快速基因分型分析和分析设备

摘要

本发明涉及一种用导流方式的快速核酸检测方法。本发明的方法包括单一步骤的信号放大和/或单一步骤杂交协议。利用导流杂交程序，本发明提供了一种更有效，更快速和更便宜的基因分型方法。本发明进一步提供基于单核苷酸多态性(单核苷酸多态性)的DNA指纹分析方法，以提供快速和准确的、对于从人类和其他不同的生物的遗传物质的基因分型，鉴定以及DNA分析。此外，本发明还披露可快速和灵敏分析目标分析物的设备。

说明书

这项申请的专利发明是以美国优先编号11/398433，在2006年4月4 日提交的申请为基础。其全部内容现纳入这一申请以作参照。

在此申请中也引用各种与本申请有关的文献。这些出版文献物所披露内 容也纳入作为这一申请的参照，以便更充分地说明与本发明所涉及的现状， 以表明本发明的创新性与优异性。

技术领域

本发明涉及的是为基因分型分析提供快速的分析方法及其分析 仪器配备。以人类白细胞抗原(HLA)的复杂基因组为例，通过导 流杂交原理及其分析仪器配备作DNA的快速分析，人类白细胞抗原 (HLA)的基因最终确定其所属类型。本发明还涉及的快速方法， 不但可使用于白细胞抗原(HLA)，也可用于一个人的任何基因或 任何生物体的DNA分析，作最终确定基因序列的诊断，基因分型或身 份。

背景技术

在接受器官或骨髓移植(Thomas，1983)时，以防止发展的急 性移植物抗宿主病(移植物抗宿主病)，捐助者和病人的HLA必须匹 配。所以准确的HLA分型是必不可少的。过去一般标准的方法是以血 清的HLA抗体/抗原分析来完成匹配(Mach et.Al.，1990)，这是 不完全准确的。最近的研究表明，DNA的基因分型可以提供更准确 和更明确的结果(Kaneshige et.Al.，1993；Chow and Tonai，2003； Mach et.Al.，2004)。实验结果显示，以DNA分析HLA-DQ、DR 和DP的基因能准确把它们分型，以此提供的数据可以进行精确匹配， 为病人选择器官捐献者(谭荣安，1998年；2004年2005年2006 年)。

人类白细胞抗原基因分型采用序列特异性引物聚合酶链反应 (SSP-PCR)扩增技术已在文献上记载。然而，由于HLA的高度多态 性的特性，HLA-DQ、DR和DP等位基因的数目很多。所需的SSP特 异性等位引物过百，因此，超出了多重SSP-PCR扩增反应的一般有效 数目，不容易得到理想扩增量。所以，目前市场上用的一套试剂盒， 用的是96个单独的SSP-PCR分离聚合酶链反应过程中进行，然后通 过凝胶电泳分离分析DNA片段大小来确定。这不仅费时而昂贵，而且 容易因操作繁复出错，用凝胶电泳分离片段大小有其局限性。

因此，DNA测序仍被视为作准确的基因分型的人类白细胞抗原 簇方法的首选。不幸的是，由于有高度同源序列的假基因 (pseudogene)存在，可以在PCR扩增过程中与真基因共同扩增而产 生的DNA片段便会干扰结果，使DNA测序不能准确的基因分型。就算 可以也会增加困难而使费用昂贵。

本发明公开了一种快速分析人类白细胞抗原基因的方法。采用 改进的导流形式使靶DNA分子快速通过固定在薄膜上的等位基因特 异性寡核苷酸(核苷酸)探针而被捕获，从而准确地测定各HLA-DP； DR和DQ的等位点序列。用这是描述在美国专利号5471547和 6020187的导流杂交方法，采用已改进的快速退火工艺，使用非常低 廉的装置便能准确地检测基因特异序列，作基因分型和指纹分析。

以限制性片段长度多态性(RFLP)作DNA指纹首次在1985年 (Gill et.al.)提出对人类身份识别测定方法，随后也确定可适用 于其它生物的身份识别。在实际应用中，如法医鉴定嫌疑人在刑事案 件中，对亲子关关的争端和建立或核实身份等，DNA指纹图谱已被广 泛接受的最佳工具。因RFLP方法耗时，已逐步被首次于1991年 (Edwards et.al.，1991)发明利用PCR扩增分析一些短串联重复 序列(STR)的高通量自动化的进程取代。STR指纹图谱的优异性， 是以10，16，18或更多的STR在人类基因组中不同位置的STR 基因位点作大量的PCR扩增，理论上只要一个细胞便有可能足够成为 身份识别的样品。然而，STR和/或可变数目串联重复序列(VNTR) 是相对昂贵的，因为这些方法需要使用先进的设备或像南方杂交所需 的劳动力密集和长时间的分析过程。同时零星的突发性的基因突变 (Chakraborty and Stivers，1996)可能会降低这方法的准确性从 而降低其最终鉴定能力。此外，STR的研究数据显示，基因突变频率， 尤其是在癌症患者，情况并不少见。因此，新的替代方法是必要的。

单核苷酸多态性(SNP)用作基因分型提供了更大的分辨能力 (discriminating power)，所以，选择适当数量的单核苷酸多态性位 点可发展成法医或个人的个人身份的有效检察系统。单核苷酸多态性 (SNP)的选择条件是：(1)各位点(或位点组)必须在基因体内分 隔开的(unlinked)(2)各单核苷酸多态性(SNP)位点的多态性愈 高分辨能力愈大，但同时该位点的零星的突发性的基因突变频率不能 高于STR或VNTR。本发明提供了一种方法，利用单核苷酸多态性探 针及导流杂交系统迅速测定基因单核苷酸多态性DNA指纹图谱。最终 用于生物识别的个人，如人，动物，植物或任何生物体的身份。同时 也可作基因分型。

发明内容

本发明描述一种更好检测白细胞抗原的DNA序列的方法，便是 以等位基因特异性寡核苷酸作个探针的反向斑点(ASO-RBD)，以导 流杂交技术进行快速杂交确认靶DNA的特异性序列。这在HLA-DP；DR 和DQ的测试中，能够提供准确的基因分型结果。本发明提供了一种 有经济实效成本程序的HLA鉴定方法，只用几对引物进行一个简单的 多种PCR反应同时扩增HLA基因群，然后以适当所需数量的寡核苷酸 探针点膜成低密度阵列格式，通过导流杂交测定。因为这方法能分辨 一个单核苷酸的变异，即使假基因(pseudogene)也被扩增，特异性 的探针最终也不会把它捕测出来，人类白细胞抗原的分类便能准确分 型。因此，这是一个远远比其它目前所用的DNA或血清学测试优越的 方法。这发明提供了一个HLA分型技术，速度更快，更简单，不需要 昂贵的设备，因此成本较直接DNA测序和多重PCR电泳程序更低，更 精确。

在图6所示的引物及探针对HLA基因型DP；DR和DQ的分类分型 已经测试并证实是有用的。引物和探针的设计计划是根据图1所示而 筛选出来的。当然，额外的引物和/或寡核苷酸探针可以根据图1 所示而再筛选更多出来，经重复测试和验证，便能把HLA基因全面的 分型。虽然，在这里的例子用的是PCR扩增技术，其它任何方法能扩 大产生足够数量的目标靶DNA序列，用足够数量的寡聚数量的探针， 通过杂交分析也能达到分析结果。如果未经扩大而目标靶DNA序列的 数量足够，没有必要进行扩增，只要把它加上所需的标记，便可以通 过杂交分析。

虽然这个例子是应用在人类白细胞抗原基因分型的，以此单核 苷酸多态性(SNP)的基因技术可以适用于其它遗传基因和/或任何 DNA序列、任何生物体的基因。只要根据图1所描述的程序，设计探 针及引物。利用未本发明及类似的装置，或任何新的导流杂交过程都 可以进行基因分析使用。

本发明除以单一多态性核苷酸作DNA指纹、基因分型外，这方 法也可用于确定基因片段，或多态性的基因，是否有所改变或基因功 能因核苷酸变异的问题找出答案。本发明可用于快速，彻底查明传染 病病毒与其分类，遗传性疾病所引起的特定DNA序列，或者存在或缺 乏这种传染病基因或DNA序列，造成遗传性疾病的病因。

