大肠杆菌热敏性肠毒素双突变体作为疫苗黏膜免疫佐剂

摘要

本发明公开了一种分离的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白，所述蛋白的A亚基相对于野生型大肠杆菌热敏性肠毒素的A亚基，其氨基酸序列第63位为K，且第192位为G；或其第72位为R，且第192位为G。本发明还公开了所述蛋白的编码基因，含有所述基因的载体或细胞，含有所述蛋白的佐剂组合物，以及所述蛋白的生产方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及大肠杆菌热敏性肠毒素双突变体，其编码基因，含有该基因的载体或细胞，含有该蛋白的佐剂组合物，以及该蛋白的生产方法。

背景技术

黏膜免疫是机体免疫防御体系中重要的一环，通过黏膜进行免疫预防不仅能诱导黏膜部位产生免疫抗体，还可刺激全身性的免疫应答，因此黏膜免疫接种是预防呼吸道、消化道系统疾病的最佳免疫途径。但由于许多疫苗在黏膜接种时诱导产生的抗体水平低，不能产生足够的免疫保护，因此需要合适的黏膜佐剂配合，才能诱导出具较高水平的黏膜IgA抗体。目前研究的黏膜免疫佐剂有很多种，其中由细菌代谢产物，热敏性肠毒素和霍乱菌毒素作为疫苗黏膜免疫佐剂的研究尤为令人关注。

Enterotoxic Escherichia coli(ETEC)所产生的热敏性肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)是引起人及哺乳动物腹泻的毒素之一，由1个A亚基和5个B亚基所组成。B亚基主要可调控LT与细胞膜上的GM1结合，A亚基具有ADP-核糖转移酶活性，是主要的毒力因子。完整的LT A亚基可被胰酶裂解为A1和A2，A2位于A1的C末端，二者以二硫键相连，其中A1是毒性部位，A2与LT B亚基相连。进入靶细胞后，二硫键被还原，LT表现出毒性。

许多研究表明，LT是一种有潜力的黏膜免疫佐剂，但由于LT具有很强的毒性而限制了其在临床上的应用。目前人们正试图通过定点突变技术，达到降低LT毒性、同时又保留其佐剂功能的目的。研究发现与LT的毒性相关的位点主要集中在A亚基上，通过改变氨基酸位点可达到降低LT毒性的目的。很多位点的突变都会影响其ADP-核糖转移酶活性，比较常见的有第7、44、49、50、63、72、110、112、146等位点的突变体，这些突变体分别表现出不同程度的残余毒性和不同程度的佐剂活性，结论不一。

现有技术中的LT突变体研究主要集中在单一位点突变体构建上，而单一位点突变体毒性可能没有完全丧失，并且出现回复突变而重新获得毒力的机率较大。而构建多位点的LT突变体，理论上其回复突变的可能性就会降低，然而多位点的突变是否会影响LT作为黏膜免疫佐剂的活性还未可知，且还需要寻找合适的多突变位置组合，以使LT在毒性降到最低的情况下发挥尽可能强的免疫佐剂活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毒性低、免疫佐剂活性优异的大肠杆菌热敏性肠毒素双突变体，其编码基因，含有该基因的载体或细胞，含有该蛋白的佐剂组合物，以及该蛋白的生产方法。

在本发明的第一方面，提供一种分离的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白，所述的蛋白包括大肠杆菌热敏性肠毒素蛋白的A亚基和B亚基，且该A亚基的氨基酸序列相对于野生型大肠杆菌热敏性肠毒素的A亚基的氨基酸序列，

其第63位为K，且第192位为G；

其第72位为R，且第192位为G；或

其第63位为K，第72位为R，且第192位为G。

在另一优选例中，所述的蛋白含有1个大肠杆菌热敏性肠毒素蛋白的A亚基，和5个大肠杆菌热敏性肠毒素蛋白的B亚基。

在另一优选例中，所述的蛋白基本上由大肠杆菌热敏性肠毒素A亚基和B亚基构成。

在另一优选例中，所述的蛋白基本上由1个A亚基和5个B亚基复合而成。

在本发明的第二方面，提供一种分离的核酸，所述的核酸编码所述的蛋白。

在本发明的第三方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸。

在本发明的第四方面，提供一种细胞，所述的细胞内含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的核酸。

