一种柑桔的转基因方法

摘要

本发明涉及一种柑桔的转基因方法。它包括试管砧木、外植体的准备，嫁接苗的制备，嫁接苗的创伤感染，拟转化芽的嫁接，拟转化植株的分子生物学鉴定，以获得转基因植株，转基因植株的嫁接，其特征在于：所述方法中嫁接苗的制备是选用第二、三代嫁接苗作为起始材料。本发明是一种能有效地解决柑桔可周年进行遗传转化操作的转基因方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种柑桔的转基因方法。它主要应用于柑桔类果树的品种改良。

背景技术

柑桔品种改良所应用的转基因方法很多，主要有外源DNA直接转化法和根癌农杆菌介导的转化法。

外源DNA直接转化法所使用的外植体为原生质体，而柑桔类果树中很多品种的原生质体培养周期长且再生困难，成本也较高，所以目前很少有实验室采用这种方法。

根癌农杆菌介导法所使用的外植体很多，有无菌实生苗的上胚轴切段、子叶切块、成年树茎段以及田间成年树腋芽等。利用无菌实生苗的上胚轴切段、子叶切块为外植体的遗传转化频率高，但获得的转基因植株要经过漫长的童期才能开花结实。而以成年树茎段为外植体所获得的转基因植株可以避开童期，但其出芽率和转化率极低。李卫等在《植物学报》上发表了《柑桔基因转化新方法的研究》(1997，39(8)：782-784)，他们是以田间成年树腋芽为外植体，采用附体腋芽转化-离体扩繁鉴定的方法转化柑桔，所获得的转化率为5.26％。但是这种方法在共培养过程中，需要不时的往棉球上添加出芽培养基保湿3天，而且获得转基因植株需要走试管内生根这一途径。但柑桔一年只抽梢三四次，因而在田间进行直接转化易受季节限制，操作麻烦，而且柑桔类果树试管内生根很困难，同时也带来质粒向环境释放的安全性问题。

何永睿等在《热带作物学报》上发表了《根癌农杆菌介导的柑桔遗传转化技术研究》(2004，25(1)：11-16)。该论文对柑桔成年树腋芽在不同BA、IAA质量浓度处理、不同创伤部位和是否用石蜡带包裹创伤口这三个方面的诱芽和转化率进行了研究，建立了一个通用、简单、快捷的柑桔遗传转化技术体系。但是在实际的操作过程中，用石蜡带包裹创伤口的操作难度大，且操作时间长，因而对植株的伤害很大，但是如果不用石蜡带包裹创伤口，同时在稀释液中加入高浓度的细胞分裂素(10mg/l)，则创伤口很容易失水并形成愈伤组织，很难再分化形成芽；同时，该方法是以第一代嫁接苗作为转化的起始材料，而在嫁接的过程中，需要木质化或半木质化的柑桔成年树枝条，因而取材容易受到季节限制，不可能周年进行遗传转化的操作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便的可周年进行遗传转化操作的柑桔的转基因方法。

本发明的目的是这样实现的：一种柑桔的转基因方法，包括试管砧木、外植体的准备，嫁接苗的制备，嫁接苗的创伤感染，拟转化芽的嫁接，拟转化植株的分子生物学鉴定，以获得转基因植株，转基因植株的嫁接，其特征在于：所述方法中嫁接苗的制备是选用第二、三代嫁接苗作为起始材料。

上述方法中选用第二、三代嫁接苗作为起始材料，是将第一代嫁接苗从接穗上水平切下，进行第二次嫁接，获得第二代嫁接苗；或将第二代嫁接苗的顶芽再次进行嫁接，获得第三代嫁接苗；以第二或第三代嫁接苗作为转化起始材料，接穗与砧木之间用石蜡带包缠。这样接穗和砧木的伤口愈合很牢固，而且在进行感染操作时就不会出现脱落的现象；同时经过多次嫁接，可以获得更多的转化起始材料，以实现周年进行转化操作的目的。