本发明提描述快速核酸检测的方法，包括步骤：(a)取得的 样本包括一个目标靶核酸分子；(b)混合的目标靶核酸分子(i)第 一探针将结合核酸分子，以及(ii)第二试剂，将与第一次探针 结合，从而在溶液中形成一个核酸分子的复合体；(c)把核酸分子 的复合体溶液流经薄膜芯片，在薄膜芯片上的第三个探针将复合体捕 获，含目标靶核酸分子的的复合体从而被捕捉在芯片上；和(d) 显色反应检测被俘的核酸分子在芯片上的图像结果。

本发明提描述快速核酸检测的方法，包括步骤：(a)取得的 样本包括一个目标靶核酸分子；(b)混合的目标靶核酸分子(i)第 一探针将结合核酸分子，(ii)第一抗体，和(iii)标记剂，其 中的第一个探针将与目标核酸分子形成一个复合体，第一抗体将与目 标核酸分子所产生的复合体结合成混合体(c)把核酸分子的混合体 溶液流经薄膜芯片，在薄膜芯片上的第二抗体，将与结合第一抗体结 合，从而捕捉核酸分子在芯用片上；和(d)检测捕获的核酸分子。

本发明还提描述快速确定甲基化程度的核酸分子组成的方法， 包括步骤：(a)取得的样本包括一个目标靶核酸分子；(b)二硫 化处理目标靶核酸分子，从而改变DNA上甲基化的GC变成TG，而没 有甲基化的CG保持不变；(c)扩增目标靶核酸分子；(d)以导 流的方式把扩增了的核酸分子流进含有甲基化及非甲基化CG的探针 组成的薄膜芯片，从而进行杂交捕捉相对的目标序列在芯片上显示； 和(e)在芯片上被俘的目标靶核酸序列分子测定其定性、定量， 其中每对甲基化和非甲基化CG在其等位点的杂交显色强度，便可计 算确定其甲基化的百分比。从而得到一组或多组基因甲基化情形的图 谱。

本发明还提供了一个装置能够执行上述的各种检测方法。

本发明还提供了横向导流杂交装置包括：(a)把探针固定 在薄膜上(捕获分子)，使能捕获目标靶分子进行分析，其中固定薄膜 的反应室，将会能准确调控，使其能够保持在化学反应所要求的条件 进行；(b)调控装置。用以调节、保持反应室中的反应条件；(c) 电源和控制装置；和(d)一个能有效的传送液体的输送系统。把 液体输入和输出反应室保持及调节其横向流动的方向与流速，使溶液 流经膜孔横截面，使所有的目标靶分子通过固定于薄膜芯片的探针而 被捕获，从而提供高灵敏度的分析检测。

本发明还提供了此处所述的横向导流杂交系统，提供可调控的 杂交设备。其中包括一个及多个的杂交装置，每个杂交装可分别连接 到能够提供能量的电源和控制单元。

本发明还提供了横向导流杂交装置，其中包括：(a)一个 或以上的反应室，每个反应室包括有探针的薄膜捕芯片，能够捕获目 标分子；(b)调控装置。用以调节、保持反应室中的反应条件；(c) 电源和控制装置，连接到反应室，可以调节和保持到所需的反应条件； 和(d)一个能有效的传送液体的输送系统。把液体输入和输出反 应室保持及调节其横向流动的方向与流速，使溶液流经膜孔横截面， 使所有的目标靶分子通过固定于薄膜芯片的探针而被捕获，从而提供 高灵敏度的分析检测。

附图简要说明

图1A款显示的本发明的方法，从基因数据库(或各自筛查得来 的基因资料)中建造特异性核苷酸探针(ASO)及PCR引物的程序。这个 程序适用于任何预定基因或序列片段作为测验目标。

图1B显示本发明从基因数据库(或各自筛查得来的基因资料)中 为HLA分型而建造特异性核苷酸探针(ASO)及PCR引物的详细程序。 根据这程序，HLA寡核苷酸探针的位置、核苷酸基的长短、探针数目； PCR引物等，可从基因数据库筛查出来，经所述的是实验程序反复研 验，得到预定的准确分型目标。最后可制成预期的分型试剂盒。

图1C显示本发明所述方法，选定所测试的基因靶序列的位点片 段、数目，从而设计引物和相对的单核苷酸多态性探针，作以SNP 为基础的DNA指纹鉴定法。

图2显示本发明的薄膜芯片设计可作高通量分析。

图3显示了本发明的薄膜芯片和相对的小型杂交装置。这一个 或多个同样的装置可连接到中央控制机上，得到电源及其它的调控功 能，作横向导流杂交反应，完成测试。在这图所示杂交装置，测试全 部程序都可在此小型反应室中进行。几个杂交反应(几个不同的样品， 或同一样本而不同基因组、等位点)可同时在一个单一的横向导流杂 交装置或在几个装置(可各自单独调控在不同条件下进行)同一时间 举行测试。在这横向杂交置可在每个反应格中以nxm点阵(阵列)或 线条性阵列(显示)的形式固定探针。在反应过程中，被测试靶DNA 溶液从薄膜的一边流向芯片阵列的另一端(即如，从东到西，或从北 向南的方向)流经薄膜，其检测的灵敏度便能大幅度增加。灵敏程度 的增加取决于探针点或线在膜上所占的的面积和总面积的比例。举例 来说，假定膜面总面积为100毫米平方(100mm2)，斑点大小是1 毫米平方(1mm2)。在专利技术US5742647所述的导流过程(溶液从 顶部表面通过膜到底层的另一边的传统的导流程)中，含靶分子的总 溶液只有1/100的流经该探针点而被探针固定在膜上。但是，如以 横向导流，通过使用过程中，其灵敏度则与探针点的直径和膜的宽度 比率。如以总面积为10毫米×10毫米的膜计算，通过1平方毫米探 针点的液体约1/10，理论上，灵敏度便比传统导流杂交技术增加 10倍。当以线儿条阵列形式进行横向导流通过杂交，灵敏度将进一 步提高，因为所有的目标分子将通过探针线跨越薄膜。所以横向导流 杂交的定量分析更准确。

图4显示了用本发明对中国的人样品测试人类白细胞抗原- DPB1基因分型的结果。

图5显示用本发明的方法测试而得的中国人白细胞抗原DPB1等 位基因与基因类型的频率。

第6A至6F记录了已经实验验证有效的各寡核苷酸探针的核苷 酸序列及作为扩大对相应的基因片段进行人类白细胞抗原基因分型 的扩增引物序列。

图7显示了本发明所用的低密度基因芯片例子，芯片中加上了 不同的内参点，确保实验的程序、内控(内部和参考)、样品和反应 试剂功能正确。。

图8显示了一套以单核苷酸多态性探针、引物和所用的等位点 基因进行作DNA指纹分析的图谱。图8所示两个人的单核苷酸多态性 图谱多个基因点成像不同，可以确定两者并非同一身份。

图9显示的是测试病毒基因分型的典型的例子。芯片图片所示 为人类乳头瘤(HPV)病毒基因分型测试临床样本，其中芯片用的探针 是最常见的23种不同的类型。所加上的通用探针是不分型的全亚型 HPV探针。可以检测全部亚型，故其它不在这23型的罕见的类型也 可检验出来。

图10所示本发明的另一个例子，以芯片形式检测上呼吸道所感 染的病原体。

图11显示的测试在基因甲基化的方法。以本发明的导流杂交法， 以甲基化特异性PCR扩增，对基因中的CpG岛进行不同程度的甲基化 试验。方法包括：先以二硫化碳改变甲基化DNA链中的CmG为TG， 其中未被甲基化的CG片段保持不变。因此，TG/CG在该CpG岛位点 上的比率，可用甲基化特异性引物作实时PCR定量扩增(MS-PCR或 QMS-PCR)去确定。也可用共同扩增后，其次是甲基化特异性探针和非 甲基化特异探针经杂交定量确定。如本发明所述，导流杂交可以更有 效的为甲基化作出测试。如图11A所示。未有甲基化的片段被非甲基 化探针捕获而芯片中显色。甲基化的片段则被甲基化探针捕获在芯片 B的相应位置显色。如图11C所示，如所有的基因片段未被甲基化， 各个甲基化的探针点便不会显示任何信号。同样，从不同的芯片显像 图中，可以得到各种不同程度的甲基化基因资料。这些资料如果能正 确地反映该一个或组基因的表达功能，如能找出这些基因与某些疾病 (如癌症)的发病机理有关。便可利用这些可能涉及病情的在基因的不 同强度甲基化比率去预测定病情，作早期诊断用途。

