一种提高发酵生产的聚羟基脂肪酸酯中3－羟基戊酸单体含量的方法

摘要

本发明提供了一种提高发酵生产的聚羟基脂肪酸酯中3－羟基戊酸单体含量的方法，包括在生产所述聚羟基脂肪酸酯的微生物中过表达丙酸通透酶，其中所述聚羟基脂肪酸酯中包含3－羟基戊酸单体。实验证明，丙酸通透酶在微生物宿主中的过表达能够明显提高所生产的聚羟基脂肪酸酯中3－羟基戊酸单体的摩尔百分含量。

说明书

技术领域

[0001]本发明涉及微生物基因工程领域，更具体地说，本发明涉及一种通过在微生物宿主中过表达丙酸通透酶从而提高发酵生产的聚羟基脂肪酸酯中3-羟基戊酸单体含量的方法。

背景技术

[0002]聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是微生物在不平衡的生长环境(如缺乏氮、氧、磷、镁等)下积累的能源和碳源贮藏物(Doiand Steinbüchel，2002)。PHA之所以广泛引起人们的兴趣是因为它们具有和普通热塑性材料和弹性体相似的性质，这使它们成为一种可降解、可再生的潜在生物材料(Poirier et al.，1995)。PHA单体种类多样，单体链长分布范围很广，这就使不同单体组成的PHA材料性质迥异，从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体各有不同。

[0003]3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯(poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate，简称PHBV)是PHA家族的重要成员，由3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基戊酸(3HV)两种单体组成，具有比聚羟基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate，PHB)更优良的低脆性和低结晶性，更适合商业应用，已经被ICI公司工业化生产，商品名是Biopol。生产菌是能天然积累PHA的菌株Ralstonia eutropha(先前叫Alcaligenes eutropha)，采用葡萄糖和丙酸作为底物(Byrom et al.，1987；Braunegg et al.，1998)。

[0004]PHBV中单体组成的控制是非常重要的，因为共聚物中3HV的摩尔含量直接影响到材料的物理和机械性质。例如，低3HV摩尔含量(～5mol％)的PHBV因为质地坚硬可以用来做洗发水的瓶盖，而3HV摩尔含量在10-20mol％的PHBV可以做瓶体，因为它具有很强的韧性，经久耐用(Cox，1994)。

[0005]先前的研究者主要采用改变培养基中丙酸浓度来调节3HV含量(Choi and Lee，1999；Fidler and Dennis，1992；Slater et al.，1992，1998；Yim etal.，1996)，但是，培养基中过高的丙酸浓度对生产菌的生长和PHA的积累有不利作用。而且为了降低PHA的生产成本，往往采用便宜的废弃物作为碳源，在这些碳源中的成分是没法人为改变的，因此，通过改变培养基中丙酸浓度的方法来调节3HV含量就变得不可实现。

[0006]为了实现在碳源不变的情况下改变PHBV的3HV含量，一种可选的策略是利用代谢工程技术改变PHBV合成的代谢路径来调节3HV的含量，比如，Aldor和Keasling构建了一个系统，他们把一个编码丙酸辅酶A合成酶(propionyl-CoA synthetase)的基因prpE和PHA合成操纵子phaBCA(来自A cinetobacter spv.RA3849)在宿主Salmonella enterica serovarTyphinurium(缺失丙酸激活能力)中共表达，prpE和phaBCA分别由不同的启动子控制，通过调整IPTG的加入量来诱导prpE基因的表达水平，进而达到控制3HV在PHBV中的摩尔含量的目的，取得了好的效果(Aldor andKeasling，2001)。

[0007]在PHBV的代谢路径中，3HB由两个乙酰辅酶A(acetyl-CoA)经3-酮基硫解酶(3-ketothiolase enzyme，PhaA)和NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶(NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase，PhaB)催化合成，3HV由一个乙酰辅酶A和一个丙酰辅酶A(propionyl-CoA)经PhaA和PhaB催化合成。