为了加快遗传转化的周期，试管砧木的准备过程中，种子剥种皮时要用消毒的脱脂棉进行固定。

上述试管砧木准备过程中的种子接种：无菌条件下用解剖刀将果实划开，取出种子，将种子放在脱脂棉上，剥去种皮，接种在已消毒的装有MS固体培养基的试管中；在28±2℃下暗培养，砧木长到7-10cm长以备用。

为了获得更高的转化效率，本发明在嫁接苗的创伤感染过程中采用5mg/l细胞分裂素，不进行包缠；将不定芽嫁接在试管砧木上，对拟转化植株的DNA，进行PCR和Southernbloting分析，获得转基因植株；练苗一周，以试管砧木作为中间砧，嫁接在田间砧木上，套袋保湿1-2周。

上述创伤感染过程中，转化起始材料保留了两片叶，从上往下，第二片叶的腋芽要进行完全创伤。对第二片叶的腋芽完全创伤后，第一片叶腋芽的创伤口上很容易萌发出不定芽，第二片叶的腋芽的创伤口处也可以萌发出不定芽，这样就可以获得更多的拟转化芽，有利于转化频率的提高。

本发明的有益效果：

1、在试管砧木的准备上，种子剥种皮时用消毒的脱脂棉进行固定，种皮容易剥离，种子的萌发速度快，可以加快遗传转化的周期；

2、选择第二、三代嫁接苗作为转化起始材料，接穗和砧木的伤口愈合很牢固，而且两者用石蜡带包缠，在进行感染操作时就不会出现脱落的问题。如果采用第一代嫁接苗作为转化起始材料，在第一代嫁接苗中接穗上萌发的腋芽与接穗的结合不是很牢固，如果直接在第一代嫁接苗上进行创伤感染，大概有80％的腋芽会脱落。

3、在转化过程中，维持整个植株的健壮生长是获得高诱芽率的必要条件，叶柄基部在感染的过程中多少会受到伤害，此时如果再用石蜡带包缠，很容易使叶片脱落，不利于整个植株的生长；为了避免伤口上愈伤组织的形成，本发明采用降低农杆菌稀释液中细胞分裂素的办法，采用5mg/l的细胞分裂素而不进行包缠。本发明之所以对保留了2片叶的第二、三代嫁接苗从上往下的第二片叶的腋芽进行完全创伤，是因为，如果不这样，对于切除了顶芽的第二、三代嫁接苗，第二片叶的腋芽萌发速度很快，长势也好，营养优先供应，则伤口处不易萌发出不定芽。

4、本发明不直接对不定芽进行PCR鉴定，是因为从伤口处长出来的不定芽很容易被质粒污染，同时因为用于提取DNA的叶片数量有限，没法进行Southernbloting分析，导致假阳性率增高；试管内的不定芽很嫩，水份含量也高，如果将不定芽直接嫁接在田间砧木上，则嫁接后很容易失水萎焉，导致嫁接成活率降低。本发明采用将不定芽嫁接在试管砧木上，随着植株的逐步长大，叶片也逐步增多(如果用于提取DNA的叶片不够的话，可以取拟转化植株的顶芽再进行一次试管内嫁接)，这样就可以对拟转化植株进行Southernbloting分析，对检测为转基因植株的，练苗一周，以试管砧木作为中间砧，嫁接在田间砧木上，套袋保湿1-2周，这样的嫁接成活率可高达95％以上。

5、经验证，运用本发明所述的柑桔转基因方法转化频率可以达到10％左右。彭爱红等发表在《分子植物育种》(2009，7(1)：51-55)上的论文《根癌农杆菌介导甲型肝炎病毒(HAV)衣壳蛋白融合基因转化柑桔成年材料的研究》中虽也提到10％的遗传转化率，但那只是实验室的统计结果，在由实验室转向田间的过程中，有相当的一部分转基因植株要死亡(如表1)。

表1：实验室的遗传转化率与田间的遗传转化率的差异

  实验室的转基因  植株(株)  实验室的  转化频率  田间的转基因  植株(株)  田间的转化频率  论文方法  25  10％  10  4％  本发明方法  25  10％  24  9.6％