图12显示的横向导流杂交反应装置的组合。这组合。可支持一 个或多个一次性的反应装配而有一般免疫测试条用横向导流快速检 测方法的所有优势。当把这些反应装置配合控制组装，便可以把反应 条件作最严格的调控，以最短的时间达到比任何常规方法具灵敏度和 特异性更高的核酸分析方法。

图13描述了一步杂交法的计划。

图14描述传统杂交法和一步式信号放大的导流杂交检测法的比 较。

图15所示是检验上呼吸道感染病的病原体所用的引物和探针序 列。除了那偏肺病毒(Metapneumovirus)外所有序列都已有文献报告 了(Grondahlet.al.，J.Clinical Microbiology 37：1-7(1999)。 用于偏肺病毒测试的引物和探针序列则以马偕(Mackay et/ al.，41：100-105，2003)等人所报告了的。

图16所示的是检验癌症用的一些分子标记。

图17所示的是负责调控的新陈代谢导致细胞稳态 (homeostasis)的一部分基因。

图18所示的是检验甲基化比率用的特异性引物和探针序列的一 些例子。

图19所示的是甲基化检测的一些可能有应用价值的基因。

本发明所描述的技术与所选的装置体现了发明技术本质。但是 必须理解，这不能作为限制本发明所描述的体例。相反的，本发明根 据的是要覆盖所有的替代办法，修改和现金等价物可能包括在精神和 范围的发明所规定的附加要求。

发明概述

一，基因分型

下面介绍本发明从基因组序列数据库获得人类白细胞抗原基因 分型寡核苷酸探针和PCR引物，并履行人类白细胞抗原基因分型分 析的方法：

1.选择适当的基因片段并确定适当的PCR引物和ASO探针的 位点及序列

从基因数据(GenBank)和/或在人口筛查而得到的HLA基因序列 数据中进行分析而筛选出最适合的一个或一组基因片段(或序列)作 为分析目标。从该等片段内选择适当的单核苷酸多态性探针及PCR 引物进行HLA基因分型。

本发明选择适当目标靶序列的方法详情如下：

从基因数据(GenBank)和/或在人口筛查而得到的HLA基因序列 数据中找出所有人类白细胞抗原的DNA序列(如：HLA-I类或II类 等)和亚型(即HLA-DP；DR；DQ等)。把这些HLA DNA序列分别 以类别、亚型作详细分析比较(align)而找出其中多态性最高的区域， 并查看是否可作为恶最适当的HLA基因分型片段。

在这多态区域内，选定聚合酶链反应(PCR)引物。条件是：用这 些亚型片段两旁的保守序列，这样便能找出最少数目的引物，而能在 扩增时可以把所有预检亚型全部扩增出来。增加扩增的效率。使用本 发明的导流杂交过程作进一步的分型分析结果。

为了验证这些引物是确实有用的，本发明采用了大量的随机抽 样作PCR扩增而取得令人满意的统计数据。所用的引物(一对或多对) 必须有效地把样品的片段扩增成功，确保不会造成由于扩增进程而产 生假阴性。此外，统计验证，内参对照(IC)，以确保试验样品中不 存在PCR抑制物质而，防止PCR扩增反应。

设计的IC(可能是1个或多个)将取决于测试需要。在本发明 用的HLA和SNP指纹实例，内参对照(IC)取用人类基因组中的的 序列将与所测验的基因序列完全没有同源性。(即这序列片段完全和 被检查的基因无关)。由于人类细胞中大多是二倍体(除生殖细胞系 外)的基因组，因此基因的定量问题是非常简单，理论上该基因测试 点的相对浓度应该是1(纯合子)或0.5(杂合子)。因此，两种 不同的序列片段两侧的同一序列的PCR引物可用作内参对照(IC)。 这意味着，使用片段不同的目标片段进行分析，人们可以利用已知纯 合子和杂合子序列的片段的基因特征为探针(这是两个不同的探针的 片段：1是纯合子；1是杂合子)。因此，这些内参对照(IC)浓度 比例可以计算的。理论上由于PCR扩增用同一引物，不影响两者的 相对浓度，其信号比率是2∶1。信号的强弱波动因杂交效率而变。 所以这两个内参对照(IC)的比例为2∶1可作为分办该为基因位点是 纯合子或杂合子的参考值。如果观察结果表明只有一个等位基因信 号，其相对值是小于或等于0.5的纯人合子IC的信号或其信号值比 较接近杂合子(IC)的信号，这意味着这位点有流失(LOH)的可能性， (即是：可能在这两个染色体中，其中个已经失去或不能放大)，应进 行调查。如结果是一个点，表明这两个染色体的基因是相同的，因此， 浓度应该更接近于与纯合子(IC)的信号相若而比杂合子(IC)信号 强。因此，内参对照(IC)是很重要的，因为它能使临床诊断测试得 出可靠的结果。

根据本发明所描述方法，可以从基因银行(GenBank)等数据库 得到更多信息参考应用(见第5-6参考文献)。

本发明所描述测验HLA基因分型的程序。普通在这方面的技师 在阅读本文后，可以本文所描述的方法设计、筛选其它基因DNA序 列片段，制作以单核苷酸多态性而得的SNP图谱，以导流杂交法进 行DNA指纹/身份鉴定及基因分型等实验。

为了得到最高效率的PCR扩增，片段长度选定尽可能短，最好 是在几百个核苷酸对(bp)内。万一PCR引物对的选择未能尽如理想， 可调整扩增的各组成部分如PCR反应混合物，聚合酶链反应流程设 计，即PCR反应的升降温程序、循环次数等，可以优化扩增反应， 以确保扩增发成功。这是一般在此领域内工作人所熟悉的普通技能。 在某些情况下，如无法找到完全保守(与各亚型完全相同的)的序列作 PCR引物，可用简并(degenerated)引物或多对资引物为同一基因作 PCR扩增。在这种情况下，适当调整的PCR条件，以确保所有亚型、 位点的基因片段都不会错过而被扩增，达到杂交测试结果。

当无法确定单一独特的区域片段时，要成功上准确地分办亚型， 便可能需要作多重聚合酶链反应。此时，在设计多对引物时，必须使 各引物对的Tm值相近，旨在此温度值范围内各引物能与靶分子成功 退火结合，使能扩增成功。此处“Tm”是指，在此温度下DNA分子 的双链和其单链反应的浓度是相等的。因此，温度升高DNA将由双 链分离成单链。反之温度降低，更多的单链分子将结果双链分子。在 同一人群中，如果基因序列数据不充足，在可以通过直接测序DNA 作人口筛查得出数据备用。例如，本发明对中国的人口样本已进行如 下筛查：(a)从人群中取得超过一百个受测试者随机DNA样本， 用两对引物进行PCR扩增，其次是用已设计的ASO探针芯片作杂交 测试结果；(b)扩增片段再经DNA测序证实了才能确定ASO探针的 有效性。同样PCR引物也要经过验证为有效的扩增引物。

利用以上所述而获得的数据，可以选定的ASO位点、ASO探针、 PCR引物对等作基因分型检测，再经验证(i)从基因序列数据库 (GenBank)查证(ii)从人群中随机抽样作临床实验证实，所选择确实 是独一无二的HLA分型序列。核苷酸探针、独特性探针的设计和验 证的程序如下：

从选定的基因区域的所有序列列表比较下找出的亚型之间满意 的多态性目标片段；进一步寻找其间独特的20-30核苷酸(ASO)序列 片段，这独特的序列片段便是用作杂交捕获目标扩增的等位基因特异 性寡核苷酸(ASO)探针，进行人类白细胞抗原亚型测试。“独特的 序列或片段”是指，该序列或片段与所定的亚型序列完全相同。

要验证核苷酸探针是独一无二的，顺序是100％符合美国基因库 (GenBank)和欧盟基因库所列序列数据。只属于人类白细胞抗原亚型 的。这将确保至少(直至新的序列被发现前)在现有数据中，该寡核 苷酸探针是这基因片段的唯一同源序列。

由于聚合酶链反应片段长度较短以提高扩增效率，一个寡核苷 酸探针可能不足以提供明确的分化，及完全确定亚型的独特性。因此， 在同一PCR片段中可用一套多个核苷酸探针；或用多个PCR片段及 使用在不同片段中一个或多个核苷酸探针去确定基因分类分型。在这 种情况下，特定模式的探针芯片图谱由PCR扩增，杂交而得的结果 确定人类白细胞抗原亚型。经透彻的分析数据、再经临床的随机人群 的DNA样本测试验证。

