微生物转化法制备3β,7β－二羟基－15β,16β－亚甲基－5－雄烯－17－酮的方法

摘要

本发明提供一种微生物转化法制备3β，7β－二羟基－15β，16β－亚甲基－5－雄烯－17－酮的方法，该方法以Botryodiplodia malorum CBS13450为菌种，包括制备静息细胞转化系统和底物转化的步骤，其中所述的静息细胞转化系统包含缓冲液，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲溶液、磷酸盐－柠檬酸缓冲液、磷酸二氢钾－氢氧化钠缓冲液或柠檬酸－氢氧化钠－盐酸缓冲液。在最佳转化条件下该系统的转化结果为45小时内将0.3％的底物完全转化。

说明书

技术领域

本发明属于微生物转化领域，具体涉及一种利用微生物将3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮转化成3β，7β-二羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮的方法。

背景技术

3β，7β-二羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮是一种重要的医药中间体，可用于合成避孕药屈螺酮及利尿药螺利酮。3β，7β-二羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮的合成主要利用微生物转化3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮而成。文献Steroid hydroxylations with Botryodiplodiamalorum and Colletotrichum lini(steroids 71(2006)429-434)及专利UnitedStates Patent 4 614 616(Sep.30，1986)都报导了Botryodiplodia malorum可以转化3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮为3β，7β-二羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮。

静息细胞转化法是指在适当的培养基和培养条件下，使菌体充分生长后，分离洗涤菌体，然后悬浮在适当的缓冲液中，再添加底物进行转化反应。与直接发酵液中转化相比，该法一般\有以下几个优点：不需要在无菌状态下操作，条件容易控制；能自由地改变反应液中底物和菌体量的比例；能缩短反应时间，排除培养基中的物质及菌体生长过程中产生的物质对转化的影响，减少副产物；转化的液体中杂质较少，分离纯化比较容易。

Patent 4 614 616(Sep.30，1986)一文中采用直接转化法，得到的结果为在48小时内将0.2％的底物转化完全。

而Steroid hydroxylations with Botryodiplodia malorum andColletotrichum lini(steroids 71(2006)429-434)一文使用的是静息细胞转化法，其所用的缓冲液及部分转化条件不清楚，得到的结果为72小时将0.1％的底物转化完全。

发明内容

本文发明一种高效率转化3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮为3β，7β-二羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮的静息细胞转化方法，该方法以Botryodiplodia malorum CBS13450为菌种，包括制备静息细胞转化系统和底物转化的步骤，其中所述的静息细胞转化系统包含缓冲液，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲溶液、磷酸盐-柠檬酸缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液或柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液。

其中所述缓冲液优选为磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液。

磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液的浓度为0.01N-0.1N，优选0.02N；磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液的pH值为4.0-9.0，优选6.0。

其中所述发酵培养的条件是：装液量为10-100ml/250ml(培养基/摇瓶)，优选40ml/250ml(培养基/摇瓶)；转速为100-300r/min，优选250r/min；温度为0-50℃，优选25-35℃，更优选30℃。

本发明所述的生物转化法将3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮转化为3β，7β-二羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮的方法的具体步骤如下：

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；12l℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好缓冲液中，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，于装液量为10-100ml/250ml(培养基/摇瓶)，转速为100-300r/min，温度为0-50℃条件下开始转化。

本发明采用静息细胞转化法生物转化合成3β，7β-二羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，与现有技术相比，本发明明显缩短转化时间，提高了转化效率。

具体实施方式

实施例1

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为200r/min，温度为0℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为35％。

实施例2

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为200r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为95％。

实施例3

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为200r/min，温度为50℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为41％。

实施例4

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为100r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为79％。

实施例5

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为250r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为97％。

实施例6

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为300r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为90％。

实施例7

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为40ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值6.0)中(40ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为250r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为99％。

实施例8

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为100ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值6.0)中(100ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为250r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为75％。

实施例9

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为10ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值6.0)中(10ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为250r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为95％。

实施例10

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为40ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值6.0)中(40ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为250r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为99％。

实施例11

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.01N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为250r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为85％。

实施例12

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.1N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为250r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为64％。

实施例13

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值4.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为250r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为83％。

实施例14

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值9.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为250r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为70％。

实施例15

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值8.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为250r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为34％。

实施例16

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.02N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为50r/min，温度为30℃，5在该条件下转化45h，底物的转化率为41％。

实施例17

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.2N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为200r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为29％。

实施例18

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸盐缓冲液(0.05N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为200r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为73％。

实施例19

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的醋酸盐缓冲液(0.05N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为200r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为67％。

实施例20

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(0.05N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为200r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为85％。

实施例21

将28℃下培养5到7天的平板上菌丝用无菌水洗下后接种于装有30ml种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在转速120r/min，温度28℃条件下培养2.5天，所得种子以10％的接种量接种于发酵培养基中(配方为：葡萄糖10g/L，豆饼粉10g/L，pH 6.2；121℃灭菌20min)，装液量为30ml/250ml(培养基/摇瓶)，在转速200r/min，温度28℃下培养24小时得成熟的发酵液菌丝体。

发酵液经离心得成熟的菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤3次得干净的菌丝，将所得菌丝悬浮于配好的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液(0.05N，pH值6.0)中(30ml)，加入0.3％的底物3β-羟基-15β，16β-亚甲基-5-雄烯-17-酮，加入0.5％的葡萄糖，开始转化，转速为200r/min，温度为30℃，在该条件下转化45h，底物的转化率为68％。