总之，运用本发明所述的柑桔转基因方法田间的转化频率可以达到10％左右，同时本发明在获得转基因植株之前都是在室内进行的，因而可以有效地避免质粒向环境释放的可能且可以有效地避开柑桔的童期，嫁接到田间后2-3年就能开花结实。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不仅限于此。

实施例：

1、试管砧木的准备。

果实的准备：选取柑桔成熟的、完好的果实用自来水洗净表面，在超净工作台上用酒精表面消毒；

无菌脱脂棉的准备：用剪刀剪取一块长宽各10cm左右的脱脂棉，浸泡在75％的酒精中大约10分钟，拧干，以备用；

种子接种：无菌条件下用已消毒的解剖刀将果实划开，取出种子，将种子放在脱脂棉上，一手拿解剖刀，一手拿脱脂棉，剥去种皮，接种在已消毒的装有MS固体培养基的试管中；28℃±2℃下暗培养，砧木长到7-10cm长以备用。

本例的MS固体培养基，是在MS培养基的基础上附加30g/l的蔗糖和8.5g/l的琼脂，PH5.8。MS培养基的配方：(1)大量元素NH₄NO₃ 1650；KNO₃ 1900；CaCl₂·2H₂O 440；MgSO₄·7H₂O370；KH₂PO₄ 1700；(2)微量元素：KI 0.83；H₃BO₃ 6.2；MnSO₄·4H₂O 22.3；ZnSO₄·7H₂O8.6；Na₂MnO₄·2H₂O 0.25；CuSO₄·5H₂O 0.025；CoCl₂·6H₂O 0.025；FeSO4·7H₂O(27.8)+Na₂-EDTA·2H₂O(37.3)；(3)有机成分：肌醇100；烟酸0.5；盐酸吡哆醇(维生素B₆)0.5；盐酸硫胺素(维生素B₁)0.5；甘氨酸2，以上单位为mg/l。

2、外植体的准备。选取健壮的田间成年树枝条，去掉叶片，将枝条剪短，长度为5-10cm，洗净表面，并用自来水冲洗干净。在超净工作台上用0.1％(g/l)的升汞消毒10分钟左右，然后用无菌水冲洗干净，装在已消毒的培养皿中，以备用。

3、试管嫁接苗的制备。在超净工作台上，用嫁接刀切取枝条上的腋芽(切取的方法相当于田间切接的方法)；用镊子将砧木从试管中取出，放在培养皿中；用嫁接刀把试管砧木上半部分水平去掉，然后在中间开一个嫁接口，口的深度根据腋芽的大小而定，然后将腋芽镶嵌到砧木的嫁接口中，用已消毒的石蜡带(纯酒精浸泡6小时以上)完全包缠嫁接口，放在装有MS液体培养基的试管中(内含滤纸桥)，28±2℃下暗培养，直至腋芽萌发并长至约1cm长，见光(温度28±2℃，光照度40μmol/m²s，光照时间12h/d，以下同)，获得第一代嫁接苗；见光4-5天后，将第一代嫁接苗上的整个芽水平切下，在茎上用嫁接刀削去表皮层，露出形成层，将芽嫁接在试管砧木上，用石蜡带包缠嫁接口(相当于田间嫁接的切接)，放在装有MS液体培养基的试管中(内含滤纸桥)，在光照条件下继续培养，获得第二代嫁接苗；或将第二代嫁接苗的顶芽切除，嫁接在试管砧木上，获得第三代嫁接苗(嫁接的方法同上，培养条件同上)。

本例中，砧木保留的长度为3cm左右，腋芽不宜太小；培养基为MS液体培养基，在MS培养基的基础上附加50g/l的蔗糖，PH5.8(以下同)；嫁接苗的支撑物为滤纸桥，折叠的方法为：用一张正方形的滤纸对角形折叠，顶部剪一个口，然后打开，包在试管底部(口要在试管底部的中间，此试管应该比放嫁接苗的试管要小些)，然后顺着滤纸对角形的痕迹把滤纸包缠在试管上，取下，放在需要放嫁接苗的试管内(滤纸桥的高度大约为试管长度的1/3左右)，口朝上，嫁接苗就通过这个口把根放下去，子叶以上的部分在口以上。得到的第一代嫁接苗，苗的茎长要有0.5cm以上。其中嫁接刀、培养皿、镊子、MS液体培养基都需要消毒。