在本发明的第五方面，提供一种生产所述的蛋白的方法，包括：在适于表达的条件下，培养所述的细胞，从而表达所述的蛋白。

在另一优选例中，所述的方法包括：

(1)在细胞内表达大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的A亚基和B亚基；

(2)收集(1)的细胞，用变性剂重悬后将细胞破碎；

(3)将(2)的细胞破碎产物混匀，离心收集上清；

(4)从(3)获得的上清中分离含有A亚基与B亚基的蛋白，复性，获得所需蛋白。

在另一优选例中，所述的变性剂是NTA0。

在另一优选例中，所述的NTA0含有：Tris-HCl，NaCl，和甘油。

在另一优选例中，所述的NTA0的配方是：20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/LNaCl，10％甘油。

在另一优选例中，所述的细胞是大肠杆菌细胞。

在本发明的第六方面，提供所述的蛋白的用途，用于制备黏膜免疫的佐剂。

在本发明的第七方面，提供一种用于黏膜免疫的组合物，所述的组合物含有：有效量的所述的蛋白，作为黏膜免疫的佐剂。

在另一优选例中，含有所述的蛋白的有效量为0.0001-20wt％(更佳的为0.001-10wt％)。

在另一优选例中，所述的组合物中还含有：有效量(如0.0001-20wt％；更佳的为0.001-10wt％)的黏膜免疫的疫苗。

附图说明

图1显示了pET30a-LTK63/G192的琼脂糖凝胶电泳分析。

其中，1：LTK63/G192I；2：LTK63/G192II；3：PCR扩增LTK63/G192基因；4：DL 2000；5：重组质粒双酶切鉴定；6：pET30a-LTK63/G192重组质粒PCR鉴定。

图2显示了pET30a-LTR72/G192的琼脂糖凝胶电泳分析。

其中，1：LTR72/G192I；2：LTR72/G192II；3：LTR72/G192；4：PCR扩增LTR72/G192基因；5：重组质粒双酶切鉴定；6：DL 2000。

图3A显示了LTK63/G192诱导表达。其中，1：诱导后；2：诱导前；3：蛋白marker。

图3B显示了LTK63/G192蛋白纯化。其中，1：蛋白marker；2：LTK63/G192蛋白纯化后；3：杂蛋白。

图3C显示了Western-Blot检测。其中，1：LTK63/G192；2：LTR72/G192；3：蛋白marker。

图4显示了LT和LT各突变体的Patent-mouse活体毒性检测结果。

PBS组的G/C(肠重/尸重)值为0.071±0.0057；LT，0.101±0.0035；LTK63，0.073±0.0057；LTR72，0.081±0.0084；LTG192，0.091±0.0053，LTK63/R72，0.075±0.0031；LTK63/G192，0.080±0.0027；LTR72/G192，0.081±0.0027误差是±s s，n＝5。

图5显示了ELISA检测抗体水平的结果。图5A显示了血清Anti-NDV IgG检测；图5B显示了鼻洗液Anti-NDV IgA检测；其中，

a：NDV；b：NDV+LT；c：NDV+LTK63；d：NDV+LTR72；e：NDV+LTG192；f：NDV+LTK63/G192；g：NDV+LTR72/G192；h：NDV+LTK63/R72。

“□”第0天采样；“■”第11天采样；第25天采样；第35天采样。

具体实施方式

本发明人在研究中意外地发现，将大肠杆菌热敏性肠毒素第63位突变为K且第192位突变为G(LTK63/G192)，或者将大肠杆菌热敏性肠毒素第72位突变为R且第192位突变为G(LTR72/G192)后，获得的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体的毒性显著降低，且具有优异的免疫佐剂活性。此外，由于对大肠杆菌热敏性肠毒素进行了双位点突变，获得的突变体不易发生回复突变，作为佐剂效果更稳定。

