一对Q型烟粉虱特异性SCAR引物及快速PCR检测方法和试剂盒

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明一对Q型烟粉虱特异性SCAR引物及快速PCR检测方法和试剂盒。根据本发明的Q型烟粉虱特异性SCAR引物为：引物BTQE：5′－TGCTTGTCGAAGAGGGTC－3′；和引物BTQF：5′－TTTAGAAACGTGCCGAAT－3′。根据本发明的Q型烟粉虱特异性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明的Q型烟粉虱特异性SCAR引物及快速PCR检测方法具有检测准确性高、操作简单快捷、特异性强等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明一对Q型烟粉虱特异性SCAR引物及快速PCR检测方法和试剂盒。

背景技术

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)属同翅目，粉虱科，小粉虱属，是一种严重危害农业生产的入侵性害虫，为世界自然保护联盟(IUCN)所列出的全球100种最危险的入侵物种之一，其寄主植物包括蔬菜、花卉在内的600种以上。烟粉虱的危害方式有三种，包括直接吸取植物汁液、分泌蜜露影响植物的光合作用，传播40余种植物病毒、造成植物病毒病大发生，引起植物生理异常、使产品产量和质量明显下降，给农业生产造成了巨大的经济损失。1991-1992两年间，美国的加利福尼亚、佛罗里达、德克萨斯等地由于烟粉虱大暴发而造成的经济损失共计约7亿美元。

烟粉虱是一正在快速进化的复合种，种下包含多个生物型或隐存种。尽管一般认为B型烟粉虱具有比其它生物型烟粉虱更强的入侵性，然而由于Q型烟粉虱具有更稳定的抗药性和更强的生物学优势以及可以在多种杂草上快速建立种群的特性，因此在世界某些地区Q型烟粉虱种群仍占上风，并越来越引起国际上的高度重视。Q型烟粉虱起源于地中海地区，原来仅分布在伊比利亚半岛，但近期研究发现已遍布意大利、以色列及摩洛哥的整个北部地区，并在美国、墨西哥、危地马拉、日本等国家发现危害；我国于2003年在云南昆明市郊花卉市场的一品红上首次发现Q型烟粉虱，2004年又相继在北京海淀区、河南郑州市发现，2005年发现在浙江局部地区大量发生危害。Q型烟粉虱是传入我国的另一种外来入侵生物，鉴于其目前仅在我国局部地区发现，而且Q型烟粉虱在国外一些地区已造成了严重的危害，比B型烟粉虱具有更强的危害性和入侵性，在我国具有进一步扩散和蔓延的可能性。并且事实上，Q型烟粉虱近些年在世界各地迅速扩散，在许多地区已经逐渐成为最主要的致害类型。而Q型烟粉虱的传播以人为传播为主，因此应该加强对Q型烟粉虱的检疫和监测，杜绝人为传播。

加强检疫和监测必需建立一套快速而准确的分子检测方法。目前国际上已有多种方法用于烟粉虱生物型鉴定：1)形态特征鉴定；2)酯酶、同工酶位点多态性分析；3)PCR技术等。但目前国内针对Q型烟粉虱尚没有标准的检测方法。

在烟粉虱生物型检测和鉴定中应用较为广泛的是mtDNA COI技术。mtDNA COI技术检测是利用通用型的引物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA进行体外扩增，然后将PCR产物回收、纯化、测序，根据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果。SCAR-PCR技术检测是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高，特异性强，快速和简便等优点。

发明内容

本发明的目的为提供一对Q型烟粉虱特异性SCAR引物。

本发明的再一目的为提供一种Q型烟粉虱特异性基因片段。

本发明再一目的为提供一种Q型烟粉虱的特异性快速PCR检测方法。

本发明的另一目的为提供一种Q型烟粉虱的特异性快速PCR检测试剂盒。

本发明根据Q型烟粉虱特有的基因组DNA序列，设计一对特异性引物，该引物只对Q型烟粉虱具有扩增能力。是对Q型烟粉虱mtDNA COI技术检测方法的补充和改进。同时，本方法采用SCAR-PCR技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在Q型烟粉虱检测/监测方面具有很高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国口岸、世博会园区以及种苗调运中推广。

