一种保护缺血性脑损伤的白附子脂溶性成分提取物

摘要

本发明涉及一种中药白附子脂溶性成分提取物，以及该提取物的相应提取方法，更具体地，该提取物的提取方法包括粉碎、溶剂粗提、萃取精提的步骤，得到的脂溶性成分提取物中的活性成分能透过血脑屏障，通过抑制神经细胞的谷氨酸释放能减小脑卒中的脑梗塞面积和减轻脑水肿，并减少神经细胞死亡，同时促进脑缺血损伤运动和认知功能的恢复，降低脑卒中的死亡率和致残率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种对缺血引起脑损伤的保护作用的中药白附子脂溶性成分提取物，属于中药提取物领域。

背景技术

脑缺血性疾病是临床最常见的疾病之一，具有发病率、致残率和病死率高的特点，严重威胁着人类的健康。随着全世界人口逐步老龄化，缺血性脑损伤的发病有逐年增加趋势，但是迄今在国内外仍然缺乏有效的预防和治疗措施。中枢神经细胞对缺氧伤害的高敏感性和缺乏再生能力的特征被认为是导致脑缺血后遗症的主要原因。因此，如何阻止或减轻脑缺血和再灌流后的神经细胞死亡一直是神经科学研究的焦点。缺血性脑损伤包括局部脑血管闭塞(脑梗塞)、心源性休克以及心肌梗塞等原因造成的全脑血流量的减少或中断，它们都能引起神经细胞的死亡。

中药白附子为收载入我国各版药典的常用中药，为天南星科犁头尖属植物独角莲(Typhonium giganteum Engl.)的干燥块茎，自古以来就有用其治疗“中风痰壅、口眼喎斜、痰厥头痛、破伤风”的记载。我国有多个中药组合物专利都把白附子作为其中的一味药用于治疗脑中风及其后遗症，如治疗缺血性中风失语的参南瘫速康胶囊、治疗脑梗塞后失语的开语汤、治疗急性脑血栓的中药牵正散、治疗急性脑出血的中风醒脑口服液等。然而，由于白附子的有效成分不明、缺乏有关白附子在治疗缺血性脑损伤(脑卒中)中的作用及其机制的研究报道，因此白附子的进一步开发和临床应用受到了阻碍。为此，中国协和医科大学陈雪松的博士论文通过各种色谱技术和现代波谱学分析，并辅以化学方法，对白附子进行了化学成分研究，并分离鉴定了23种天然产物，但是这些成分的药理学作用尚未明确，仍无法直接用于临床研究。

而理论上，由于中药的成分相当复杂，因此对中药的提取方法不同，得到的提取物组合也不尽相同。对白附子采用创新的提取方法、并对提取物进行详细的药理学作用研究，将有利于白附子的临床使用。