类似的程序可用于其它基因遗传物质和来自其它生物体作同类 测试。其物序列和核苷酸探针序列因不同的基因而不同，引物和探针 数目也未必同。例如，用于人的身份识别可能需要50个或更多的探 针，才能在全人类中获取最终的身份鉴定。但如目的只在于识别、排 除的用途，探针、和基因片段数目可大大减少。用于测验芯片格式可 以是线性芯片也可以是矩阵式芯片，这取决于种实际要求而配置不同 的导流杂交装置。

2。寡聚寡核苷酸反点杂交检测实例

寡核苷酸探针是固定在薄膜或任何合适作固定探针的通孔物 料，捕获的预测目标靶分子。此处使用的“膜”是指，任何能固定探 针寡核苷酸探针基质和适用于导流杂交(即多孔足够而能使测试溶液 所包含的目标核酸分子自由通过)的材料。这些包括：硝基化纤维、 尼龙薄膜如，Biodyne，Porex和多微孔金属或持久凝胶质体等。

固定的探针或靶序列(基因位点序列)可以通过共价键，非共 价(即静电，非水亲性作用或任何其它的相互反应亲和作用，以及包 括紫外光交联等)的反应，或者通过其它中间体如受体/抗体的相互 亲和反应而成。卵白素-生物素的联结，或把在寡核苷酸探针3’尾 在连上多聚T(ploy-T)以紫外光固定在及膜上也同样有效。

使用适当的目标靶序列的扩增引物制造足够的靶分子作分析。 靶分子的检验可以根据信号产生的方法在探针上加上适当标示作为 检测信号。标签可以是对一个、两个或多个引物以共价键联系。可标 签在引物的5′end上。也可以使用的四个标记好的(dNTP)经PCR扩 增反应延伸把标记连在的新产生的扩增片段上。标签分子可以是任何 种类的，只要在测试过程中能有效地显示其信号可以测定。生物素抗 体一酶结合体和/生物素标记组合可用于颜色检测信号。其它合适的 标记系统包括，但不仅限于，胶体金结合体(Collodial Gold)和荧光 标签，磁性粒子标签结合体，量子点，发光分子的标签，或其它已经 开发或将要开发可用的标签信号系统。

pattern

本发明所描述的以导流杂交技术而得到的ASO基因图谱，杂交 过程在杂交室内进行，靶分子通过薄膜芯片与固定在膜上的探针结合 而产生信号。形成不同的ASO基因图谱。操作及分析的方法说明如 下：

(a)先把含靶DNA的溶液高温变性，放入反应室和芯片膜的 探针接触(导流)杂交，；

(b)加清洗液三次，洗净芯片膜(或可用SSC或封锁液)；和

(c)进行颜色显示反应，观察测试检查结果。或以光谱仪测定 量。如要保存纪录，可以使用扫描仪和显像软件进行分析。另外，靶 DNA基因片段或序列用荧光标记标签的，在洗净步骤后不必显色， 即可利用光谱显像仪分析。

以上的结果与已知序列数据进行比较，确保基因分型检测的准 确性。所用探针和检查的实验条件还可以进一步改进，提高基因分型 检测精确度。此外，ASO-RDB的实验结果还可以DNA测序方法确 认该靶分子的序列与杂交数据相同。

3临床验证

本发明的验证程序是用随机抽样。作验证结果正确为准。说明 如下：

如上所述，杂交捕获探针先固定在膜上成芯片，用足够数量的 随机抽样的DNA样本执行PCR反应扩增至足够数量的靶分子作杂 交。分析杂交后不同序列的靶分子在芯片膜内的不同位点显示的信 号，定该样品的芯片显像点的阵列模式pattern，确定其ASO-RDB所 得的SNP基因图谱。

用以上所述方法，由核苷酸探针测定相应的DNA序列的人类白 细胞抗原亚型。这些相应的PCR找扩增的靶分子DNA的序列样品可 用直接测序确认验证。

如上所述，临床验证的样品必须是从人群随机挑选样本。一旦 样品已获得确定，即可同时或分别执行测序、杂交双盲实验。由 ASO-RDB经导流杂交而得的图谱，分析得的人类白细胞抗原基因分 型检测亚型结果，必须经直接DNA测序验证为正确的才算成功。临 床验证的另一方法，通过筛查以随机抽样测试实地进行验证，分析数 据和比较统计值：如灵敏序，特异性，阳性预测值及阴性预测值等等， 以独立实验室去进行评估其准确性，基因分型检测结果。

二  单核苷酸多态性(SNP)的基因分型

以下是法本发明建造一个单核苷酸多态性(SNP)数据库去开发 一个单核苷酸多态性(SNP)的基因分型法：

选择单核苷酸多态性位点和确定其排斥权力power of exclusion。此处使用的“权力排斥”定义是：能精确地鉴别人或生 物体的能力。举例来说，权力排斥确定为10亿或1000亿份之一是指： 当使用一些选定的单核苷酸多态性位点作测试，在筛选10亿或1000 亿人中才能找到两个人得出相同SNP图谱。即用这些位点便可以在 10亿或1000亿人中完全的识别(分辩)其身份出来。

通过检查基因数据(GenBank)或人口的基因筛查数据选择出适 当的单核苷酸多态性寡核苷酸探针用来捕捉选定的目标基因序列进 行分析。其中单核苷酸多态性(SNP)资料和它在人群中的频率在则用 直接测序方法从人群中的靶基因或目标DNA片段测序获得。每个样 本从一组基因位点及探针而得到测验结果组成的芯片图像用便是其 单核苷酸多态性(SNP)的个人资料图谱。

所以从这些人群随机筛检数据中，确定基因位点及其SNP的人 群频率。以此数据为基础作指纹图谱验证。在选择基因位点及单核苷 酸多态性(SNP)探针时必须确定在该人群中此核苷酸位点不是热点 突变点(hot spot)。

确定单核苷酸多态性探针所需的数目，并计算出(heterozygosity) 总杂，以确定与一定数量的单核苷酸多态性(SNP)位点测试出来的资 料(即如图9所示的单核苷酸多态性点阵图像)所得出的权力的排 斥。

排斥权力取决于单核苷酸多态性在该位点的核苷酸碱的数目。 例如，在某一特定基因位点，如果不同的碱基是两个，例如，  G或 A。其在抽样人口中发现率为50％。即或然率为1/2。如果用50 个这样的基因位点(这些位点随机分布在基因组上是互不相连的位 点，如在不同的染色体等)用作指纹图谱验证，可以发现同一指纹图 谱的机会是1/2的50次方(即(1/2)50＝8.88178e-16)。(用35个基因 点为2.91e-11与现今用的STR和VNTR相若)。所以SNP的分辨(识 别)能力非常高。

执行单核苷酸多态性的个人资料模式-SNP指纹图谱检测(即以 选用一组单核苷酸多态性探针及其相应的基因位点测定预验人的样 本得出的芯片图谱)：

如上所述，经甄别和选择后确定基因位点，进行设计适当的引 物作扩增该等基因位点，并选择适当的单核苷酸多态性探针作检测杂 交用。

放大靶序列，如描述的导流杂交方法在美国专利第5,74 1,647描 述的方法，使靶序列和单核苷酸多态性探针结合，进行分析。

比较所获得的数据与已知序列数据来评估单核苷酸多态性基因 分型分析的准确性。

如有需要修改单核苷酸多态性探针和测试条件，提高精度的单 核苷酸多态性基因分型分析的精确度。单核苷酸多态性数据库的数据 可经DNA测序验证。

应该理解的是，一般有这方面技能的专业艺术人员应明白，此 处所述的发明所描述，是根据一般情况下进行的单核苷酸多态性基因 分型分析，而不应该被认为其用处仅限于人类基因组；所用的SNP， 也不只限于单核苷酸多态性(或单碱基突变)。术语“SNP”应包括 短片段缺失和插入式的核苷酸突变等。“基因”应适用于任何基因 序列，从任何生物体所见的变异序列，这是用以区分不同核酸结构变 化所见到的序列变异情况。