根据本发明的一对Q型烟粉虱特异性SCAR引物为：

引物BTQE：5′-TGCTTGTCGAAGAGGGTC-3′；和

引物BTQF：5′-TTTAGAAACGTGCCGAAT-3′。

根据本发明的Q型烟粉虱特异性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

根据本发明的Q型烟粉虱特异性检测方法包括使用上述SCAR引物进行PCR扩增的步骤。

根据本发明的Q型烟粉虱检测特异性检测试剂盒包括上述Q型烟粉虱特异性SCAR引物。

本发明的Q型烟粉虱特异性SCAR引物及快速PCR检测方法，用于快速检测Q型烟粉虱。与国际现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：

1)检测准确性高，本方法根据Q型烟粉虱特异性SCAR标记设计的引物BTQE和BTQF，在PCR快速检测Q型烟粉虱时，可扩增出175bp的片段，不仅对Q型烟粉虱成虫、拟蛹、二龄若虫可以进行检测，对于卵也能检测。

2)操作简便快捷。本发明采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效。一般整个检测过程可在5个小时内完成。

3)特异性强，本发明设计的引物可特异性检测Q型烟粉虱，在其近缘生物型烟粉虱以及近缘种、属粉虱中无扩增产物。

因此本方法实用性强，可满足植物检疫及害虫监测/检测的需要。

附图说明

图1为引物BTQE/BTQF对Q型烟粉虱及其近缘生物型烟粉虱和近缘种、属粉虱的SCAR-PCR扩增结果，

M：分子量标准DGL2000；1：B型烟粉虱，2：Q型烟粉虱，3：ZHJ-1型烟粉虱，4：ZHJ-2型烟粉虱，5：黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus，6：螺旋粉虱Aleurodicusdisperses，7：桔绿粉虱Dialeurodes citri，8：温室粉虱Trialeurodes vaporariorum，9.阴性对照(模板为水)。

图2为引物BTQE/BTQF对Q型烟粉虱不同虫态和性别的SCAR-PCR扩增结果，

M：分子量标准DGL2000；1：雄性成虫，2：雌性成虫，3：卵(5粒)，4：拟蛹(四龄若虫)，5：二龄若虫。

图3为引物BTQE/BTQF对Q型烟粉虱最小检出量的测定，

M：分子量标准DGL2000；1：1/15；2：1/60；3：1/120；4：1/240；5：1/480；6：1/960；7：1/1920；8：1/3840头雌性成虫。

具体实施方式

实施实例1：引物BTQE/BTQF对Q型烟粉虱的扩增效果

1)粉虱模板DNA的制备

将单头粉虱置于滴有20μL提取缓冲液(50mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、1％SDS、20mmol/L NaCl，pH 8.0)的parafilm膜上，以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以50μL缓冲液分4次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60℃水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴5min，加入220μL氯仿/异戊醇(V∶V＝24∶1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置10min；4℃、10000r/min离心10min，取上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30min；4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入400μL预冷的75％乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入30μL超纯水，充分溶解后于-20℃保存备用。

2)检验Q型烟粉虱的特异性引物的合成

Primer BTQE：5′-TGCTTGTCGAAGAGGGTC-3′

Primer BTQF：5′-TTTAGAAACGTGCCGAAT-3′由上海生工技术服务有限公司合成。

3)PCR扩增反应

反应体系为20μL，其中10×PCR buffer 2.0μL、dNTP(10mmol/L)0.4μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL、上游引物和下游引物(20ng/μL)各2.0μL、模板DNA 2.0μL、超纯水11.4μL。

4)PCR扩增程序

94℃预变性5min；35个循环：94℃1min、59℃1min、72℃1min；最后72℃延伸5min。

5)PCR产物的鉴定

取4μLPCR产物用1.5％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。

实施结果

利用引物primerBTQE/BTQF以Q型烟粉虱DNA为模板，以B型、ZHJ-1型、ZHJ-2型烟粉虱以及黑刺粉虱、桔绿粉虱、螺旋粉虱和温室粉虱为对照进行SCAR-PCR扩增。在2泳道的Q型烟粉虱中扩增出了175bp的目的条带(见图1的2泳道，其序列如下所示)，在其他3种近缘生物型烟粉虱及4种近缘种、属的粉虱中均无扩增产物。说明本发明所筛选的来自Q型烟粉虱基因组DNA的特异性PCR扩增引物的特异性强。