发明内容

本发明的技术目的在于提供一种白附子脂溶性成分提取物，以及该提取物的相应提取方法，使得该提取物对缺血性脑损伤有临床治疗作用。

为实现本发明的技术目的，本发明的技术方案为：

一种保护缺血性脑损伤的白附子脂溶性成分提取物，其特征在于该提取物是采用以下方法提取得到的：

(1)粉碎：将白附子原料粉碎至100～10目；

(2)溶剂浸提：用基于药材重量1～3倍的95％乙醇浸提24～48小时后，过滤并减压蒸馏浓缩干燥，回收乙醇，得到白附子粗提物；

(3)将粗提物溶解于水，加入到分液漏斗中，然后加入等体积萃取剂萃取三次，将三次萃取的有机层合并后减压蒸馏浓缩，干燥后即得到白附子脂溶性成分提取物。

本发明所述的保护缺血性脑损伤的白附子脂溶性成分提取物的提取方法，包括：

(1)粉碎：将白附子原料粉碎至100～10目；

(2)溶剂浸提：用基于药材重量1～3倍的95％乙醇浸提24～48小时后，过滤并减压蒸馏浓缩干燥，回收乙醇，得到白附子粗提物；

(3)将粗提物溶解于水，加入到分液漏斗中，然后加入等体积萃取剂萃取三次，将三次萃取的有机层合并后减压蒸馏浓缩，干燥后即得到白附子脂溶性成分提取物。

本发明所述的保护缺血性脑损伤的白附子脂溶性成分提取物及其提取方法中所述的用95％乙醇浸提方法包括震荡法浸提或回流法浸提；

本发明所述的保护缺血性脑损伤的白附子脂溶性成分提取物及其提取方法中所述的萃取剂包括饱和正丁醇、乙酸乙酯或石油醚；

本发明所述的保护缺血性脑损伤的白附子脂溶性成分提取物在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。

本发明的有益效果在于：(1)采用震荡或回流浸提、溶剂萃取等方法，对中药白附子进行了提取、纯化，得到了白附子的脂溶性混合物，该提取、纯化方法简单、快捷，无毒副作用，该混合物的有效成分能快速通过血脑屏障进入脑内，具有直接调节脑神经系统功能的作用；(2)对白附子脂溶性混合物进行了系列动物药理实验，实验结果证明本发明所述的白附子脂溶性混合物能够保护缺血性脑损伤，具体的说，该混合物能透过血脑屏障调节神经系统功能，能减小脑卒中的脑梗塞面积和减轻脑水肿，并减少神经细胞死亡，同时促进脑卒中后运动和认知功能的恢复，降低脑卒中的死亡率和致残率。

附图说明

下面实施例将结合附图和动物药理实验对本发明作进一步的详细说明；

图1白附子脂溶性成分对脑缺血引起神经细胞死亡的作用；

注释：BF：白附子脂溶性成分提取物；4VO：四血管阻断(全脑缺血)；

^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01(与脑缺血模型的生理盐水处理组相比)。

图2白附子脂溶性成分对脑缺血后记忆力损伤的作用；

注释：BF：白附子脂溶性成分提取物；

^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01(与脑缺血模型的生理盐水处理组相比)。

图3白附子脂溶性成分对缺血性脑梗死的作用；

注释：BF：白附子脂溶性成分提取物；MCAO：大脑中动脉阻塞；^*表示P＜0.05。

图4白附子脂溶性成分对缺血后脑水肿的作用；

注释：BF：白附子脂溶性成分提取物；^*表示P＜0.05。

图5白附子脂溶性成分对脑缺血后运动功能损伤的作用；

注释：BF：白附子脂溶性成分提取物；假手术不给药组的运动速度作为100％；^*表示P＜0.05。

图6白附子脂溶性成分对脑卒中死亡率的影响；

注释：BF：白附子脂溶性成分提取物；^*表示P＜0.05。

图7白附子脂溶性成分能透过血脑屏障调节神经系统功能的分析。

注释：BF：白附子脂溶性成分提取物；^*表示P＜0.05。

具体实施方式

实施例1

本实施例说明白附子脂溶性成分提取物的提取方法。

(1)粉碎：将中药白附子原料50g(天南星科犁头尖属植物独角莲(Typhonium giganteumEngl.)的干燥块茎，购自河南禹县)粉碎至100目；

(2)溶剂浸提：加入基于药材重量1倍的95％乙醇密封，在转速150rpm的摇床上震荡浸提48小时后，过滤并减压蒸馏浓缩干燥，回收乙醇，得到粗提物；

(3)将粗提物溶解于水，加入到分液漏斗中，然后加入等体积饱和正丁醇萃取三次，将三次萃取的有机层合并后减压蒸馏浓缩，干燥后即得到白附子脂溶性成分提取物。

实施例2

本实施例说明白附子脂溶性成分提取物的提取方法。

(1)粉碎：将白附子原料20g(天南星科犁头尖属植物独角莲(Typhonium giganteum Engl.)的新鲜块茎，购自安徽毫州市)粉碎至50目，除去水分，填装于层析柱中；