本发明人设计了多种针对大肠杆菌热敏性肠毒素蛋白A亚基的单位点突变或多位点突变形式，并对这些突变方式进行了深入的研究。经毒性分析和酶活性试验，对各突变体的生物学活性进行了检测，证实LTK63/G192和LTR72/G192这两个突变体毒性显著降低，且黏膜佐剂活性优异，与无关抗原经滴鼻途径免疫接种小鼠，证实可显著提高血清抗体和局部分泌型抗体，因此突变体LTK63/G192、LTR72/G192可开发为动物疫苗的黏膜佐剂。

在本发明中，除非另外说明，术语“大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白”、“大肠杆菌热敏性肠毒素突变体多肽”、“大肠杆菌热敏性肠毒素突变体”，“大肠杆菌不耐热肠毒素双突变体”或“LT突变体”可互换使用，都指具有对应于野生型大肠杆菌热敏性肠毒素的氨基酸序列而言，第63位突变为K，第192位突变为G的序列；或对应于野生型大肠杆菌热敏性肠毒素的氨基酸序列而言，第72位突变为R，第192位突变为G的序列的蛋白；或者是对应于野生型大肠杆菌热敏性肠毒素的氨基酸序列而言，第63位突变为K，第72位突变为R且第192位突变为G的序列。当然，一些非活性相关位点上还可发生氨基酸的等同替换，例如某些氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白或多肽”是指大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化该蛋白。本发明的蛋白可使用重组技术，从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母)中产生。

作为本发明的优选方式，所述的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白包括A亚基，且该亚基的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：2所示的序列(其编码序列如SEQ IDNO：1)，其第63位为K，且第192位为G；或其第72位为R，且第192位为G。

作为更优选的方式，所述的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白还包括B亚基(SEQ ID NO：4，其编码序列如SEQ ID NO：3)。更佳地，所述的蛋白基本上由大肠杆菌热敏性肠毒素A亚基和B亚基构成。最佳的，所述的蛋白基本上由1个A亚基和5个B亚基复合而成，这种结构的蛋白具有更理想的免疫佐剂效果。

将突变引入到野生型大肠杆菌热敏性肠毒素蛋白序列中的方法是本领域人员已知的。例如，通过设计含突变位点的引物来PCR扩增野生型的大肠杆菌热敏性肠毒素蛋白的编码序列，从扩增产物中筛选出被引入突变的基因产物，利用该基因产物生成突变型的蛋白。此外，也可利用人工合成的方式合成序列中含有突变位点的蛋白。

本发明还包括编码所述蛋白的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链的或是双链的。术语“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据编码所述蛋白的多核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明蛋白的编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

优选的，所述的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白在大肠杆菌中表达，由于大肠杆菌热敏性肠毒素本身来源于大肠杆菌，因此利用大肠杆菌进行表达所获得的蛋白活性良好。

在本发明的较佳实例中，对本发明的突变体蛋白的表达进行了改进，从而获得与天然状态下的LT蛋白A亚基和B亚基的比例以及空间结构基本相同的LT突变体蛋白。本发明人发现，A亚基和B亚基同时在细菌内被表达后，A亚基基本形成包涵体，B亚基由于较小，一部分形成包涵体，另一部分表达为可溶形式。为保证A、B亚基不被分离或比例失调，故选择离心所得的细菌沉淀直接使用变性剂(优选NTA0)重悬，充分搅拌后离心收集上清。这样A亚基和B亚基仍然在一起，且不打乱A亚基和B亚基之间的比例；复性后，大肠杆菌不耐热肠毒素结构不被破坏。而如根据现有常规的操作，在离心获得细胞沉淀后，先进行破菌处理再用变性剂处理包涵体，则将使得大部分B亚基被去除，从而使得后续获得的蛋白构型与天然状态不同。

