用于检测三聚氰胺的分子印迹聚合物及其制备方法

摘要

本发明公开一种用于检测三聚氰胺的分子印迹聚合物(MIPs)及其制备方法，该聚合物是以环丙胺嗪为虚拟模板，与功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂在50～80℃聚合得块状聚合物，经粉碎、筛分，乙酸甲醇、甲醇去除模板后，真空干燥制备得到对三聚氰胺具有高度交叉反应和显著选择性的分子印迹聚合物。本发明选择环丙胺嗪为虚拟模板制备MIPs，克服了三聚氰胺在聚合体系溶解难问题和用其本身为模板制备的MIPs用于固体萃取填料时由于模板泄漏而导致的结果不准确问题；本发明选择甲醇和水的混合体系作为致孔剂，制得的MIPs在水溶液体系对三聚氰胺具有高度的亲和性，作为分析三聚氰胺的样品前处理材料有着广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及材料化学技术领域，具体涉及一种用于检测三聚氰胺的分子印迹聚合物及其制备方法。

背景技术

三聚氰胺(melamine)，又称密胺、氰尿酰胺、三聚酰胺、蛋白精，化学名称为2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪，是一种重要的有机化工原料，广泛用于塑料、涂料、粘合剂和食品包装材料的生产。由于三聚氰胺含氮量高达66％，与蛋白质(平均含氮量16％)相比含有更高比例的氮原子，所以被一些造假者利用，添加在饲料和食品中以造成蛋白质含量较高的假象，从而造成诸如2007年美国宠物食品污染事件和2008年中国毒奶粉事件、毒鸡蛋事件等严重的食物安全事故。

针对上述情况，我国相关部门严肃应对，积极组织人员进行方法学研究，目前已有NY/T 1372-2007、GB/T 22388-2008及GB/T 22400-2008等标准颁布，为饲料、食品中三聚氰胺的检测和监控提供了充分保证。但现行所有三聚氰胺检测的前处理方法都是采用传统的固相萃取小柱(如C₁₈、MCX等)净化，缺乏选择性，特异性不强，从而影响整个检测方法的灵敏度和准确定量，小柱也不可以再生使用。

基于类似抗原-抗体反应的分子印迹固相萃取技术具有高选择性和特异性，是一种具有广泛应用前景的固相萃取材料。如果能像抗体一样，合成某些类似抗体的对三聚氰胺具有高选择性的分离基质则可大大提高三聚氰胺检测的灵敏度和准确性。

分子印迹(molecular imprinting)是近年来基于分子识别理论而迅速发展起来的一个新的研究领域，分子印迹技术也被称为制造“塑料抗体”的技术。

分子印迹聚合物(molecular imprinting polymers，MIPs)是一类内部具有固定大小和形状的孔穴并具有确定排列功能基团的交联高聚物。因为MIPs是根据印迹分子定做的，因此它具有特殊的分子结构和官能团，能选择性地识别印迹分子。

分子印迹聚合物的制备一般要通过如下三个步骤：

1、功能单体通过与模板分子相互作用(共价或非共价键)，聚集在模板分子周围形成可逆的复合物；

2、功能单体与过量交联剂在致孔剂存在下发生共聚生成高聚物；

3、将模板分子从高聚物中解离出来，在聚合物中就形成了能够识别模板分子的结合位点。

这种印迹聚合物可作为液相色谱的固定相、选择性催化剂、化学传感器的传感元件和固相萃取剂等，在临床药物分析中也有广泛的应用。

合适的模板是能制备得到对三聚氰胺具有高特异性的分子印迹聚合物的关键。三聚氰胺是一种水溶性极性物质，以三聚氰胺本身为模板制备检测三聚氰胺前处理用分子印迹聚合物，一方面，没有合适的致孔剂，另一方面，存在模板泄漏问题，对三聚氰胺具有高特异性的分子印迹聚合物难以获得。因此，寻找一种与三聚氰胺分子结构类似，而极性相对小些的模板分子非常重要。

发明内容

本发明的目的是克服现有三聚氰胺的检测前处理方法中固相萃取材料存在的问题，提供一种能够高选择性和高特异性识别三聚氰胺，可用于检测三聚氰胺的分子印迹聚合物。

本发明的另一个目的是提供一种操作简单、成本低廉的制备上述分子印迹聚合物的方法。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