(2)溶剂浸提：用基于药材重量3倍的95％乙醇以50mL/min的流速通入层析柱底部循环回流浸提36小时后，过滤并减压蒸馏浓缩干燥，回收乙醇，得到粗提物；

(3)将粗提物溶解于水，加入到分液漏斗中，然后加入等体积乙酸乙酯萃取三次，将三次萃取的有机层合并后减压蒸馏浓缩，干燥后即得到白附子脂溶性成分提取物。

实施例3

本实施例说明白附子脂溶性成分提取物的提取方法。

(1)粉碎：将白附子原料100g(天南星科犁头尖属植物独角莲(Typhonium giganteum Engl.)的干燥块茎，购自河南禹县)粉碎至10目；

(2)溶剂浸提：加入基于药材重量1.5倍的95％乙醇密封，在转速150rpm的摇床上震荡浸提24小时后，过滤并减压蒸馏浓缩干燥，回收乙醇，得到粗提物；

(3)将粗提物溶解于水，加入到分液漏斗中，然后加入等体积石油醚萃取三次，将三次萃取的有机层合并后减压蒸馏浓缩，干燥后即得到白附子脂溶性成分提取物。

实施例4

本实施例说明采用本发明所述的提取方法得到的白附子脂溶性成分提取物的药理实验。

由于不同形式的脑缺血所造成的神经损伤程度有所不同。大脑中动脉闭塞主要的病理表现是纹状体、大脑皮层和海马等脑区组织的梗死和脑水肿，具有非常高的死亡率和致残率。全脑缺血则选择性地损伤对缺氧敏感的中枢神经细胞(如海马CA1区神经细胞)，出现记忆力减退。因此，本发明将分别用大脑中动脉阻塞(MCAO)手术来摸拟脑卒中模型，椎动脉和颈总动脉夹闭作为全脑缺血的动物模型，来观察腹腔注射白附子脂溶性成分提取物对脑损伤的保护作用。

由于本发明所述的白附子脂溶性成分提取物(图中简称BF)具有较难溶于水的特点，因此，在动物实验时需要先将白附子脂溶性成分提取物溶解于二甲亚砜(DMSO)或99.5％乙醇中，然后再用生理盐水将白附子脂溶性成分提取物稀释到治疗所需浓度(以保持DMSO和乙醇的最终浓度在5％以下)。

Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重200g～250g，购自江苏省实验动物中心)接受白附子脂溶性成分提取物(1mg/kg、5mg/kg、50mg/kg)腹腔注射后，与注射生理盐水的对照组((呼吸：50～60次/分钟，心率：305～400次/分钟，平均动脉压：90～110mmHg)相比均未出现明显的毒性反应(昏睡、狂躁、呼吸/心率/血压的改变)和副作用(运动行为异常等)。

实验1：白附子脂溶性成分对脑缺血引起神经细胞死亡的作用(图1)

实验主要材料：Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性和雌性各50只)，体重200g～250g，购自江苏省实验动物中心。

实验操作：10％水合氯醛腹腔麻醉，电凝双侧椎动脉，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉20min(改良的Pulsinelli’s四血管阻断法，图中简称：4VO)，制备短暂性(20分钟)全脑缺血大鼠模型(用电热毯以保持实验动物肛门温度在37±0.5度)。在缺血后的8小时开始分别用不同浓度(1mg/kg、5mg/kg、50mg/kg)白附子脂溶性成分提取物(图中简称BF)进行腹腔注射，共给药两次(间隔8小时)。另外，在缺血后的不同时间点(1小时、8小时、24小时)开始分别用5mg/kg白附子脂溶性成分提取物进行腹腔注射，共给药两次(间隔8小时)。脑缺血后第8天，用4％多聚甲醛经左心室灌注固定脑组织。石蜡包埋后，做海马连续切片。1％甲苯胺蓝染色后，测量海马CA1区存活锥体细胞的密度(锥体细胞层每毫米长度中颗粒细胞数)。实验A：脑缺血手术组共40只大鼠(其中不同给药计量组分别是10只大鼠)；假手术组(对照组)10只大鼠。实验B：脑缺血手术组共40只大鼠(其中不同给药时间每组分别是10只大鼠)；假手术组(对照组)10只大鼠。

