油脂的成分与石化柴油接近，加上麻疯树抗旱耐瘠，对环境要求不高，因而，麻疯树可作为能源资源植物引起人们的广泛关注，许多国家政府和公司企业都在积极开发利用麻疯树，以生产绿色能源。绿色能源的生产，要求培育高产高油的麻疯树新品种新品系，要求尽快加大优良品种的繁殖扩大，以大规模地种植麻疯树。利用植物组织培养技术，是有效地加快优良品种品系的快繁是一种很好的途径。

国内外早在1996年就开始了麻疯树的组织培养技术的研究，目前，已经能够利用麻疯树叶片、子叶、上胚轴、下胚轴(M.Sujatha，N.Mukta.1996.Morphogenesis and plantregeneration from tissue cultures of Jatropha curcas.Plant Cell Tissue Organ Cult，44：135-141；陆伟达，魏琴，唐琳，颜钫，陈放.2003麻疯树愈伤组织的诱导剂快速繁殖.应用与环境生物学报9：127-130)和腋芽(林娟，唐琳，陈放.2002.麻疯树的组织培养及植株再生.植物生理学通讯  38(3)：252)为外植体展开组织培养研究。但是，无论采用何种外植体所诱导出的不定芽的再生率不仅都很低且培育时间都较长。如Sujatha等(M.Sujatha，N.Mukta.1996.Morphogenesis and plant regeneration from tissue cultures ofJatropha curcas.Plant Cell Tissue Organ Cult，44：135-141)采用再生茎段诱导出丛生芽至少需要40天；Deore等(A.C.Deore.，T.S.Johnson.2008.High-frequency plantregeneration from leaf-disc cultures of Jatropha curcas L.：an important biodiesel plant.PlantBiotechnol Rep.，2：7-11)利用叶片为外植体做的植株再生并产生丛生苗至少需时20周；Jha等(T.baran Jha，P.Mukherjee，M.M.Datta.2007.Somatic embryogenesis in Jatrophacurcas Linn.，an important biofuel plant.Plant Biotechnol Rep.，1：135-140)利用叶片为外植体通过体细胞胚胎发生途径得到再生苗需时12-16周；林娟等(林娟，唐琳，陈放.2002.麻疯树的组织培养及植株再生.植物生理学通讯38(3)：252)完成从种子萌发到第1次增殖过程需时70天。就目前快繁水平来看，虽然腋芽的效果最好，其快繁系数在16周内最高能达到12.3(M.Sujathal，H.P.S.Makkar and K.Becker.2005.Shootbud proliferation from axillary nodes and leaf sections of non-toxic.Plant GrowthRegulation，47：83-90)，但培养的时间还是较长，从外植体接种到成苗过程需要70天以上。不仅如此，它们都还存在培育成本较高的问题，如林娟等(林娟，唐琳，陈放.2002.麻疯树的组织培养及植株再生.植物生理学通讯38(3)：252)在种子萌发培养基中添加了较高浓度的植物激素，6-BA浓度高达2.5mg/L，导致初代培养的麻疯树大多数产生愈伤组织，形成完整苗的最高频率只有57.8％；陈金洪等(陈金洪，高敏，黄记生.2006.麻疯树茎段离体培养及快速繁殖研究.广西农业科学.37(3)：221-223)采用MS+6 BA 2.5mg/L+0.1～0.5mg/L IBA的组合培养基；李化等(李化，曾妮，贾勇炯，唐琳，陈放.2006.麻疯树的促腋芽分枝快繁及生根诱导.四川大学学报(自然科学版)43(5)：1116-1120)则采用了MS+1.0mg/L 6-BA+0.01mg/L IBA+5mg/LAgNO₃培养基；Sujatha等(M.Sujathal，H.P.S.Makkar and K.Becker.2005.Shoot bud proliferationfrom axillary nodes and leaf sections of non-toxic.Plant Growth Regulation，47：83-90)前4周采用MS+4.5μMTDZ，后四周将其转入MS+8.9μM BA+2.5μM IBA中才能诱导出丛生芽。很显然，这些配方无论是激素用量或是添加物的复杂程度都较高。

发明内容

本发明的目的是针对现有的麻疯树组织培养方法中存在的成本较高，费时费力，再生率不高等问题，以及本领域一直存在的麻疯树组培苗的生根难题，提供一种麻疯树微苗组培快速繁殖及生根的方法，以为麻疯树组培苗的推广应用奠定基础。