175bp片段的序列：

tgcttgtcga agagggtcgg tggaagggct taaatgctcc ggcgaaagtt aagtgaaggg    60

ttacgactga actcctgaaa tctggtttgt ggcgcctctt atcttggcgt gttccctttc    120

agcattcgta gaattttaat aacgtgcttt atcttgcatt cggcacgttt ctaaa         175

实施实例2：引物BTQE/BTQF对Q型烟粉虱不同虫态和性别的扩增效果

1)Q型烟粉虱模板的制备

将不同虫态(其中卵为5粒)和性别的单头Q型烟粉虱置于滴有20μL提取缓冲液(50mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、1％SDS、20mmol/L NaCl，pH 8.0)的parafilm膜上，以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以50μL缓冲液分4次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60℃水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴5min，加入220μL氯仿/异戊醇(V∶V＝24∶1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置10min；4℃、10000r/min离心10min，取上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30min；4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入400μL预冷的75％乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入30μL超纯水，充分溶解后于-20℃保存备用。

2)检验Q型烟粉虱的特异性引物的合成

Primer BTQE：5′-TGCTTGTCGAAGAGGGTC-3′

Primer BTQF：5′-TTTAGAAACGTGCCGAAT-3′由上海生工技术服务有限公司合成。

3)PCR扩增反应

反应体系为20μL，其中10×PCR buffer 2.0μL、dNTP(10mmol/L)0.4μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL、上游引物和下游引物(20ng/μL)各2.0μL、模板DNA 2.0μL、超纯水11.4μL。

4)PCR扩增程序

94℃预变性5min；35个循环：94℃1min、59℃1min、72℃1min；最后72℃延伸5min。

5)PCR产物的鉴定

取4μLPCR产物用1.5％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。

实施结果

利用引物BTQE/BTQF以不同虫态和性别的Q型烟粉虱DNA为模板进行PCR扩增。Q型烟粉虱的雄性成虫和雌性成虫均扩增出了175bp的目的条带(见图2的1、2泳道)；同时Q型烟粉虱的卵、拟蛹和二龄若虫也扩增出了175bp的目的条带(见图2的3、4、5泳道)，说明本发明所筛选的Q型烟粉虱的特异性PCR扩增引物的准确性高。

实施实例3：引物BTQE/BTQF对Q型烟粉虱最小检出量的测定

1)Q型烟粉虱模板的制备

将单头Q型烟粉虱雌性成虫置于滴有20μL提取缓冲液(50mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、1％SDS、20mmol/L NaCl，pH 8.0)的parafilm膜上，以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以50μL缓冲液分4次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60℃水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴5min，加入220μL氯仿/异戊醇(V∶V＝24∶1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置10min；4℃、10000r/min离心10min，取上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30min；4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入400μL预冷的75％乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入30μL超纯水。然后取原模板溶液稀释4倍后以2倍进行递减梯度稀释至1/3840头，取2μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。

2)检验Q型烟粉虱的特异性引物的合成

Primer BTQE：5′-TGCTTGTCGAAGAGGGTC-3′

Primer BTQF：5′-TTTAGAAACGTGCCGAAT-3′由上海生工技术服务有限公司合成。

3)PCR扩增反应

反应体系为20μL，其中10×PCR buffer 2.0μL、dNTP(10mmol/L)0.4μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL、上游引物和下游引物(20ng/μL)各2.0μL、不同稀释倍数Q型烟粉虱DNA 2.0μL、超纯水11.4μL。

4)PCR扩增程序

94℃预变性5min；35个循环：94℃1min、59℃1min、72℃1min；最后72℃延伸5min。

5)PCR产物的鉴定

取4μLPCR产物用1.5％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。

实施结果

利用引物primer BTQE/BTQF做最小检出量的测定，以不同稀释倍数的Q型烟粉虱DNA为模板进行PCR扩增，能检测到的最小模板DNA浓度为1/960头成虫(见图3)。

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>一对Q型烟粉虱特异性SCAR引物及快速PCR检测方法和试剂盒

<210>1

<211>175

<212>DNA

<213>烟粉(Bemisia tabaci)

<400>1：

tgcttgtcga agagggtcgg tggaagggct taaatgctcc ggcgaaagtt aagtgaaggg    60

ttacgactga actcctgaaa tctggtttgt ggcgcctctt atcttggcgt gttccctttc    120

agcattcgta gaattttaat aacgtgcttt atcttgcatt cggcacgttt ctaaa         175

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tgcttgtcga agagggtc                                                  18

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3：

taagccgtgc aaagattt                                                  18