三。杂交和信号显示

常规杂交涉及繁复的步骤，例如多次溶液替代、杂交膜的转移 等等，因此是一个劳动密集和耗时的过程。本人在美国专利号 5471547和6020187导流杂交法的方法，消除了所有的多次转移步骤 和大幅度减少试剂用量，使杂交改进为一种非常有效的过程。虽然， 一般的杂交步骤程序基本上相似，还有很大的改进空间，本发明介绍 了进一步的重大改进杂交反应流程，其中包括：

减除”预杂交”步骤，其中拦截和杂交组合的步骤是使用一种 改进剂混合物(即DNA样本被放置在杂交液内而不必先经预杂交便 流入芯片膜中进行杂交检测)。

在单步骤的杂交过程中，目标靶序列或分子可以荧光标记，量 子点，胶体金粒子，磁性粒子或其它适当的标记作识别标签，以减除 显色的各步骤，包括所用的酶-标记受体连结组合体及受质等试剂。 这些改进将使技术员中在5分钟或更少的时间完成整个杂交过程。因 此，该方法本发明应提供进一步节省时间和试剂的成本。

四。横向流动，并通过微型设备

在这里的新装置采取膜芯片在其物理尺寸上长度和面积的相对 优势，使更多的靶分子流经膜而被捕捉，提高验测的灵敏度，使其降 低检测极限，而实现最佳效果。下面的例子说明了这种原则。除本装 置外，更可设计其它的装置，优化可以把目标靶分子完全被测出来。 例如，把目标靶分子溶液循环回流至膜上杂交的装置便是另一设计。 这个更可以被纳入本文所述的和自动化过程例子中。

本发明予以下的一个描述，将更加容易理解并作参考。所包括 的例子，旨在到说明本发明的原则精神，而不是旨在限制的发明的有 效范围。

本发明提供了一个快速核酸检测的方法及实例，包括步骤：(a) 取得包括一个目标核酸分子的样本；(b)把目标核酸分子和以下的 混合(i)将会和核酸发靶分子结合的第一个探针，以及(ii)将会 和第一个探针结合的第二试剂，从而在溶液中形成靶核酸分子及探针 等的络合物；(c)以导流方式把以上络合物溶液流到以第三个探针 组成的芯片膜，使核酸靶分子结合在芯片探针上；和(d)检测被俘 的核酸分子的信号得出芯用片图谱。

一般来说，目标靶核酸分子可以是人类，细菌或病毒来源。其 中一例，是怀疑有癌症的人类样本。在另一实例中，目标靶核酸分子 样本可以是未经扩增放大的。

最好，第一个探针和第三探针与目标核酸分子结合位置在不同 的序列区。在一个例子中体现：第三个探针是一个等位基因的特异性 寡核苷酸探针。这等位基因特异性寡核苷酸探针可以从基因数据库找 出。这第三探针可以分析确测目标靶核酸分子样本的特异性寡核苷酸 碱基。要检测被俘的核酸分子，可以用一般用荧光标记，量子点标记， 颗粒胶体金标记，磁粉到粒子标签，或酶联底物法。一般来说，上述 杂交的方法可以利用本发明所述的导流杂交设备进行。

本发明还提供了一个快速核酸检测实验方法，包括步骤：(a) 取得包括一个目标核酸分子的样本；(b)把目标核酸分子和以下的 混合(i)第一将会和核酸发靶分子结合的第一个探针，(ii)第一抗 体，以及(iii)标签剂，其中的第一个探针将与目标核酸分子结合 形成一个络合物，第一抗体将会与此络合物结合；(c)以导流法把 以上(b-iii)的溶液流至含有第二抗体的芯片膜，因第第二抗体将与第 一抗体结合，从而捕捉核酸分子的络合物而被测定；和(d)检测被 俘的核酸分子的信号得出芯用片图谱。在一个实例中体现，目标核酸 分子是DNA分子，第一个探针是一种RNA探针，两者结合成DNA /RNA复合物，而第一抗体是一种anti-DNA/RNA抗体。

一般来说，目标的核酸分子可以是人类，细菌或病毒来源。在 一个实例中体现，是怀疑有癌症的人类样本。另一实例，是没有经过 放大的目标核酸分子。预检测被俘的核酸分子，可以经一般用荧光标 记，量子点标记，颗粒胶体金标记，磁粉粒子标签，或酶联底物法。 上述杂交的方法可以利用本发明所述的导流杂交设备进行。

本发明还提供了一个确定甲基化程度的核酸分子方法，其中包 括的步骤：(a)取得包括目标核酸分子的样本；(b)先把目标核 酸分子经二硫化处理，从而改变CpG岛中甲基化的CmG变成TG， 而未甲基化的CG保持不变；(c)把该CpG岛目标核酸分子片段扩 增；和(d)把扩增的样本作导流杂交处理，使样本流经含有甲基化 和非甲基化的芯片膜，样本经各特异性序列的探针捕获而被检测；和 (e)按检测反应信号，被俘的目标序列验证而得结果，其中每对 甲基化和非甲基化的杂交强度信号，确定该CpG岛的目标序列的甲 基化程度。由不同的基因CpG岛组别，可以得到不同甲基化图谱。 不同程度的甲基化，基因表达有所不同。其与功能有关，也可与病情 有关。为此，甲基化图谱可作预早诊断用。

采用上述程序是测验甲基化目标核酸分子的最好方法。目标核 酸分子在可以用PCR扩增。此处所述，上述甲基化检测可使用的导 流杂交装置通过杂交进行。此处所述例子加下：

在实例中，上述甲基化图谱的建立方法，是用多个或多组特异 性探针作特异性捕获，用以测验其相应的不同基因的目标序列。不同 的目标序列可以是相同基因上的不同区域位置的目标序列或不同的 基因。此外，不同的基因可能包括了一系列负责与代谢链(途径)菜单 达相关的基因或因该基因或基因组表达的改变引发疾病的，如癌症 等。目标DNA序列包括基因的调控子片段或其它CpG岛组成的基因 片段。在这些目标序列中其甲化的程度的变动对会影响其基因表达水 平。因此，同基因的甲基化程度和不同基因的甲基资料将对人体的功 能健康有直接的关系。上述的方法，如能提供各组别甲基化资料，可 作为疾病的诊断之用，例如：癌症诊断。

如上所述，本发明还提供了一个装置能够实行各种检测方法。

本发明还提供了横向导流杂杂交装置包括：(a)能固定捕 获分子的膜，从而能够捕获目标分析。其中膜定位在可调控反应条的 反应室内；(b)调控组件。用作调节反应室，保持反应室中在反应 时所需的反应温度条件；(c)电源和控制装置。连接内容连接到可 以调节和保持控制条件；和(d)液体输送系统，用于输送液体进出 反应中心。并保持横向流动的方向，使溶液流经膜孔横截面，使所有 的目标分子通过固定于细胞膜上的捕捉分子(探针)，从而提供高灵敏 度的分析检测。

一般来说，电源供应器和控制单元能够提供能量，并提供调控 指令，保持反应室中的反应条件受控，达到测试反应时的要求。包括 温控的精确度为摄氏0.5度。

杂交装置的控制装置配件具备如Petier加热和冷却元素；或用 循环液体或空气，或任何其它已知的最先进的控制温度手段，使反应 室能调控如意加热和冷却。加热和冷却的配件包括热传导板，加热和 冷却传感器，散热器，加热和冷却风扇等。

一般来说，用于反应室用作测试的膜，材料可以是含有硝酸， 尼龙，Nytron，Biodyne，或Porex等薄膜，或其它在此艺术范 畴内已知的多孔材料。反应室组成的

在解决包含目标分子溶液的输送方法，可用在可调节的液体泵 把溶液输入或输出至反应室中的膜上。液体泵也可以循环输送液体通 过膜作分析测试。

本发明此处所述，还提供了横向流动杂交系统，包括一个或以 上的杂交的设备，其中每个杂交设备连接到电源和控制配件能够提供 能量，并提供调控指令管的杂交设备。每个杂交装置可独立有控制电 力供应和控制指令使每个杂交装置可以在不同条件下执行不同的分 析。

本发明还提供了横向导流杂交装置包括：(a)一个或以上的 反应室，每个包括有能固定捕获分子的膜，从而能够捕获目标分析。 其中膜定位在可调控反应条的反应室内；(b)调控组件。用作调节 反应室，保持反应室中在反应时所需的反应温度条件；(c)电源和 控制装置。连接内容连接到可以调节和保持控制条件；和(d)液体 输送系统，用于输送液体进出反应中心。并保持横向流动的方向，使 溶液流经膜孔横截面，使所有的目标分子通过固定于细胞膜上的捕捉 分子(探针)，从而提供高灵敏度的分析检测。本杂交装置的反应室， 每个是一个单独的单位可被独立支配。