本发明中，所述的多核苷酸序列可插入到表达载体中。术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明的多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的重组表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白，这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在本发明的较佳实例中，本发明人利用重叠延伸PCR扩增技术体外获得大肠杆菌不耐热肠毒素双突变体LTK63/G192和LTR72/G192全基因片段，酶切和测序结果表明构建的表达载体pET30a-LTK63/G192、pET30a-LTR72/G192阅读框架正确，且相应位点氨基酸获得了替换。诱导表达产物用SDS-PAGE检测，各个突变体均表达出约33.0Ku和13.0Ku的两个蛋白带，与LTA、LTB亚基分子量相吻合；Western-blot检测，两个蛋白带均可与抗His抗体发生特异性免疫反应。ADP-核糖转移酶活性试验分析，两个突变体蛋白酶活性均低于野生型LT蛋白，但仍保留一些酶活性。Patent-mouse毒性试验检测，LTK63/G192和LTR72/G192突变体蛋白的毒性均很低。用该两个蛋白作为NDV的佐剂经滴鼻途径免疫小鼠，结果显示LTK63/G192和LTR72/G192均有较高的佐剂活性。

本发明还提供了所述的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的用途，用于制备黏膜免疫的佐剂，其具有性能稳定，可诱导机体产生高的抗体水平，且毒性低的特点。

在所述的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体中，B亚基由于可调控LT与细胞膜上的GM1结合，从而具有免疫佐剂的活性，然而因B亚基本身分子量小，单独用于作为佐剂，在进入体内后易于导致免疫原性降低或消失，效果不理想，而B亚基与降低毒性的A亚基的组合用于作为免疫佐剂具有良好的活性，免疫原性高。

因此，本发明还提供了一种用于黏膜免疫的组合物，它含有安全有效量的本发明的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。本发明的组合物可以被制成适合于黏膜给药的任何形式。大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白在组合物中的含量例如可以是0.0001-20wt％；更佳的为0.001-10wt％。

使用该组合物时，是将安全有效量的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药方式，受试者身体状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

此外，所述的组合物中还含有：有效量的疫苗，其在组合物中的含量例如0.0001-20wt％；更佳的为0.001-10wt％。从而在本发明的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的辅佐下，产生良好的疫苗免疫效果。

本发明的主要优点在于：

(1)证实了LTK63/G192和LTR72/G192这两个突变体毒性显著降低，且黏膜佐剂活性优异，明显优于LTK63/G72。

(2)对LT突变体的表达工艺进行了优化，从而获得的蛋白更接近于其天然的存在方式，具有良好的活性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料与方法

1.菌株与质粒

菌株与质粒：以P1/P2为引物，以产生大肠杆菌热敏性肠毒素的大肠杆菌为模板，PCR扩增获得野生LT基因，用NcoI和SalI酶切后连接入经过相同酶切的pET30a(Novagen)中，获得质粒pET30a-LT。

菌株采用常规的大肠杆菌DH5α，BL21(DE3)。

2.实验动物

6～8周龄昆明系雌性小白鼠由复旦大学医学院实验动物部提供，鸡新城疫低毒力活疫苗(Lasota)购自上海松江生物药品有限公司。

3.突变体表达载体构建

(1)引物设计

参考已登录LT全基因序列，设计引物对P1/P2，用于扩增LT全基因，引物两端分别添加NcoI和SalI限制性酶切位点(框线部分表示)和保护碱基；以其第63氨基酸位点为中心设计引物P3/P4，使其第63位氨基酸密码子由Ser密码子TCT转换为Lys密码子AAA(下划线表示)；以LT的第72位氨基酸为中心的核苷酸序列为依据设计突变引物对P5/P6，将72位GCA替换为CGT(下划线表示)；以LT的第192位氨基酸为中心的核苷酸序列为依据设计P7/P8突变引物对，将192位AGA替换为GGA(下划线表示)，引物由上海生工合成。