本发明提供的麻疯树微苗组培快速繁殖及生根的方法，该方法是将成熟去壳的麻疯树种子先进行消毒灭菌，然后取出其中的胚置于pH 5.4-6.0的基础培养基中，在培养温度25-35℃，光照强度1500-3000lx，光照时间12h/d下培养5天后胚萌发为无菌苗；将无菌苗分切的单芽茎段置于pH 5.4-6.0的快速繁殖培养基中，在培养温度25-35℃，光照强度1500-3000lx，光照时间12h/d下培养7天后即可诱导出丛生芽；将生长至2-3cm长的丛生芽切下接种于pH 5.4-6.0的生根培养基中，在培养温度25-35℃，光照强度1500-3000lx，光照时间12h/d下培养5天开始生根，15天后根长达到2-3cm的壮苗即可移栽，其中快速繁殖培养基是在基础培养基中，添加0.1～0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和0.15～1.0mg/L的3-吲哚乙酸(IBA)或α-萘乙酸(NAA)组成，生根培养基是在基础培养基中，添加0.1～1.0mg/L的3-吲哚乙酸或α-萘乙酸组成，基础培养基则是在MS培养基中，添加25～35g/L蔗糖和琼脂固化而成。

对成熟去壳的麻疯树种子的消毒灭菌虽可采用常规的方法，但本发明人在研究中发现用体积浓度70-80％的酒精处理1min后种子褐化，萌发时间延长，萌发率降低，即种子受到了伤害；而用质量浓度0.4-0.5％氯化汞和次氯酸钠溶液处理5-10min种子污染率高，而处理超过20min会杀伤种子，降低萌发率，故最好采用经本发明人摸索出来的优选消毒灭菌方法：先用体积浓度70-80％的酒精处理0.5-1分钟，用无菌水冲洗2-3次，其后再用质量浓度0.4-0.5％的氯化汞溶液处理10-17分钟，更优选处理12-15分钟或用质量浓度0.4-0.5％的次氯酸钠溶液处理15-20分钟，更优选处理16-18分钟，最后用无菌水冲洗2-7次，优选冲洗2-3次即可。用优选的消毒灭菌方法处理，其存活率可达95％以上，且萌发质量好，无褐化现象。

本发明方法中麻疯树的无菌苗培育是以不添加激素的基础培养基MS为好，不仅成苗率高达90％，而且也节约成本。此外，由种子胚培育无菌苗的培养温度优选为25-29℃。

本发明方法中由无菌苗培育丛生芽的培养温度优选为25-29℃，且其快速繁殖培养基优选是在基础培养基中，添加0.3～0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤和0.15～0.3mg/L的3-吲哚乙酸组成。

本发明方法中由丛生芽培育生根并长成壮苗所用的生根培养基优选是在基础培养基中，添加0.1～0.3mg/L的α-萘乙酸组成。

本发明与现有技术相比，具有以下优点与积极效果：

1、增殖快  用本发明方法，由种子萌发形成可用作外植体的小苗(茎段3-5cm长)平均需时30天；作为3-5cm长的外植体单芽茎段接种后长成3-5cm长的丛生苗仅需21天，该丛生苗可一次又一次地用于克隆，至到第n次增殖；到需要长根时，取出2-3cm高的丛生苗接种到生根培养基，经历15天发出的根长度达2-3cm即可移栽。因而，如果从种子萌发的时间开始起算，到第1次增殖苗生根形成完整苗需时66天；到第2次增殖生根形成完整苗需时为87天；到第3次增殖生根形成完整苗需时为108天；以后依此类推，故而与现有技术相比，本发明比其他快繁技术更快捷。

2、变异小  如上所述，因本发明培育增殖苗需时短，种子萌发过程不需要激素，且外植体材料在培养过程中接触激素的时间短，所以由激素所引起的变异几率相对较少。此外，由于培养过程中所用的激素浓度也较小，尤其是没有使用如2，4-D等愈伤诱导力强同时也较易引起变异的激素，因而，本发明引起变异的几率非常小，更有利于保持原培养材料的优良种性。

3、繁殖系数高用本发明方法仅需3周时间，可使一颗种子萌发后产生的一颗小苗获得4.25棵小苗，平均增殖系数最高可达4.25，因而可满足大规模地种植麻疯树的需求。具体计算方法如下：

按一颗麻疯树种子一年的最高繁殖系数计算：在微繁殖过程中，种子萌发成无菌苗需要一个月，增殖率为1，即一粒种子没有增殖，仍然是一棵苗。这棵无菌苗切为一段，接种后21天可以得到4.25棵小苗，增殖率为4.25。以后每一个半月可以得到8棵小苗，即增殖率为8。所以本发明的增殖系数可用以下公式计算：