实验结果：如图1A所示，20分钟全脑缺血引起大约60％的海马CA1区神经元死亡丢失。脑缺血后8小时，按每公斤体重5～50mg量注射白附子脂溶性成分提取物给药能浓度依赖地减少海马CA1区的神经细胞死亡数。并且在脑缺血后1～24小时内，按每公斤体重5mg量腹腔注射白附子脂溶性成分提取物都能保护脑缺血引起神经细胞死亡(图1B所示)，提示白附子脂溶性成分能阻止缺血引起的神经细胞死亡。

实验2：白附子脂溶性成分对脑缺血损伤记忆力损伤的作用(图2)

实验主要材料：同实验1。

实验操作：全脑缺血大鼠模型制备和白附子脂溶性成分提取物用药与实验1相同。在脑缺血后的第3～7天内进行水迷宫测试，检查空间记忆功能。记录大鼠的运动轨迹，计算登台潜伏期。实验A：脑缺血手术组共40只大鼠(其中不同给药计量组分别是10只大鼠)；假手术组(对照组)10只大鼠。实验B：脑缺血手术组共40只大鼠(其中不同给药时间每组分别是10只大鼠)；假手术组(对照组)共10只大鼠。

实验结果：20分钟全脑缺血引起逃避潜伏期延长，提示空间认知功能降低。在脑缺血后8小时，按每公斤体重5mg～50mg量注射白附子脂溶性成分提取物治疗能明显改善脑缺血造成的逃避潜伏期延长(图2A)。同样，在脑缺血后1～24小时按每公斤体重5mg量注射白附子提取物都能够改善脑缺血引起的记忆力的减退(图2B)，提示白附子脂溶性成分能改善脑缺血引起的空间认知功能减退。

实验3：白附子脂溶性成分对缺血性脑梗死的作用(图3)

实验主要材料：昆明小鼠(雄性和雌性各40只)，体重25g～30g，购自江苏省实验动物中心。

实验操作：10％水合氯醛腹腔麻醉，结扎右侧颈总动脉与颈外动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉远心端，将渔线插入颈内动脉远端，实施大脑中动脉60分钟阻塞(大脑中动脉阻塞在图中简称MCAO)，制备局灶性脑缺血小鼠模型(用电热毯以保持实验动物肛门温度在37±0.5度)。在脑缺血后8小时按每公斤体重1mg或5mg量进行白附子脂溶性成分提取物腹腔注射，共给药两次(间隔8小时)。脑缺血后24小时取出全脑，放置-20度冷冻10分钟，做全脑1毫米厚冠状连续切片。用2％TTC染色后，进行image J软件处理图像分别测出每张脑片梗死区及非梗死区的面积。计算脑梗死体积的百分比：(梗死区体积平均值/缺血侧(MCAO)大脑半球体积平均值)×100％。脑缺血手术组共40只小鼠(其中脑缺血后给药和不给药组分别是20只小鼠)；假手术组(对照组)共40只小鼠(其中给药和不给药组分别是20只小鼠)。

实验结果：如图3所示，60分钟的大脑中动脉阻塞引起缺血侧脑出现大约40％梗死(点线指示部本)。脑缺血后8小时按每公斤体重5mg量白附子脂溶性成分提取物进行治疗能明显减少缺血性脑梗死的体积，提示白附子脂溶性成分能够减轻脑缺血后的脑梗死。

实验4：白附子脂溶性成分对缺血后脑水肿的作用(图4)