P1：5′-AG3CAATGGCGACAGATTATACC-3′(SEQ ID NO：5)；

P2：5′-AC3TTTTTCATACTGATTGCCGC-3′(SEQ ID NO：6)；

P3：5′-CGGATATGTTTCCACTAAACTTAGTTTGAGAAGTGCTC-3′(SEQ ID NO：7)；

P4：5′-GAGCACTTCTCAAACTAAGTTTAGTGGAAACATATCCG-3′(SEQ ID NO：8)；

P5：5′-GAGAAGTGCTCACTTACGTGGACAGTCTATATTATCAGG-3′(SEQ ID NO：9)；

P6：5′-CCTGATAATATAGACTGTCCACGTAAGTGAGCACTTCTC-3′(SEQ ID NO：10)；

P7：5′-GGTTGTGGAAATTCATCAGGAACAATCACAGGTGATACTTG-3′(SEQ ID NO：11)；

P8：5′-CAAGTATCACCTGTGATTGTTCCTGATGAATTTCCACAACC-3(SEQ ID NO：12)。

(2)LTK63突变基因表达载体构建

a.突变体基因片段I和II的制备

在100μl反应体系中加入dNTPs、Ex Taq、10×缓冲液、相应引物对、无菌水、模板pET30a-LT。其中LTK63基因片段I扩增所用引物对为P1/P4，片段II扩增所用引物对为P2/P3。反应条件完毕，回收PCR产物。

b.突变体LTK63基因的制备

取a.中PCR产物混合，加入dNTPs、Ex Taq、10×缓冲液、无菌水先进行8个PCR循环，再加dNTPs、Ex Taq、10×缓冲液、无菌水及引物对P1/P2进行新PCR循环，反应完毕，回收PCR产物。

c.表达载体构建及重组质粒的鉴定

上述PCR产物和pET30a分别用NcoI和SalI进行双酶切，割胶回收，以适当摩尔比加入DNA Ligation Kit连接。连接产物转化DH5α。挑克隆提取质粒，作PCR和酶切鉴定。阳性重组质粒测序，验证读码框及突变位点是否正确。

(3)LTR72突变基因表达载体构建

片段I扩增所用引物对为P1/P5，片段II扩增所用引物对为P2/P6，其余操作如LTK63突变基因表达载体构建。

(4)LTK63/G192突变基因表达载体构建

a.突变体基因片段I和II的制备

在100μl反应体系中加入dNTPs、Ex Taq、10×缓冲液、相应引物对、无菌水、模板pET30a-LTK63。其中LTK63/G192基因片段I扩增所用引物对为P1/P8，片段II扩增所用引物对为P2/P7。反应完毕，回收PCR产物。

b.第63位和192突变基因(LTK63/G192)的制备

取前述获得的PCR产物混合，加入dNTPs、Ex Taq、10×缓冲液、无菌水先进行8个PCR循环，再加dNTPs、Ex Taq、10×缓冲液、无菌水及引物对P1/P2进行新PCR循环，反应完毕，回收PCR产物。

c.表达载体构建及重组质粒的鉴定

上述PCR产物和pET30a分别用NcoI和SalI进行双酶切，割胶回收，加入常规的DNA连接试剂盒连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α。挑取单克隆并提取质粒，常规方法进行PCR和酶切鉴定。阳性重组质粒测序，验证读码框及突变位点，从而获得具有正确的突变位点的重组表达载体pET30a-LTK63/G192。

(5)LTR72/G192突变基因表达载体构建

除了模板和引物发生相应变化，其余操作如LTK63/G192突变基因表达载体构建。

4.重组蛋白的表达、纯化及Western Blot检测

表达

重组质粒转化BL21(DE3)，经过PCR鉴定后，用IPTG诱导表达蛋白，菌液离心去培养上清，使用NTA0(20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，10％甘油)重悬细菌沉淀，超声波破碎菌体，4℃磁力搅拌器搅拌过夜，离心收集上清。

本实验的特点在于：LT为A亚基和B亚基组成，A、B亚基表达后组合成完整LT蛋白。故本实验离心所得的细菌沉淀直接使用Urea-NTAO重悬，4℃磁力搅拌器搅拌过夜，离心收集上清。这样A亚基和B亚基仍然在一起，且不打乱A亚基和B亚基之间的比例，这样通过复性后，大肠杆菌不耐热肠毒素结构不被破坏。