□＝4.25*8n

式中n＝继代次数，一年12个月，种子萌发一个月，接种的外植体当代需时21天，按一个月算；以后每增殖一代需时约45天，最后繁殖苗生根需时按一个月算，因此，一年中继代次数为6次。所以，

□＝4.25×8⁶＝4.25×262144＝1114112。

即一年中这棵麻疯树种子通过本发明一年可以增殖到百万苗之多。

4、成本低  本发明方法所用试剂不仅都为常用试剂，且所用种类单一，用量少，价格便宜，因而成本低。

具体实施方式

下面给出实施例以对本发明作出进一步说明，但所给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，因而本专业的技术人员根据上述本发明的内容和设计思想所作出的非本质的改进和调整也应属于本发明的保护范围。

实施例1

将成熟去壳的麻疯树种子用清水反复冲洗5次，再用清水浸泡3h后，移入超净工作台先用体积浓度75％酒精处理50s，无菌水冲洗3次，然后用质量浓度0.5％氯化汞溶液灭菌15min，无菌水冲洗3次。

取出灭菌后种子中的胚置于pH 5.4的基础培养基MS+30g/L蔗糖+5g/L琼脂中，然后在培养温度25℃，光照强度1500lx，按光照时间12h/d下培养5天后胚萌发为无菌苗。

将无菌苗分剪成单芽茎段置于pH 5.4的快速繁殖培养基MS+0.1mg/L 6-BA+0.15mg/L IBA+25g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度25℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d下培养15天后即可诱导出丛生芽。平均增殖系数1.0。

将生长至2-3cm长的丛生芽剪下接种于pH 5.4的生根培养基MS+0.1mg/L NAA+25g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度25℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d下培养7天开始生根，15天后生根率达到50％，根长达到2-3cm的壮苗即可移栽。

实施例2

将成熟去壳的麻疯树种子用清水反复冲洗4次，再用清水浸泡3h后，移入超净工作台先用体积浓度70％酒精处理30s，无菌水冲洗2次，然后用质量浓度0.4％氯化汞溶液灭菌17min，无菌水冲洗3次。

取出灭菌后种子中的胚置于pH5.6的基础培养基MS+30g/L蔗糖+5g/L琼脂中，然后在培养温度27℃，光照强度2000lx，按光照时间12h/d下培养5天后胚萌发为无菌苗。

将无菌苗分剪成单芽茎段置于pH5.6的快速繁殖培养基MS+0.3mg/L 6-BA+0.15mg/L IBA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度27℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d下培养7天后即可诱导出丛生芽。平均增殖系数3.25。

将生长至2-3cm长的丛生芽切下接种于pH5.6的生根培养基MS+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度27℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d下培养10天开始生根，15天后生根率达到33.3％，根长达到2-3cm的壮苗即可移栽。

实施例3

将成熟去壳的麻疯树种子用清水反复冲洗4次，再用清水浸泡3h后，移入超净工作台先用体积浓度80％酒精处理1min，无菌水冲洗3次，然后用质量浓度0.5％氯化汞溶液灭菌10min，无菌水冲洗2次。

取出灭菌后种子中的胚置于pH5.8的基础培养基MS+35g/L蔗糖+5g/L琼脂中，然后在培养温度29℃，光照强度2500lx，按光照时间12h/d下培养5天后胚萌发为无菌苗。

将无菌苗分切成单芽茎段置于pH5.8的快速繁殖培养基MS+0.5mg/L 6-BA+0.15mg/L IBA+35g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度29℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d下培养7天后即可诱导出丛生芽。平均增殖系数4.25。

将生长至2-3cm长的丛生芽切下接种于pH5.8的生根培养基MS+0.2mg/L NAA+35g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度29℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d下培养5天开始生根，15天后生根率达到70％，根长达到2-3cm的壮苗即可移栽。

实施例4

将成熟去壳的麻疯树种子用清水反复冲洗4次，再用清水浸泡3h后，移入超净工作台先用体积浓度80％酒精处理40s，无菌水冲洗3次，然后用质量浓度0.5％氯化汞溶液灭菌12min，无菌水冲洗2次。

取出灭菌后种子中的胚置于pH6.0的基础培养基MS+30g/L蔗糖+5g/L琼脂中，然后在培养温度35℃，光照强度3000lx，按光照时间12h/d下培养5天后胚萌发为无菌苗。