[0008]丙酸通透酶(propionate permease)由prpP基因编码。丙酸通透酶可以增强细胞膜对丙酸盐(propionate)的通透性，使其更多地进入体内，

[0009]丙酸盐在体内的3-酮基硫解酶(PhaA)或者丙酰辅酶A合成酶(propionyl-CoA synthetase)的催化下转变为丙酰辅酶A(propionyl-CoA)，然后丙酰辅酶A和乙酰辅酶A在乙酰乙酰辅酶A还原酶的催化下生成3-羟基戊酰辅酶A(3-Hydroxyvaleryl-CoA)从而使更多的3-羟基戊酰辅酶A参与PHBV的合成(Aldor and Keasling，2001)。

发明内容

[0010]本发明的目的是在不增加丙酸盐供给的前提下，提高发酵生产的PHA中3HV的含量。

[0011]不受任何特定理论的约束，发明人认为，通过在能够生产PHA的微生物宿主菌中过表达丙酸通透酶，可以改善细胞膜对丙酸盐的转运，使更多的丙酸盐透过细胞膜进入宿主菌体内参与PHA的合成，从而增加PHA中3HV单体的含量。

[0012]因此，本发明提供了一种提高发酵生产的聚羟基脂肪酸酯中3-羟基戊酸单体含量的方法，包括在生产所述聚羟基脂肪酸酯的微生物中过表达丙酸通透酶，其中所述聚羟基脂肪酸酯中包含3-羟基戊酸单体。

[0013]本发明的方法特别适用于3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯(PHBV)的生产。

[0014]实验证明，丙酸通透酶在微生物宿主，例如罗氏真养杆菌Ralstonia eutropha H16和大肠杆菌Escherichia coli XL 10-Gold，中的过表达能够明显提高所生产的PHA中3HV的摩尔百分含量。

附图说明

[0015]图1显示了本发明所构建的质粒PCS2-L01。

[0016]图2显示了本发明所构建的质粒pBHR68-prpP。

[0017]图3A和图3B分别显示了本发明实施例中所采用的丙酸通透酶的氨基酸序列和基因序列。

[0018]图4显示了本发明实施例中克隆丙酸通透酶所采用的引物。

[0019]表1显示了本发明具体实施方式中所用到的菌种和质粒。

[0020]表2显示了在重组R.eutropha H16中过表达丙酸通透酶对PHBV中3HV摩尔含量的影响。

[0021]表3显示了在重组大肠杆菌Escherichia coli XL10-Gold中过表达丙酸通透酶对PHBV中3HV摩尔含量的影响。

具体实施方式

[0022]本文所用的术语“CDW”是指细胞干重(Cell Dry Weight)。

[0023]本文所用的术语“PHA”是指聚羟基脂肪酸酯；“PHBV”是指3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯。本文所用的术语“3HV”是指3-羟基戊酸。

[0024]本文所用的术语“丙酸通透酶”(propionate permease)是指具有丙酸盐跨膜转运活性的酶。一种特别优选的丙酸通透酶的氨基酸序列如图3A所示，其来自R.eutropha H16。本领域技术人员可以理解，本发明所采用的丙酸通透酶并不限于任何特定的来源，只要其具有丙酸盐跨膜转运的功能即可。

[0025]在不改变丙酸通透酶的生物活性的前提下，本领域技术人员可以对其进行某些修饰，例如引入一个或几个氨基酸残基的删除、添加和/或替换。

[0026]本发明提供了一种提高发酵生产的聚羟基脂肪酸酯中3-羟基戊酸单体含量的方法，包括在生产所述聚羟基脂肪酸酯的微生物中过表达丙酸通透酶，其中所述聚羟基脂肪酸酯中包含3-羟基戊酸单体。