复性采用常规方法，在含2M尿素的NTA0中透析。

纯化

用Ni-NTA Resin装柱，用FPLC系统进行纯化。纯化的蛋白于4℃透析复性24小时，PBS透析，BCA法定量。

Western blot检测

将纯化蛋白进行常规的SDS-PAGE电泳，并转印至硝酸纤维素膜上，分别用抗CT抗体和His-tag抗体(均购自NEWLANBORS公司)为一抗，检测样品的蛋白。

5.重组蛋白的ADP-核糖转移酶活性检测

ADP-核糖转移酶活性检测根据文献Soman G等，Use of Substituted(Benzylidineamino)guanidines in the Study of Guanidino Group SpecificADP-ribosyltransferase[J]；Biochemistry，1986，25：4113-4119和De Haan等，Mucosal immunogenicity and adjuvant activity of the recombinant Asubunit of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin[J]。Immunology，1999，97(4)：706-713的方法进行。

用氨基胍重碳酸盐和对二乙氨基苯甲醛反应生成DEA-BAG(p-二乙基氨基-(benzylidineamino)胍)，用已知的8个不同浓度的DEA-BAG检测355nm的光吸收，画出标准的浓度-光吸收值曲线。各取750ng蛋白用胰蛋白酶处理，37℃水浴1小时。用大豆胰蛋白酶抑制剂抑制反应。加入等量的DEA-BAG溶液，用NAD启动反应，30℃水浴2小时。各用等量的DOWEX-50W树脂吸附出未反应的DEA-BAG。过滤，355nm处检测各个反应滤液的光吸收，各个蛋白做3各重复。根据标准曲线计算反应液中DEA-BAG的浓度，计算出所消耗的DEA-BAG的量。以LT所消耗的DEA-BAG的量为100％酶活性，计算出各个蛋白的相对酶活性。

6.重组蛋白的毒性检测

Patent-mouse毒性检测试验，根据冯强等，大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及纯化保存策略[J]；生物工程学报，2003，19(5)：532-537的方法进行。所得数据用t-检验测定显著性差异，P＞0.05为不显著，P≤0.01为极显著，0.01＜P≤0.05为显著。

7.蛋白佐剂活性的检测

a.小鼠免疫实验

5-6周龄雌性小鼠，随机分成8组，5只/组。一组只用5只羽份(参照疫苗使用说明书)的新城疫疫苗(溶于0.1M PBS中)滴鼻免疫，其余各组用5羽份的新城疫疫苗和各种毒素蛋白4μg(溶于0.1M PBS中)免疫。分别在1，12，26天进行第一、二、三次免疫。在0，11，25，35天断尾采血，同时用500μl PBS(0.1％BSA)洗鼻。血样4℃过夜，5000rpm/min离心5min收集血清用于检测。-20℃保存。

b.间接ELISA检测不同处理组抗体水平

用新城疫LaSota株病毒包被ELISA反应板(100μl/孔)，常规方法检测血清IgG、鼻洗液中IgA抗体水平。

实施例

实施例1表达载体构建的PCR扩增及酶切分析

分别以前述构建的突变体表达载体pET30a-LTK63和pET30a-LTR72为模板，以P1/P4为引物扩增出大小约为600bp的LTK63/G192I和LTR72/G192I基因；以P2/P3为引物扩增出大小约为530bp的LTK63/G192II和LTR72/G192II基因。用各对片段I和II为模板，以P1/P2为引物用重叠区扩增基因拼接法扩增出约1100bp的LTK63/G192和LTR72/G192，大小均与预期的相当。

测序结果显示，pET30a-LTK63/G192中LT基因片段的第63位氨基酸由Ser密码子突变为Lys，第192氨基酸由Arg突变为Gly；pET30a-LTR72/G192中LT基因片段的第72氨基酸密码子由Ala突变为Arg，第192氨基酸密码子由Arg突变为Gly。