实例1

下列程序是本发明的实例。140人的DNA样本取自中国人种的 随意样本，作人类白细胞抗原基因亚型分型检测的验证。结果证实： 用本发明研发的一套快速分类的HLA亚型检测方法得出的数据的前 2位数字编码和世卫组织所见相同。得出相应的分类名称。这设计的 一套扩增引物、探针，可用于分析HLA-DR，DQ和DP的等位基 因。这些基因是通常用于器官移植前，的组织之间的匹配捐助国和受 援国之前。

被用来检验确定

测试程序：

A.DNA制备

下列是本建议的DNA的分离方法的。但很明显的一个普通以有 此技艺的技师也清楚还有其它同样有效的分离程序可用。有核细胞， 如白血细胞或组织都先经磷酸盐缓冲液洗涤，离心，并除去上清液。 把该pellet球重新悬浮在200微升磷酸盐缓冲液中。DNA的提取是 采用为血或体液而设的QIAamp DNA的迷你试试剂盒。按制造商 (Qiagen)所建议的离心法进行。当然、也可使用其它商用的DNA分 离试剂。然而，DNA提取程序中最重要的，是纯化后的DNA不含 DNA聚合酶抑制剂，以确保扩增成功。最后DNA可以溶于50-200 微升AE缓冲液中，在-20℃保存，直到使用。

B.PCR扩增

由于PCR扩增是极其敏感的反应程序。操作这过程时，必须特 别注意防止交叉污染，防止产生假阳性结果。因此，必须遵循下列的 操作手则：在整个PCR扩增磨反应程序中，必须带上外科手术手套。 最理想的是，准备PCR反应混合物的工作间完全没有扩增产物存在， 能在一个干净的PCR检测预设区很好。PCR反应和杂交应设在不同 的工作间进行。即是，PCR反应混合物的配备在前-PCR区，而杂交 则应当在后-PCR技术区。

使用70％乙醇和纸巾清洁工作板凳/地区。在开始进行PCR扩 增程序之前使用70％乙醇和纸巾清洁所有的移液器。提示：所有移 液步骤，移液器用作传递溶液用的移液尖指要消毒。无论如何，用过 的移液尖指不柔能再用。

聚合酶链反应只是许多扩增技术的其中可用的一种。很明显的， 对一个普通熟练此技能人而言，还有其它扩增技术，如各种等温扩增 方法，使用适当引物去扩大靶序列，以取得足够数量的靶序列(或 DNA分子)，开展导流杂交作膜芯片检测实验。

聚合酶链反应的实验是用商用的AmpliTaqTM金聚合酶(ABI)。 五对引物对(1对用于扩大HLA-DR基因，即是向前引物DRB-F1：5′ -ATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3′(序列编号第97号)和扭 转引物DRB-R1：5′-GCCGCTGCACTGTGAAGCTCTC-3′(顺 序编号第98号)，1对用于扩大HLA-DQ基因，即是向前引 DQB-E2-F2：5′CGGTGATTCCCCGCAGAGGAT-3′(序列编号第 99号)和扭转引物是DQB-E2-R2：5′- CCACCTCGTAGTTGTGTCTGC-3′(序列编号第100号)；和3 对用于放大HLA-DP基因，向前引物(序列编号。第101至103号) 和扭转引物(序列编号。第104至106号)。这些引物列于附图6B；6D 和6F，并在其是5′端加上生物素标记。其它适当的标签也可用。(本 发明这里描述的实，旨在说明其中一个特别PCR扩增反应程序。如 果使用其它单核苷酸多态性引物序列，在PCR和杂交等的条件必须 另行优化)在25微升的扩增反应混合液的组成成如下：

  每个反应(μl)   1 0个反应   PCR-混合   液     19.00     190.0   Taq聚合酶     1ul  (1单位)     10ul  (10单位)   DNA模板     5(～100ng)     -   共计     25ul     200ul

扩增程序进行的优化程，利用PE9700热循环PCR仪进行而确 定。以下是用PE9700(或MJ热循环仪)所用的程序：

95℃ 5分钟

72℃ 5分钟(最后一次延长时间)

当使用不同的引物或其它热循环仪，可能需要修改循环扩增计 划。

C.聚合酶链反的应质量控制

每一个PCR分析都要具有阳性对照和阴性对照。这是重要的。 阳性对照是需要表现出PCR的效率和其特异性，而阴性对照需要， 是因为它可以确定聚合酶链反应试剂，是否被污染了。另外，内标也 是需要的。不同内标能为测试结提供适当的解释，同时，在可确保数 据的可靠性和准确性。内标的种类和数目取决该内标(IC)的类型或性 质是否在测试时需要。

内标(IC)可用于跟踪每个杂交反应程序或步骤的进行是否正确。 例如，内标(IC)可用于确定是否添加样品或目前的样本是否有任何抑 制剂，从而防止PCR反应的正常工作而产生影响测试结果。内标(IC) 也可以被用来跟踪各反应的效率，或确定的目标分子的浓度，进行半 定量或定量的分析。

如果定量或半定量测量是必要的，芯片膜上可以加上产生信号 的内标(IC)。在膜上提供了预先确定的浓度的探测信号点，因该内 标(IC)是在测试样品杂交后，同步显色定量的，所以这些预先或事 先确定浓度的信号点可以作为定量标准满足定量参考条件，可进行最 少是半定量的测试。在另一例子体现，更多内标(IC)可加入PCR反 应组合内查看聚合酶链反应效率。这也可以作为内部参照，以表明反 应液或样本存在或缺乏抑制剂，抑制的PCR反应而产生假阴性结果。 这样本便得用其它方法去检验。

本发明为内标(IC)系统提供了在PCR/杂交反应测试中的多种 优势。由于PCR反应在同一反应管进行，缺乏内标(IC)和试验样品 的信号时，表明该样本存在抑制剂。如果同样的引物序列加入内标 (IC)作PCR扩增测试样，它可以作为一个内在测试PCR反应的效 率。内标(IC)也可以被用来作为确定检测的临界值，作为测试结果， 判断PCR反应和/或其效率及杂交结果是阳性或阴性。它也可以提供 一个指标确定杂交是否成功地完成了。此外，内标(IC)可用于确定 信号试剂的反应功能是否可以接受的或通过生产指标。以及杂交程序 是否适当。

D.杂交

杂交前的准备工作：

预热杂交液(即2倍SSC溶液或任何商用溶液配剂/产品)至 42℃。如溶液B(SSC+0.5％SDS)有沉淀物，把溶液B沈42℃ 水浴中使沉淀物释出，直至沉淀溶解。整个杂交过程中，杂交反应室 及溶液严格保持温度在42℃。

预备NBT/BCIP原溶液，避光保护，存放在4℃。用时以PBS 稀释备用，未用的放在4℃，避光存放。

冷藏的杂交液(2X SSC+0.05％tween20)先放在室温平衡 温度备用。

所有生物PCR产物加热至95℃的5分钟变性，然后立即在冰 水上冷冻至少2分钟。

杂交准备

导流杂交实验，可以用美国专利。第6020187描述的装置，也 可用本发明所描述的横向流动装置及操作程序。以导流杂交法确认人 类白细胞抗原基因分型为例：首先在反应室内装满蒸馏水，预热杂交 仪至42℃备用。

把预定的芯片膜放在杂交反应室内，固定封面盖子。其中所用 的探针及其序列(见附表6)。

杂交PCR产物

当杂交室、各杂交液的温度达到42℃(+/-0.5℃)后，加一毫 升杂交液所预杂交，覆盖杂交膜(注意：这里用的温度是本HLA分 型组合的最佳杂交温度。不同的探针序列其退火温度不同，未必适合 这一温度。因此，如取用其它序列，需另行研定合适的杂交条件)， 杂交时间至少2分钟是确保温度在设定的温度上平稳。

另外，添加0.5毫升杂交液至各变性的PCR产物上，然后分别 添加到反应室内的膜芯片上杂交，使DNA样本和膜中的探针序列结 合杂交5分，并保持温度在42℃。然后将液体流经膜而被抽出。杂 交通常可在30秒内完成。用2至5分钟的培养时间是确保DNA样 本遴溶液温度达到设定温度。达到特异性的杂交捕获反应。