[0027]此处的“微生物”是指能够生产PHA的各种类型的微生物，包括细菌、酵母菌等。所述微生物可以天然地具有生产PHA的能力，也可以是在通过基因工程引入PHA合成相关基因后才获得了生产PHA的能力。有些情况下，微生物可能天然地具有一定的生产PHA的能力，但是产率较低，通过基因工程引入PHA合成相关基因后，可以改善其产率。特别优选的微生物宿主是罗氏真养杆菌和大肠杆菌。

[0028]此处“PHA合成相关基因”是指不同类型的PHA合成代谢过程中所必需的基因，包括来自不同菌属的PHA合酶(PHA synthase，PhaC)、3-酮基硫解酶(3-ketothiolase enzyme，PhaA)和NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶(NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase，PhaB)或者R-构象特异性的烯酰辅酶A水合酶((R)-Specific Enoyl Coenzyme A Hydratase)。关于PHA合成相关基因以及有关基因工程操作的介绍参见(Steinbüchel，1998；Doi，2000；Rehm，2003)。PHA合成相关基因包括外来的或宿主微生物原有的合成PHA所需要的任何基因，例如Ralstonia eutropha本身具有合成PHA的能力，而本身不能积累PHA的Escherichia coli在获得Ralstonia eutropha的PHA合成相关基因后即可以合成PHA(Steinbüchel，1988；Slater，1992)。PHA合成相关基因还包括合成PHA非必须，但可以改善PHA生产的任何基因，例如颗粒结合蛋白(PHA granule associated protein，phasin)(Sinskey，2001)。

[0029]可以将携带丙酸通透酶编码基因的表达载体转化到所述微生物宿主中。转化的方法可以是本领域常用的任何方法，例如氯化钙法、电穿孔法、结合转化法等。优选的表达载体包括质粒，例如pBHR68-prpP和PCS2-L01。表达载体在进入宿主菌后，可以以质粒的形式存在，也可以整合到宿主菌基因组中。在一个优选的实施方式中，丙酸通透酶编码基因为prpP，其核苷酸序列如图3B所示。丙酸通透酶编码基因可以从天然表达丙酸通透酶的微生物(例如Ralstonia eutropha)中克隆，也可以人工合成。

[0030]本文所用的术语“过表达”是指某种物质，例如蛋白质或基因，在微生物内的表达量超过正常水平。

[0031]优选地，所述微生物可以天然地表达丙酸通透酶，此时通过引入携带丙酸通透酶编码基因的表达载体，可以增强其丙酸通透酶的表达量，从而实现丙酸通透酶的过表达。所述微生物也可以天然地不具有表达丙酸通透酶的能力，此时可以通过基因工程引入相关基因赋予其表达丙酸通透酶的能力，从而实现丙酸通透酶的过表达。

[0032]当宿主不具有PHA生产能力或者生产能力低下时，可以将PHA合成相关基因导入宿主中，以赋予和/或改善其PHA生产能力。此时，PHA合成相关基因与丙酸通透酶编码基因可以被克隆于相同的表达载体上，也可以克隆于不同的表达载体上；它们可以在同一个启动子控制下，也可以在各自的启动子控制下表达。在共表达载体中，丙酸通透酶基因与PHA合成相关基因在排列上没有限制，只要能够达到正确表达的目的即可。所述共表达载体可以是需IPTG诱导的载体，也可以是没有操纵子基因，不需IPTG诱导的载体。丙酸通透酶基因与PHA合成相关基因可以同时表达，也可以是可控的先后表达。

[0033]本发明的方法特别适用于3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯的生产。

[0034]在优选的实施方案中，首先从丙酸通透酶供体菌中克隆得到丙酸通透酶基因，然后构建丙酸通透酶表达载体或丙酸通透酶基因与PHA合成相关基因共表达载体，将共表达载体转入宿主菌生产PHBV，如果宿主菌本身就具有积累PHBV能力，可以只把丙酸通透酶表达载体转入其中。实验证明，本发明中丙酸通透酶在罗氏真养杆菌Ralstonia eutropha H16和大肠杆菌Escherichia coli XL10-Gold中的过表达能够明显提高PHBV中3HV的摩尔百分含量。