针对三聚氰胺其本身不适合作为模板制备分子印迹聚合物，而模板对分子印迹聚合物的特异性具有很重要的作用，所以本发明人在研究和筛选后，发现三聚氰胺是环丙胺嗪(Cyromazine，灭蝇胺)的一种代谢产物，二者之间仅有一个氨基上的取代基不同，而且环丙胺嗪分子中的环丙基增加了其疏水性，有利于聚合体系的致孔剂的选择，其有望作为三聚氰胺的理想替代模板。

本发明选择环丙胺嗪作为模板，采用溶液聚合法、原位聚合法、沉淀聚合法或悬浮聚合法等本领域制备分子印迹聚合物常用的方法，都可以实现本发明，制备得到对三聚氰胺具有高特异性的分子印迹聚合物。

为了进一步提高本发明分子印迹聚合物对三聚氰胺的特异性，本发明人对其制备方法进行了研究和优化。

一种制备本发明分子印迹聚合物的方法，该方法是将模板(环丙胺嗪)、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂在50～80℃聚合4～48h，粉碎后除去模板，制备得到分子印迹聚合物。

上述模板、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂的用量比可选择mmol∶mmol∶mmol∶mL∶mg＝1∶(3～8)∶(15～40)∶(3～200)∶(10～60)。

上述功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酸、丙烯酰胺、2-乙烯吡啶或4-乙烯吡啶等。

上述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯或二乙烯苯等。

上述致孔剂为极性有机溶剂和水的混合溶液，如甲醇和水的混合溶液、乙醇和水的混合溶液、乙腈和水的混合溶液或丙酮和水的混合溶液等。

致孔剂一方面要保证模板的充分溶解，另一方面致孔剂用量对制备的分子印迹聚合物强度、表面特性具有重要影响，同时致孔剂对印迹聚合物在使用介质体系中三聚氰胺的识别也非常相关。因此本发明人对致孔剂进行了优化，结果发现当致孔剂选择甲醇和水的混合溶液时，能够制备出对三聚氰胺具有高度特异性识别的分子印迹聚合物。

因为分子印迹聚合物不能有太多的水分，所以致孔剂混合溶液中有机溶剂和水的比例关系选择甲醇∶水的体积比＝20∶(1～4)能更好的实现本发明，优选10∶1。

上述引发剂可选择本领域常用的任何引发剂，水溶性引发剂或油溶性引发剂都可以实现本发明，如偶氮二异丁腈、过硫酸胺等。

上述粉碎后除去模板，可采用10％乙酸甲醇(乙酸和甲醇按1∶9的体积比混合)、甲醇去除模板。

本发明制备方法的优选方案为：先将模板、致孔剂和功能单体混合制备形成预聚合物，再加入交联剂和引发剂在50～80℃聚合4～48h，粉碎后除去模板，制备得到分子印迹聚合物。

上述方法中，预聚合物的具体制备步骤为将环丙胺嗪和致孔剂溶解混合后，加入功能单体，混合后4℃～8℃静置过夜，形成预聚合物。

本发明的制备方法的更进一步优选方案为：先将模板、致孔剂和功能单体混合制备形成预聚合物，向预聚合物中加入交联剂和引发剂，先低温(如4℃)下用紫外光照射引发光聚合，再50～80℃聚合4～48h，粉碎后除去模板，制备得到分子印迹聚合物。

上述光聚合为4～8℃，聚合4～24h。

本发明的分子印迹聚合物，经试验检测发现：将该聚合物用于固相萃取净化(200mg/柱)，聚合物结合三聚氰胺的吸附量约为300.0μg/g聚合物；自来水、地下和地表水及海水添加三聚氰胺回收率试验表明，在1-50μg/mL添加水平范围内，三聚氰胺回收率大于95％；对饲料、奶粉及牛奶中添加三聚氰胺回收率试验表明，三聚氰胺的回收率高于85％；猪尿中三聚氰胺的回收率大于70％；鸡蛋中回收率高于65％；本发明分子印迹聚合物装填的固相萃取小柱，重复使用10次后，三聚氰胺的回收率仍然大于70％。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明的分子印迹聚合物是采用与三聚氰胺结构类似的环丙胺嗪为模拟模板制备，因三聚氰胺与环丙胺嗪具有相同的分子结构和氨基官能团，合成的聚合物能够选择性地识别三聚氰胺，对三聚氰胺具有高特异性；