杂交后，以0.8毫升杂交液洗膜3次，洗净未经捕获的DNA分 子。

彩色发展

将反应室降温至37℃。同时加入0.5毫升封闭剂；再加入0.5 毫升封闭剂培养5分钟，然后抽出。

新增0.5毫升亲和素-酶结合物。在膜上培养3分钟。彩色显示 程序在25-37℃进行：。先用0.8毫升的缓冲盐溶液(pH值7.4)彻底洗 膜，最好4次，抽干。

新加0.5毫升的NBT/CBIP溶液(罗氏公司)。封好面盖子避光。 培养约5分钟或直到颜色显现为止。注意：不要培养超过10分钟， 否则背景高。

在颜色已经完全显示后，抽去NBT/CBIP溶液。以一毫升B溶 液洗膜3至4次，然后以2毫升的蒸溜水冲洗膜定色。

检查结果。可尽快通过直接观察检验(最好是1小时内)，或以扫 描图像处理作半定量分析检测结果。

解释结果

清晰可见的斑点显示阳性结果。本发明在HLA分型上按设计方 案图1，总共设计子96个核苷酸探针(HLA-DRB：29；-DQB1：24 和-DPB1：43)，其与人类白细胞抗原组相应的序列编号1-96的 顺序列于附表；5对PCR扩增引物对，相应的序列编号编号97-106 在序列于附表。ASO探针和引物对已经过评估，确定适合用于人类 白细胞抗原HLA-DR，DQ和DP的基因分类、分型。其中，本发明 所得，中国人的基因型和等位基因频率的结果如图4和图5所示。 所有数据取自扭转斑点杂交(RDB)芯片图经导流杂交实验，(其中 共动用141人的随机样本)结果分别证实DNA测序。原则上，任何 生物体，如其核苷酸(或单核苷酸多态性)的寡核苷酸已知、数据足 够，可以本发明导流杂交方法进行检测快速基因分型测试。如数据不 足，可根据图一所描述的方法，作人群筛选得到数据、设计而定出所 需的试剂。杂交的结果只在数分钟内得到结果，比传统杂交技术速度 增加至少10倍。

实例2

简化基因分型验测方法及其设备

按本发明改进美国专利号5741647和6020187所描述的导流 DNA杂交方法与装置，杂交时，从数天或数小时降低至的数分钟到 数秒(视产生检测信号所采用的方法而且定，整个杂交程序可以在 5-30分钟内完成)。该装置还造价便宜，试剂用使用量降低10倍以 上。使DNA诊断技术大大降到可接受的价格。

本发明提供了一种廉价的平台，以低密度芯片作核酸研究。这 项发明还提供了快速方法，为复杂的人类白细胞抗原基因系统分型分 析。本发明所述的方法，比美国专利5741647和6020187号所描述的 有显着的改善和用优越性。

本发明进一步提供了更多改进现有的导流杂交技术。例如，杂 交装置包括一个如膜显示在图6中4×6阵列式芯片的检测膜。利用 ELISA的96口井的格式，其中每个以5点矩阵式芯片，可以同时进 行96个样品、分别以5个不同的基因位点，或序列片段同时进行分 析测试。这大大增加了分析的吞吐量，可作普查筛选特变基因、病毒 或细菌等。

在此艺术领域的普通技师也容易理解阵列式芯片的可用性。此 技术可以同时用更多的反应盒，每反应盒可以有多个反应口井，可以 分析更多的核苷酸序列，迅速而成本低廉。本发明杂交装置是一种突 破性的DNA的快速诊断装置。横向导流微型装置描绘图3。

所描述图3横向装置有重大改进。内部调控配件和浓度显示点 说明描绘图7，增加浓度梯度点的一部分，阵列式芯片在检测时可 给于相对浓度范围作参考结果。如上所述，采用横向导流程序将可大 大提高测试灵敏度。

实例3

单核苷酸多态性(SNP)基因分型

要确定HLA-DRB基因型：PCR引物对DRB-F1：5′- ATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3′(序列编号第97号) DRB-R1：5′-GCCGCTGCACTGTGAAGCTCTC-3′(序列编号 第98号)(见附表6A-B)进行PCR扩增作靶序提供作样本测试。 29用个核苷酸探针中18个被认为是最好的的探针，鉴定白细胞抗原 (HLA-DRB)等位基因。

DQB1基因型的测试。聚合酶链反应使用引物对DQB-E2-F2：5′ -CGGTGATTCCCCGCAGAGGAT-3′(序列编号第99号)和 DQB-E2-R2：5′-CCACCTCGTAGTTGTGTCTGC-3′(序列编号 第100号)(见附表图6D)，扩增产品为260bp片段。杂交用的是 24条SSO探针，被用作捕获DQB1靶分子打探针，作分类分型杂交。

要确定DPB1基因型，共有43个核苷酸探针。其中图6E所示 的一套35条的SSO探针作为本实例。为了扩增靶基因或序列以达到 杂交成功检测的浓度，本例用了多重PCR扩增方法。如图6F所示。 引物Primer1-f，Primer2-f和Primer3-f为前方引物。Primers4-r， Primer5-r和Primer6-r为反向引物。这些引物对能够产生约264bp扩 增靶分子产品，其5’端含标记标签，作杂交显色确定被检样本的基 因分型。

人类白细胞抗原A类和B类的基因型身份鉴定，可以同样以如 上的方法，选择适当的冲特异性引物对和探针，分析相应的人类白细 胞抗原A级或B。这种序列可以从文献中所报告数据而其身份已得 到证实选取。另外，也可以本发明描述如图1所披露的计划研在取足 够数据，设计这些序列作测试使用。

实例4

分析病毒或细菌小组

导流杂交阵列式芯片可以用来识别不同的生物体，不同的序列 或不同的基因型。HPV是高度异质性，有超过200种，其中只有约 40人被认为是临床意义和最常见的20个覆盖高达95％的案件在大 多数人口。图9显示的一个例子是，确定HPV的基因分型。不同的 探针具有独特的序列相应于不同病毒类型、亚型。如固定在膜上作目 标捕获。然后进行PCR扩增或其它扩增的方法扩增、标记，再进行 样品杂交分析，分型。以这HPV为例，除了分型外，以通用探针(不 分型)将提供一个平均捕获所有人乳头瘤病毒类型。这通用探针是非 常重要和独特的探针，因为它能够捕捉许多罕见的基因亚型，因此， 不能测定的大多数少见的人乳头瘤病毒基因分型检测不包括的，也测 试到。因此，通用探针很重要，因为它能够捕捉这些罕见的基因型， 这意味着这测试方法在可以包含全部HPV病毒。

图10显示，是鉴定上呼吸道病毒病原体(Grondahl等。基地。， 1999年；Mackay等。基地。，2003年)小组病毒的测试芯片。这 病毒小组，在许多人有类似的病毒序列或功能，属于引发相似病症的 的同一类病菌。因此，同一试剂盒可分辨它们将有助选择药物护理。 这例子所用的引物和探针序列见示于图15。同样地，可根据图1设 计方案选出其它引物和探针序列。虽然，引发SARS的病毒也属同类。 然而，由于SARS是传染性很强很危险的，故应另作单独类别的试剂 盒。

按本发明描述，其它病原体小组，如性病，肝炎或禽流感(H5N1) 型病毒等或相关的流感病毒也可以制定类似的检测方式。

实例5

癌症早期诊断小组

基因的功能变动无疑是癌症的基因来源。因癌瘤的形成通常需 要许多年，因此，如果能找出任何与癌细胞的转化作用有关的基因， 便能作及早期诊断。当然一些遗传性癌症基因不少已经发现，可以作 早期诊断。可是大多数癌症是由人的一生中后天的基因突变而来，生 命愈长，突变基因浓度更高，基因的功能缺陷情况愈大。因此，功能 缺陷型基因(通过降低表达水平的或生产缺陷的基因产品)的积聚而 导致发病。原则上，基因资料的表达图谱(任何一个或一组基因的表 达情况)可以以下形式显示：(i)表达水平；(ii)的积累有缺陷的产 品或(iii)基因改变的确诊，如(a)该基因内的序列，或(b) 其调控区-启动子或增强子-的DNA突变。这种表达图谱的资料应该 可以对癌细胞的转化的过程提供深入了解，从而作癌前诊断及癌病的 预后分析。