[0035]实验中所用到的菌种和质粒见表1，限制性内切酶均购自NEB公司，PrimeSTAR HS DNA Polymerase购自Takara公司，DNA ligation Ver.2.0购自Takara公司，其他生化试剂购自上海生物工程有限公司，引物的合成与DNA测序服务均由invitrogen广州公司完成，质粒提取试剂盒、PCR/DNA纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒均购自碧云天生物技术研究所，DNA连接、酶切、转化、接合转化及其它基因操作的标准方法参考《分子克隆实验指南》(Sambrook等，1989)。

[0036]为了更加详细地解释本发明，下面将结合附图给出本发明的实施例。这些实施例仅仅是出于解释和说明的目的，不应该被理解为是对本发明范围的限制。

实施例1丙酸通透酶基因的克隆和表达载体的构建以及用R.eutropha H16重组菌生产PHBV

[0037]R.eutropha H16天然地表达丙酸通透酶并且能够生产PHBV。本实施例旨在研究在R.eutropha H16中过表达丙酸通透酶对PHBV中的3HV摩尔含量的影响。

1.prpP基因的克隆和质粒PCS2-L01的构建

[0038]合成引物cs-kpn1和cs-ecor1，其序列如图4所示，其中引物cs-kpn1带有酶切位点KpnI，引物cs-ecor1带有酶切位点EcoRI。提取R.eutropha H16(DSM 428)基因组作为PCR模板，PCR反应条件为：每个循环解链98℃，10秒钟，退火63℃，10秒钟，延伸72℃，2分钟，共30个循环。prpP片段(1392bp)切胶回收，-20℃保存。用EcoRI和KpnI分别双酶切prpP片段和广宿主质粒pBBR1MCS-2(NCCB 3434)。然后，按试剂盒操作说明纯化酶切后的prpP片段和线性pBBR1MCS-2片段进行连接实验。按标准的方法转化连接产物到E.coli S17-1(ATCC 47055)中，分别挑取数个单菌落于3ml LB培养基中，37℃培养过夜。从每个扩增菌中提取质粒后，酶切验证，筛选出正确克隆的质粒，测序验证插入序列的正确性。命名正确克隆的质粒为PCS2-L01(图1)。

2.通过结合转化将质粒PCS2-L01从E.coli S17-1转入R.eutropha H16。

[0039]挑选重组E.coli S17-1和R.eutropha H16单菌落分别在5ml LB培养基中培养，E.coli S17-1加50μg/ml的卡那霉素，37℃，200rpm培养过夜；R.eutropha H16加入10μg/ml庆大霉素，30℃，200rpm培养过夜。取新鲜培养好的两种种子液各1ml在备用无菌试管内混匀，室温放置约5～7分钟。取50μl的混合液在含有卡那霉素(50μg/ml)和庆大霉素(10μg/ml)双抗LB平板中涂匀，筛选得到含有质粒PCS2-L01的重组R.eutropha H16。

3.重组R.eutropha H16生产PHBV

[0040]实验中所有摇瓶培养均在含有100ml培养基的500ml摇瓶中进行。重组R.eutropha H16的培养条件：重组R.eutropha H16在LB培养基中培养过夜作为种子液，按照2％的接种量将种子液接种到100ml发酵培养基(MM培养基)中，并加入15g/L葡萄糖酸钠、50mg/L卡纳霉素，30℃、200rpm培养72小时。其中1.5g/L的丙酸钠在培养12小时后加入。作为对照实验，野生型R.eutropha H16也在相同的条件下和重组R.eutropha H16一同培养。

[0041]摇瓶培养72小时后，离心(9000rpm，10分钟)收集菌体，收集的细胞用蒸馏水洗涤两次。冰冻干燥，计算细胞干重(CDW)。用电子天平精确称量并记录约40mg左右的样品物质，加入2ml酯化液(甲醇∶浓硫酸为97∶3，苯甲酸2g/L作为内标)及2ml氯仿，加盖密闭。100℃烘箱中酯化4小时。冷却至室温后，加入2ml蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层。待氯仿相与水相完全分离后，取氯仿相进行气相色谱分析。