将无菌苗分切成单芽茎段置于pH6.0的快速繁殖培养基MS+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度35℃，光照强度3000lx，光照时间12h/d下培养11天后即可诱导出丛生芽。平均增殖系数2。

将生长至2-3cm长的丛生芽切下接种于pH6.0的生根培养基MS+0.2mg/L IBA+35g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度35℃，光照强度3000lx，光照时间12h/d下培养8天开始生根，15天后生根率达到46.67％，根长达到2-3cm的壮苗即可移栽。

实施例5

将成熟去壳的麻疯树种子用清水反复冲洗4次，再用清水浸泡3h后，移入超净工作台先用体积浓度70％酒精处理1min，无菌水冲洗3次，然后用质量浓度0.4％次氯酸钠溶液灭菌15min，无菌水冲洗3次。

取出灭菌后种子中的胚置于pH5.5的基础培养基MS+30g/L蔗糖+5g/L琼脂中，然后在培养温度32℃，光照强度2500lx，按光照时间12h/d下培养5天后胚萌发为无菌苗。

将无菌苗分切成单芽茎段置于pH5.5的快速繁殖培养基MS+0.4mg/L 6-BA+0.3mg/L IBA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度32℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d下培养9天后即可诱导出丛生芽。平均增殖系数3.5。

将生长至2-3cm长的丛生芽切下接种于pH5.5的生根培养基MS+0.3mg/L NAA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度32℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d下培养5天开始生根，15天后生根率达到83.33％，根长达到2-3cm的壮苗即可移栽。

实施例6

将成熟去壳的麻疯树种子用清水反复冲洗3次，再用清水浸泡3h后，移入超净工作台先用体积浓度75％酒精处理1min，无菌水冲洗3次，然后用质量浓度0.5％次氯酸钠溶液灭菌20min，无菌水冲洗3次。

取出灭菌后种子中的胚置于pH5.8的基础培养基MS+35g/L蔗糖+5g/L琼脂中，然后在培养温度28℃，光照强度2000lx，按光照时间12h/d下培养5天后胚萌发为无菌苗。

将无菌苗分切成单芽茎段置于pH5.8的快速繁殖培养基MS+0.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+35g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度28℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d下培养7天后即可诱导出丛生芽。平均增殖系数4.07。

将生长至2-3cm长的丛生芽剪下接种于pH5.8的生根培养基MS+0.1mg/L NAA+35g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度28℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d下培养6天开始生根，15天后生根率达到50％，根长达到2-3cm的壮苗即可移栽。

实施例7

将成熟去壳的麻疯树种子用清水反复冲洗3次，再用清水浸泡3h后，移入超净工作台先用体积浓度80％酒精处理30s，无菌水冲洗2次，然后用质量浓度0.45％次氯酸钠溶液灭菌16min，无菌水冲洗6次。

取出灭菌后种子中的胚置于pH5.8的基础培养基MS+25g/L蔗糖+5g/L琼脂中，然后在培养温度28℃，光照强度2000lx，按光照时间12h/d下培养5天后胚萌发为无菌苗。

将无菌苗分切成单芽茎段置于pH5.8的快速繁殖培养基MS+0.3mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+25g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度28℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d下培养12天后即可诱导出丛生芽。平均增殖系数2.5。

将生长至2-3cm长的丛生芽剪下接种于pH5.8的生根培养基MS+0.1mg/L NAA+25g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度28℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d下培养15天开始生根，基部产生大量愈伤组织，生根率达到25％，根长达到2-3cm的壮苗即可移栽。

实施例8

将成熟去壳的麻疯树种子用清水反复冲洗3次，再用清水浸泡3h后，移入超净工作台先用体积浓度75％酒精处理40s，无菌水冲洗3次，然后用质量浓度0.5％次氯酸钠溶液灭菌18min，无菌水冲洗3次。

取出灭菌后种子中的胚置于pH5.6的基础培养基MS+30g/L蔗糖+5g/L琼脂中，然后在培养温度26℃，光照强度2000lx，按光照时间12h/d下培养5天后胚萌发为无菌苗。

将无菌苗分切成单芽茎段置于pH5.6的快速繁殖培养基MS+0.1mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度26℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d下培养15天后即可诱导出丛生芽。平均增殖系数1.07。

将生长至2-3cm长的丛生芽切下接种于pH5.6的生根培养基MS+1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂中，在培养温度26℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d下培养15天开始生根，基部产生大量愈伤组织，生根率达到20％，根长达到2-3cm的壮苗即可移栽。