实验主要材料：同实验3。

实验操作：脑缺血大鼠模型制备和白附子脂溶性成分提取物用药与实验3相同。脑缺血后24小时快速断头取出全脑，采用干湿相对密度法测定左右半脑含水量，并且按照Elliott公式[(WW-DW)/WW]×100％计算脑含水量，推出脑水肿的程度。脑缺血手术组共40只小鼠(其中脑缺血后给药和不给药组分别是20只小鼠)；假手术组(对照组)共40只小鼠(其中给药和不给药组分别是20只小鼠)。

实验结果：如图4所示，脑缺血引起脑含水量13.5％的增加，提示有脑水肿的发生。在脑缺血后8小时按每公斤体重5mg剂量白附子脂溶性成分提取物进行治疗能减轻脑水肿，提示白附子脂溶性成分能够减轻缺血后脑水肿。

实验5：白附子脂溶性成分对脑缺血后运动功能障碍的作用(图5)

实验主要材料：与实验3相同。

实验操作：脑缺血小鼠模型制备和白附子脂溶性成分提取物用药与实验3相同。脑缺血后7～8天，进行开场实验，检测脑缺血后小鼠的运动功能(包括运动速度、站立次数)。脑缺血手术组共40只小鼠(其中脑缺血后给药和不给药组分别是20只小鼠)；假手术组(对照组)共40只小鼠(其中给药和不给药组分别是20只小鼠)。

实验结果：在脑缺血后8小时按每公斤体重5mg剂量白附子脂溶性成分提取物治疗能够显著地改善小鼠的运动功能，提高运动速度(厘米/秒)，提示白附子脂溶性成分减轻脑梗塞和脑水肿能改善脑缺血后运动功能障碍。

实验6：白附子脂溶性成分对脑卒中死亡率的影响(图6)

实验主要材料：与实验3相同。

实验操作：脑缺血小鼠模型制备和白附子脂溶性成分提取物用药与实验3相同。脑缺血手术组共40只小鼠(其中脑缺血后给药和不给药组分别是20只小鼠)；假手术组(对照组)共40只小鼠(其中给药和不给药组分别是20只小鼠)。

实验结果：我们的早期研究和其他研究室的报道同样，60分钟的大脑中动脉阻塞能引起手术后小鼠的死亡率高达50％。我们发现在脑缺血后8小时给于按每公斤体重5mg量白附子脂溶性成分提取物的治疗，能降低脑卒中小鼠的死亡率到10～15％。

实验7：白附子脂溶性成分能透过血脑屏障调节神经系统功能的分析

实验主要材料：Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性和雌性各10只)，体重200g～250g，购自江苏省实验动物中心。

实验操作：通过记录神经细胞的去极化，分析海马的神经系统功能(Chen等J.Neurophysiol.94：4131～4144)。本研究室在5mg/kg白附子脂溶性成分提取物(图中简称BF)腹腔注射后1小时，10％水合氯醛腹腔麻醉，取出全脑，制作海马脑片。用膜电位感应色素RH155对海马脑片进行染色(5分钟)，然后电刺激Schaffer collateral侧枝连续检测海马CA1区兴奋性突触后膜电位(EPSP)。根据荧光的强度、面积和持续时间能计算神经细胞膜的去极化程度(红色＞绿色＞蓝色，图7A)。用荧光信号的幅度(图7B)来计算突触传递强度和神经细胞去极化程度。给药组和溶剂组(对照组)各10只。

实验结果：与对照组相比(细胞膜电位作为100％)，白附子脂溶性成分提取物(5mg/kg)腹腔注射后能明显减小兴奋性突触后膜电位(EPSP)和锥体细胞的膜电位(红色荧光减少，图A)，并且荧光信号幅度也显著降低(图7B)，组间比较具有显著的统计学意义(图7C)，提示白附子脂溶性成分提取物的活性成分能透过血脑屏障，调节神经系统功能。