表达载体pET30a-LTK63/G192和pET30a-LTR72/G192构建的琼脂糖凝胶电泳分析如图1和图2所示。

实施例2重组菌的诱导表达、纯化及Western-Blot检测

经测序阅读框架正确的各突变体菌株分别接种到液体培养基中，用终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达，两个突变体均表达出约33.0Ku和13.0Ku的两条蛋白带；重组表达蛋白用常规的Ni-NTA树脂进行纯化，用咪唑洗脱，电泳检测得到大约33.0Ku和13.0Ku的两条带，用抗His-tag抗体作为一抗，检测重组蛋白。LTK63/G192蛋白表达情况见图3A，LTK63/G192蛋白纯化的SDS-PAGE见图3B，LTK63/G192蛋白和LTR72/G192两个蛋白的Western-Blot检测见图3C。

实施例3ADP-核糖转移酶活性检测

用DEA-BAG作为底物，用NAD启动反应，反应终止后测355nm处的光吸收值，按照标准公式计算底物的消耗量，以LT所消耗的底物量作为酶活性100％，计算出其他各个蛋白的相对酶活性，以等体积的不含蛋白的PBS作为对照。结果如表1示。

表1 ADP-核糖转移酶活性检测结果

    毒素蛋白    ADP-核糖转移酶(％)    对照(PBS)    6.54    LT    100    LTK63    11.71    LTR72    12.06    LTG192    8.71    LTK63/G192    8.76    LTR72/G192    8.78

由上表可见，LTK63/G192和LTR72/G192的ADP-核糖转移酶活性比LTK63和LTR72更低。

实施例4LT突变体的毒性检测

分别用PBS、野生型LT蛋白及各个突变体蛋白饲喂小鼠(Patent-mouse)，取其肠重与尸重的比值，计算各组平均数及标准差，各突变蛋白组均与PBS、野生型LT做t-检验，结果如表2和图4。

表2Patent-mouse活体毒性检测的t-检验结果

结果显示，各个突变体与野生型LT相比，毒性均显著降低。

实施例5佐剂活性研究

各组小鼠分别用新城疫疫苗(NDV)、或新城疫疫苗和各个毒素蛋白在1、12、26天进行第一、二、三次免疫。在0、11、25、35天断尾采血收集血清，同时用500μl PBS(0.1％BSA)洗鼻。用ELISA检测各个血清样品的IgG和鼻洗液样品的IgA，在450nm光波下读取OD值。取三免后各组加毒素蛋白的读数与只用NDV免疫组的读数进行t-值检验。P＞0.05差异不显著，0.01＜P＜0.05差异显著，P＜0.01差异极显著。结果如图5和表3-表4所示。

表3：三免后加毒素蛋白+NDV组与NDV组的IgG水平的t-值检验

表4：三免后各个加毒素蛋白+NDV组与NDV组的IgA水平的t-值检验

结果显示，与单用NDV相比，同时用LTK63/G192或LTR72/G192可显著提高动物体内IgG和IgA水平，即它们有良好的免疫佐剂活性；而LTK63/R72不显著。

实施例6组合物

一种用于黏膜免疫的组合物，所述的组合物含有：4μg的前述纯化的LT突变体蛋白LTR72/G192，作为黏膜免疫的佐剂；1-2头份的新城疫疫苗(溶解在PBS中，0.5ml)；以及0.5mL的0.1M PBS。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海市农业科学院

<120>大肠杆菌热敏性肠毒素双突变体作为疫苗黏膜免疫佐剂

<130>080406

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>720

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>1

aatggcgaca gattataccg tgctgactct agacccccag atgaaataaa acgttccgga   60

ggtcttatgc ccagagggca taatgagtac ttcgatagag gaactcaaat gaatattaat  120

ctttatgatc acgcgagagg aacacaaacc ggctttgtca gatatgatga cggatatgtt  180

tccacttctc ttagtttgag aagtgctcac ttagcaggac agtctatatt atcaggatat  240

tccacttact atatatatgt tatagcgaca gcaccaaata tgtttaatgt taatgatgta  300

ttaggcgtat acagccctca cccatatgaa caggaggttt ctgcgttagg tggaatacca  360

tattctcaga tatatggatg gtatcgtgtt aattttggtg tgattgatga acgattacat  420

cgtaacaggg aatatagaga ccggtattac agaaatctga atatagctcc ggcagaggat  480

ggttacagat tagcaggttt cccaccggat caccaagctt ggagagaaga accctggatt  540

catcatgcac cacaaggttg tggaaattca tcaagaacaa tcacaggtga tacttgtaat  600

gaggagaccc agaatctgag cacaatatat ctcagggaat atcaatcaaa agttaagagg  660

cagatatttt cagactatca gtcagaggtt gacatatata acagaattcg ggatgaatta  720

<210>2

<211>240

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>2

Asn Gly Asp Arg Leu Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Pro Pro Asp Glu Ile