[0042]实验结果表明，R.eutropha H16中丙酸通透酶的过表达能明显提高3HV在PHBV中的摩尔含量。重组R.eutropha H16的3HV摩尔含量是野生R.eutropha H16的1.5倍(表2)。

实施例2丙酸通透酶基因的克隆和表达载体的构建以及用E.coli H16重组菌生产PHBV

1.prpP基因的克隆和质粒pBHR68-prpP的构建

[0043]合成引物EcoR-P和Hind-P，其序列如图4所示，其中引物Hind-P带有酶切位点HindIII，引物EcoR-P带有酶切位点EcoRI。提取R.eutropha H16(DSM 428)基因组作为PCR模板，PCR反应条件为：每个循环解链98℃，10秒钟，退火63℃，10秒钟，延伸72℃，2分钟，共30个循环。切胶回收prpP片段，-20℃保存。用EcoRI和HindIII分别双酶切prpP片段和质粒pBHR68(DSM 15372，质粒中含有R.eutropha H16来源的PHB合成操纵子)，然后，按试剂盒操作说明纯化酶切后的prpP片段和线性pBHR68片段进行连接实验。按标准的方法转化连接产物到E.coli XL10-Gold(stratagene)中，分别挑取数个单菌落于3ml LB培养基中，37℃培养过夜。从每个扩增菌中提取质粒后，酶切验证，筛选出正确克隆的质粒，测序验证插入序列的正确性。命名含有PHA合成操纵子(phaCAB)和丙酸通透酶基因(prpP)的质粒为pBHR68-prpP(图2)。

2.重组E.coli XL10-Gold转化子生产PHBV

[0044]实验中所有摇瓶培养均在含有100ml培养基的500ml摇瓶中进行。重组E.coli XL10-Gold的培养条件：重组E.coli XL10-Gold在LB培养基中37℃、200rpm培养过夜作为种子液，按照2％的接种量将种子液接种到100ml M9培养基(Sambrook & Russel，2001)(补加0.01％酵母粉)中，并加入15g/L葡萄糖、100mg/L氨苄青霉素，37℃、200rpm培养60小时。其中1.5g/L的丙酸钠在培养12小时后加入。作为对照实验，携带有质粒pBHR68的E.coli XL10-Gold也在相同的条件下一同培养。

[0045]摇瓶培养60小时后，离心(9000rpm，10分钟)收集菌体，收集的细胞用蒸馏水洗涤两次。冰冻干燥，计算细胞干重(CDW)。用电子天平精确称量并记录约40mg左右的样品物质，加入2ml酯化液(甲醇∶浓硫酸为97∶3，苯甲酸2g/L作为内标)及2ml氯仿，加盖密闭。100℃烘箱中酯化4小时。冷却至室温后，加入2ml蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层。待氯仿相与水相完全分离后，取氯仿相进行气相色谱分析。

[0046]实验结果表明，丙酸通透酶在E.coli XL10-Gold的过表达能明显提高3HV在PHBV中的摩尔含量。在重组E.coli XL10-Gold中过表达丙酸通透酶基因和PHB操纵子基因，比只表达PHB操纵子基因得到更高3HV含量的PHBV(表3)。

[0047]本发明中所涉及的参考文献，包括专利文件、学术论文、出版物等，均以引用的方式将其全部内容包括在本发明中。

[0048]应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

[0049]参考文献

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[0050]表1.本发明中所用到的菌种和质粒

[0051]表2重组R.eutropha H16过表达丙酸通透酶对PHBV中3HV摩尔含量的影响

[0052]表3重组E.coli XL10-Gold过表达丙酸通透酶对PHBV中3HV摩尔含量的影响