2.本发明的分子印迹聚合物采用环丙胺嗪作为模板，一方面，环丙胺嗪极性相对低些，有利于致孔剂的选择，另一方面，可以防止“模板泄漏”；

3.本发明制备分子印迹聚合物时，采用的致孔剂为甲醇和水的混合体系，有利于模板的溶解，同时制备的印迹聚合物在水环境下增加特异识别能力，这正与三聚氰胺存在的试样介质体系一致；

4.本发明的制备方法可以直接将预聚合物中加入交联剂和引发剂然后进行50～80℃聚合固化，还可以先进行低温光聚合后再进行50～80℃聚合固化，这样可以进一步提高分子印迹聚合物的特异性；

5.本发明的分子印迹聚合物在水及含10％以下乙腈或甲醇的水溶液中对三聚氰胺呈现高的亲和性和选择性，回收率大于90％；

6.本发明采用模拟模板法制备MIPs，克服了用目标物本身(三聚氰胺)为模板制备的MIPs用于固相萃取填料时由于模板泄漏而导致的结果不准确问题，本发明以环丙胺嗪为模板制得的MIPs对三聚氰胺的高度交叉反应和显著选择性，作为分析饲料、奶制品、鸡蛋及环境水等基质中的三聚氰胺的样品前处理材料有着广泛的应用前景。

附图说明

图1为三聚氰胺水溶液介质分别经MIPs固相萃取小柱和NIPs固相萃取小柱处理色谱图；

其中，1为三聚氰胺水溶液介质经NIPs固相萃取小柱处理色谱曲线，2为三聚氰胺水溶液介质经MIPs固相萃取小柱处理色谱曲线；

图2为以三聚氰胺为模板的MIPs固相萃取小柱与以环丙胺嗪为模板的MIPs固相萃取小柱分别处理三聚氰胺水溶液的色谱图；

其中，1为三聚氰胺为模板的MIPs固相萃取小柱处理三聚氰胺水溶液的色谱曲线，2为以环丙胺嗪为模板的MIPs固相萃取小柱处理三聚氰胺水溶液的色谱曲线；

图3为三聚氰胺饲料介质水溶液分别经MIPs固相萃取小柱和NIPs固相萃取小柱处理色谱图；

其中，1为三聚氰胺饲料介质水溶液经NIPs固相萃取小柱处理色谱曲线，2为三聚氰胺饲料介质水溶液经MIPs固相萃取小柱处理色谱曲线；

图4为三聚氰胺牛奶介质水溶液分别经MIPs固相萃取小柱和NIPs固相萃取小柱处理色谱图；

其中，1为三聚氰胺牛奶介质水溶液经NIPs固相萃取小柱处理色谱曲线，2为三聚氰胺牛奶介质水溶液经MIPs固相萃取小柱处理色谱曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1用于检测三聚氰胺的分子印迹聚合物

本实施例的分子印迹聚合物，其合成制备步骤如下：

(1)预聚合物的制备

称取0.166g(1mmol)环丙氨嗪模拟模板于试管中，加入5.0mL甲醇/水(10/1，V/V)，超声溶解后，加入功能单体甲基丙烯酸0.690mL(8mmol)，超声5min，4℃静置过夜，形成预聚合物；

(2)光聚合

向上述预聚合物中加入乙二醇二甲基丙烯酸酯5.00mL(25mmol)和偶氮二异丁腈30mg，超声5min，通氮气5min，密封，在4℃，365nm紫外光照射下聚合24h；

(3)聚合固化

将上述光聚合产物转移入60℃水浴中再聚合12h，得到块状聚合物，该块状聚合物即为本实施例的用于三聚氰胺检测的分子印迹聚合物。

将上述块状聚合物磨碎、过200目筛，用丙酮反复沉降除去细小颗粒，装入15×200mm具塞玻璃层析柱中，先用10％乙酸甲醇溶液200mL洗涤除去模拟模板环丙氨嗪，流速控制在1mL/min以下，再用100mL甲醇洗涤除去乙酸，颗粒置60℃真空干燥箱中干燥24h，置干燥器中保存备用。制备好的颗粒填料与合成的块状聚合物相比，收率达62.4％。

非印迹聚合物(NIPs)的制备除不加模板分子外，均按上述方法制备和处理。

实施例2用于检测三聚氰胺的分子印迹聚合物的性能测定

本实施例选择实施例1制备的分子印迹聚合物(粒度为38.5μm～75μm)装填于3mL固相萃取空小柱(200mg/柱)中，依次用3mL甲醇、3mL水平衡活化。

本实施例的样品为0.5、2、10及50μg/mL系列浓度的三聚氰胺水溶液，取2～5mL的样品上样，用3mL水、3mL甲醇洗涤，压干，5％氨化甲醇5mL洗脱。氮气小心吹干，用流动相溶解，高速离心，用HPLC-UV检测，检测结果如图1所示，图中纵坐标的AU是吸光度单位，m＝毫，横坐标代表时间，以分钟(min)为单位。