1               5                   10                  15

Lys Arg Ser Gly Gly Leu Met Pro Arg Gly His Asn Glu Tyr Phe Asp

            20                  25                  30

Arg Gly Thr Gln Met Asn Ile Asn Leu Tyr Asp His Ala Arg Gly Thr

        35                  40                  45

Gln Thr Gly Phe Val Arg Tyr Asp Asp Gly Tyr Val Ser Thr Ser Leu

    50                  55                  60

Ser Leu Arg Ser Ala Hi s Leu Ala Gly Gln Ser Ile Leu Ser Gly Tyr

65                  70                  75                  80

Ser Thr Tyr Tyr Ile Tyr Val Ile Ala Thr Ala Pro Asn Met Phe Asn

                85                  90                  95

Val Asn Asp Val Leu Gly Val Tyr Ser Pro His Pro Tyr Glu Gln Glu

            100                 105                 110

Val Ser Ala Leu Gly Gly Ile Pro Tyr Ser Gln Ile Tyr Gly Trp Tyr

        115                 120                 125

Arg Val Asn Phe Gly Val Ile Asp Glu Arg Leu His Arg Asn Arg Glu

    130                 135                 140

Tyr Arg Asp Arg Tyr Tyr Arg Asn Leu Asn Ile Ala Pro Ala Glu Asp

145                 150                 155                 160

Gly Tyr Arg Leu Ala Gly Phe Pro Pro Asp His Gln Ala Trp Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Pro Trp Ile His His Ala Pro Gln Gly Cys Gly Asn Ser Ser Arg

            180                 185                 190

Thr Ile Thr Gly Asp Thr Cys Asn Glu Glu Thr Gln Asn Leu Ser Thr

        195                 200                 205

Ile Tyr Leu Arg Glu Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg Gln Ile Phe Ser

    210                 215                 220

Asp Tyr Gln Ser Glu Val Asp Ile Tyr Asn Arg Ile Arg Asp Glu Leu

225                 230                 235                 240

<210>3

<211>372

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>3

atgaataaag taaaatgtta tgttttattt acggcgttac tatcctctct atatgcacac   60

ggagctcccc agactattac agaactatgt tcggaatatc gcaacacaca aatatatacg  120

ataaatgaca agatactatc atatacggaa tcgatggcag gcaaaagaga aatggttatc  180

attacattta agagcggcga aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac  240

tcccagaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcacata tctgaccgag  300

accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc  360

agtatgaaaa ac                                                      372

<210>4

<211>124

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>4

Met Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser

1               5                   10                  15

Leu Tyr Ala His Gly Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu

            20                  25                  30

Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr

        35                  40                  45

Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys

    50                  55                  60

Ser Gly Glu Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp

65                  70                  75                  80

Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr

                85                  90                  95

Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys

            100                 105                 110

Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn

        115                 120

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

agccatgggc aatggcgaca gattatacc                    29

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

acgtcgacgt ttttcatact gattgccgc                    29

<210>7

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

cggatatgtt tccactaaac ttagtttgag aagtgctc          38

<210>8

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

gagcacttct caaactaagt ttagtggaaa catatccg     38

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

gagaagtgct cacttacgtg gacagtctat attatcagg    39

<210>10

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

cctgataata tagactgtcc acgtaagtga gcacttctc    39

<210>11

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>11

ggttgtggaa attcatcagg aacaatcaca ggtgatactt g    41

<210>12

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>12

caagtatcac ctgtgattgt tcctgatgaa tttccacaac c    41