4、第二、三代嫁接苗的创伤、感染。

a)感染的起始材料：待第二、三代嫁接苗的伤口愈合，且具有两片完全展开的完整的叶片时，第二、三代嫁接苗就可以作为感染的起始材料；

b)工程菌液的制备：转化前挑选一个农杆菌菌株的单菌落接种于5ml液体培养基中，在28℃、黑暗下、120r/min培养至对数期(OD₆₀₀＝0.8-1.0)，转化时将其稀释5倍，稀释液为MS+BA5mg/l+IAA2.5mg/l(PH7.2)；

c)小棉球的准备：用脱脂棉挫成一个一个的小棉球，放在培养皿中，消毒备用；

d)创伤、感染：将小棉球放在已稀释的工程菌液中；在超净工作台上，将转化起始材料从试管中取出，放在培养皿中；用镊子将转化起始材料夹起，用嫁接刀将起始材料的顶芽沿着叶腋处水平切除，并将腋芽完全创伤；用浸有菌液和稀释液的小棉球包缠伤口，放在装有MS液体培养基的试管中(内含滤纸桥)；在黑暗的条件下共培养2-3天，温度28±2℃；然后在超净工作台上去掉小棉球，在光照的条件下继续培养。其中镊子、培养皿、嫁接刀、MS液体培养基都需要消毒。

5、拟转化芽的嫁接。

待伤口上长出的不定芽的茎有0.5cm长时，在超净工作台上将植株从试管中取出，放在培养皿中，用嫁接刀将不定芽水平切下，嫁接在试管砧木上，获得拟转化植株，在光照条件下培养。其中的培养皿、嫁接刀、镊子、MS液体培养基都需要消毒。

6、拟转化植株的分子生物学鉴定。

在超净工作台上，将拟转化植株从试管内取出，用嫁接刀切取拟转化植株的一部分叶片(剩下的部分仍然放在MS液体培养基中)，用于提取拟转化植株的DNA，进行PCR和Southernbloting分析，获得转基因植株。其中的培养皿、嫁接刀、镊子、MS液体培养基都需要消毒。

7、转基因植株的田间嫁接：对确定为转基因植株的，将试管苗放在窗台上练苗一周；然后从试管砧木的子叶处水平切下转基因植株，按照田间切接的方法将其嫁接在田间砧木上，用塑料袋保湿1-2个星期。

本发明将柑桔果实保存在4-8℃的冷库或冰箱中，以达到周年供应柑桔砧木的目的。本发明是以第二、三代嫁接苗作为转化的起始材料，柑桔的腋芽为复芽，当第一代嫁接苗的整个芽水平切下后(切下部分用于嫁接，获得第二代嫁接苗)，再将第一代嫁接苗放在装有MS液体培养基的试管中(内含滤纸桥)，暗培养，温度同上，则从腋芽处还会萌发出新的芽，再次进行嫁接，还可获得第二代嫁接苗；同时也可以取第二代嫁接苗的顶芽再次进行嫁接(剩下的第二代嫁接苗继续培养在光照的条件下，温度同上)，获得第三代嫁接苗；从而可以获得更多的转化起始材料，同时也可以实现周年进行遗传转化操作的目的。

本发明创建的以成年树腋芽为外植体的根癌农杆菌介导法是在人工设置的温度28±2℃、光照度40μmol/m²s、光照时间12h/d的条件下进行的，可以打破柑桔的自然休眠期，因而可以周年进行遗传转化操作；再者，在共培养的过程中，只需把浸有菌液和稀释液(MS+BA5mg/l+IAA2.5mg/l)的小棉球放在伤口上，从而简化了操作程序；三者，从伤口上长出的不定芽嫁接到试管砧木上，经检测，确定为转基因植株的再嫁接到田间砧木上，从而避免了试管内生根这一途径。