事实上，人类的很多基因的某些突变，如BRCAs基因的乳腺癌； APC基因的结肠癌；p53基因与癌症Kras等，已确定是某些癌症的成 因。此外，位于启动子区CpG岛的甲基化变动也可导致突发性癌症。 沉默肿瘤抑制基因的活化也可诱导细胞癌症化。这些都能是早期检测 预防癌病的保健方法。

最近，对基因的后生研究已积累了丰富的资料。很多甲基化的 基因及其数目已有报道，这些基因甲基化的变动被认为是对癌症形成 有密切相关。因此，甲基化特异性实时定量聚合酶链反应(MSQ- PCR)技术，将有可能是早期诊断(Lo et.al.，1999；Facker et.al.，2006) 癌症的方法。然而，尽管其灵敏度高，实时MSQ-PCR技术也有其 局限性。首先，最大的荧光染料数量是6个，因此只有3个基因CpG 岛可同时测试。这是远远低于能显示准确和有意义的结果的基因数 目。其次，因为样品量往往是有限的，不可能作很多重复试验其它基 因，确定基因类型与癌症的关系，确认是否存在癌症。

相反，这里的例子表明本发明可以通过多个组合的扩增方法和 以芯片形式检测，在同一薄膜上可以测验很多基因或序列数，提供了 更高的概率为早期癌症的诊断。图16显示某些已被认为与癌症有关 的癌症标志(Sidransky，2002)。图17提供了部分基因负责调控的 代谢途径，导致细胞稳态的清单。如表达被中断，这些基因会导致细 胞失控性增长而致癌(Shinozakiet.al.，2005；Yu et.al.，2004)。本发 明利用导流杂交法而得基因突变图谱以及甲基化图谱，将准确地建立 与癌症诊断有关的基因表达图谱。

图11显示的例子中，不同的阵列式芯片，显示不同的基因突变 甲基化图像(图谱)。癌症的发生，在不同地区的人群(或其它生物) 各有不同，故预计将有不同的基因组，不同的基因表达谱。本发明装 置所披露的将提供对基因突变和/或CpG岛甲基化的程度的一套相应 基因的独特的概况。这对不同的病不同部分人群的癌症预前预后测 测，将有重大的诊断价值。图18显示一些用于甲基化检测的引物和 探针序列。一些潜在对癌症有关的基因标志物和基因的甲基化分析列 于图19。从实验结果表明，使用这种配置可提供更多的敏感性和特 异性检测癌症的诊断。必须特别指出，DNA甲基化可以提供一个明 确的或提示的结果。不过其它生物标志物也可作检测。蛋白质生物标 志物便是检测实例。

实例6

体现新设备的设计

图12显示的替代装置为横向导流杂交的用于蛋白芯片试验。这 种新的实验，可作为一种新的设备，包括基本要素，即：(i)电子 装置单元及调控系统；(ii)温度块；(iii)反应室；和(iv)液体输 送系统。正如描述，放膜芯片的反应室可设计作为单独的、多个单元 的，连接到电子装置单元及调控系统及液体输送系统；装置可以是手 工或自动化的。液体流动方向，速度和流量等，可以准确地控制。控 制器可分别支配反应室。膜芯片组可以是一次性用的单元体，或多个 单独或平行反应的。显然，这可以提供最佳条件下进行有效的检测， 增加敏感度和特异性。这一次性用的芯片装置可以在完全封闭的环境 下进行测试，防止任何可能(如涉及扩增进程流放的产物)的交叉污 染，降低假阳性结果。因此，这里披露的新颖装置是独特的，是一个 有非常显着改善的快速导流杂交检测装置，因此，这个系统非常适合 用于临床诊断。

实例7

一步流通试验

常规杂交非常费时，因为复杂的程序，涉及到许多不同的步骤。 导流杂交进程和设备在这里已经简化了操作，并导致大量减少的时间 和试剂成本，而不会降低敏感度和特异性。这项发明在此透露将提供 进一步的改善和程序，扩大试验范围。

图13显示了测试程序：(i)把扩增后的样本变性，速冷藏， 以防止自我退火成双链，然后混合杂交试剂，在预定的杂交温度培养 5分钟，然后放到反应室(膜芯片)杂交，清洗；(ii)信号显色反 应。

除了图13所述，下列步骤将有助于取得更好的成果：(a) 以不对称的PCR扩增或同类方法产生更多用与捕获探针相互补的单 链分子；(b)加信号扩增剂(如生物素标记的目标DNA分子，生物 素-链酶卵白素信号标记扩增系统等)；和(c)信号显示程序的多少， 将取决于标记物或者标记在扩增时或显色反应所用的信号络合物。如 使用荧光染料作探针标记扩增靶分子或用直接有色标的显色络合物 (如金粒子)作信号显示，将减去杂交后的显色步骤。

除了荧光标记，一步杂交法过程可以靶序列标签或量子点 (Quatum dot)，胶体金粒子，磁性粒子或其它适当的标识标签，以消 除酶络合物的显色步骤。这些改进方法可使整个杂交过程在5分钟或 更短的时间完成。因此，进一步节省时间和试剂的成本。

图13显示例子中，如何一单步杂交可以执行。如有足够浓度的 靶分子(无论是样本量或浓度，即分子总数量够多)或/和有适当的 信号扩大剂产生信号，本发明的导流法可以直接分析原始样本。因为 理论上，这步法，可以无限加入样本的体积溶液(先把所有试剂完全 混合后，形成提供分析的络合物，然后杂交)不断通过细胞膜上固定 探针把目标分子抓获而聚集信号，达到如快速免疫带试剂盒的测验结 果。

实例8

一种创新性的信号放大试验

聚合酶链扩增反应中，污染是一个严重的问题。因此，如能取 用其它信号放大的方法替代PCR扩增方法作以DNA为基础的诊断至 为重要。B-DNA是其中种：DNA的超分子络合物的用处也正研究 中。最近，杂交捕获技术用于病毒的检测是另一个好例子。不幸的是， 这些方法既不是合适的，也不适用于以膜为基础的分析。

本发明提出的例子，以膜为基础应用于导杂交平台。图14所示 的检测系统包括：(1)以特异序列作捕获寡核苷酸探针固定到膜芯 片上；(2)设计特异性的RNA或DNA寡核苷酸，其特点是，能 在溶液和样品靶分子结合；(3)以具有高亲和性的DNA/RNA的多 克隆抗体把遴溶液中的DNA/RNA分子捕捉；(4)能在溶液中与抗 DNA/RNA抗体络合结合，而不会和其它分子结合的抗体，把络合物 结合浓缩；(5)讯号产生标签标记的DNA分子，其中该分子与被俘 的RNA和DNA寡核苷酸中的其它序列区的序列相互补而结合。在 流经膜时，这些包含巴靶分子的络合物被固定在膜上的特异性探针捕 获；和(6)显色试剂产生信号及测试设备。

如在图14的方法步骤包括：(1)DNA的分离；纯化足够数 量的目标样本变性，雪冷；加入RNA探针和适量的anti-DNA/RNA 抗体，混合，使形成络合物物；(2)然后以亲和柱集中收回的络 合物；(3)在特完温度再溶解络合物，经导流通过膜杂交、清洗； (4)加标记DNA，清洗，然后显色报告。上述程序是最初的实验 方法。进一步优化程序可以根据本发明的概念和精神的完成。

原则上，一步法中可把所有适当的组件加在同一溶液中进行混 合(即在把蛋白除去，排除细胞碎片和非核酸复合物后)然后流入膜 中作杂交捕获。本发明采用的检测法，是在没有放大下直接用样品原 液(最初样本)。因导流装置系统，没有限制溶液的使用量，灵敏度 可以提高。灵敏度则因应不同的信号系统而不同。例如，使用的AP- AV和颜色发展系统，我们已经取得了3×10-16(0.3 fetomole)摩尔(克 分子)标签量。如用化学发光法，至少增加10倍的敏感度。通过增 加标签的分子数目的DNA标记，检测范围可能达到10-18(attomole)。 在此浓度下，许多病毒感染可随时检测出来。

本发明所的披露的实例是以示范作用，不能作为发明程序描述 的权利限制。与此相反，目的本发明是要覆盖所有的相应，类似修改 和方法及包括在本发明的精神范围所规定的附加要求。

这些在熟练本技能的人都会承认，使用不超过常规实验可以达 到的结果的许多等值的装置、程序，本发明将以当量的本意涵盖在以 下要求内。

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