图1中给出两条色谱曲线，其中1为三聚氰胺水溶液介质经NIPs固相萃取小柱处理色谱曲线，2为三聚氰胺水溶液介质经MIPs固相萃取小柱处理色谱曲线，实验结果表明，系列浓度的三聚氰胺水溶液在分子印迹聚合物(MIPs)固相萃取小柱上回收率大于95％，在非印迹聚合物(NIPs)固相萃取小柱上回收率小于5％。

实施例3用于检测三聚氰胺为模板和环丙胺嗪为模板的分子印迹聚合物的性能测定

本实施例选择实施例1制备的分子印迹聚合物(粒度为38.5μm～75μm)装填于3mL固相萃取空小柱(200mg/柱)中，依次用3mL甲醇、3mL水平衡活化。

本实施例的样品为0.5与10μg/mL三聚氰胺水溶液，取2mL样品上样，用3mL水、3mL甲醇洗涤，压干，5％氨化甲醇5mL洗脱。氮气小心吹干，用流动相溶解，高速离心，用HPLC-UV检测，检测结果如图2所示。

图2中给出两条色谱曲线，其中1为三聚氰胺为模板的MIPs固相萃取小柱处理三聚氰胺水溶液的色谱曲线，2为以环丙胺嗪为模板的MIPs固相萃取小柱处理三聚氰胺水溶液的色谱曲线；实验结果表明，在0.5与10μg/mL的三聚氰胺水溶液2mL上样条件下，以三聚氰胺为模板按实施例1方法合成的MIPs，装填的固相萃取小柱对三聚氰胺的回收率小于40％，环丙胺嗪固相萃取小柱上回收率大于95％。

实施例4制备的分子印迹聚合物固相萃取柱用于饲料中三聚氰胺的测定

本实施例选择实施例1制备的分子印迹聚合物(粒度为38.5μm～75μm)装填于3mL固相萃取空小柱(200mg/柱)中，依次用3mL甲醇、3mL水平衡活化。

本实施例的样品为饲料用1％三氯乙酸提取、离心后，溶液经50％氨水调pH到7.0，用于配制2，10和50μg/mL浓度的三聚氰胺饲料基质提取水溶液。取2mL上样，用3mL水、3mL甲醇洗涤，压干，5％氨化甲醇5mL洗脱。氮气小心吹干，用流动相溶解，高速离心，用HPLC-UV检测，检测结果如图3所示。

图3中给出两条色谱曲线，其中1为三聚氰胺饲料介质水溶液经NIPs固相萃取小柱处理色谱曲线，2为三聚氰胺饲料介质水溶液经MIPs固相萃取小柱处理色谱曲线；实验结果表明，在2，10和50μg/mL的三聚氰胺饲料提取水溶液2mL上样条件下，在MIPs固相萃取小柱上回收率大于90％，NIPs固相萃取小柱上回收率小于10％。

实施例5制备的分子印迹聚合物固相萃取柱用于牛奶中三聚氰胺的测定

本实施例选择实施例1制备的分子印迹聚合物(粒度为38.5μm～75μm)装填于3mL固相萃取空小柱(200mg/柱)中，依次用3mL甲醇、3mL水平衡活化。

本实施例的样品为牛奶用1％三氯乙酸(质量百分比)和2％醋酸铅(质量百分比)提取、离心后，上清液用50％氨水调pH到7.0，用于配制1、5和20μg/mL浓度的三聚氰胺牛奶基质提取溶液。取2mL上样，用3mL水、3mL甲醇洗涤，压干，5％氨化甲醇5mL洗脱。氮气小心吹干，用流动相溶解，高速离心，用HPLC-UV检测，检测结果如图4所示。

图4中给出两条色谱曲线，其中1为三聚氰胺牛奶介质水溶液经NIPs固相萃取小柱处理色谱曲线2为三聚氰胺牛奶介质水溶液经MIPs固相萃取小柱处理色谱曲线；实验结果表明，在1，5和20μg/mL的三聚氰胺饲料提取水溶液2mL上样条件下，在MIPs固相萃取小柱上回收率大于85％，NIPs固相萃取小柱上回收率小于10％。