用于检测样本中mircoRNAs含量的核苷酸序列及检测方法

摘要

本发明提供用于检测样本中mircoRNA含量的核苷酸序列及试剂盒，以及以核酸碱基配对识别互补结合为基础，经银染增强的纳米金标记探针的miRNAs检测方法，该方法简单易行，无需放射性标记、荧光等昂贵设备就可获得高灵敏度，高特异度的检测信号。

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测样本中microRNAs含量的核苷酸序列及检测方法，尤其涉及一种采用金银纳米微球技术检测样本中microRNAs的方法。

背景技术

心血管疾病已经成为人类健康和生命的头号杀手。急性心肌梗死是急诊科常见的急危重症，但对于此病的治疗效果却不够理想，其中一个重要原因是不能对心肌梗死的预后和并发症的发生及时作出正确的判断，以至于不能采取适当及时的治疗方案和措施。恶性心律失常即是急性心肌梗死严重并发症之一，是临床治疗的难点，也是该研究领域的热点，后果严重，病死率高，如能早期发现，早期救治，能有效地挽救患者生命，对降低心肌梗死病死率具有重要意义。诊断急性心肌梗死主要靠心电图检查和心肌酶谱的检测，但心电图检查的准确率只有50％，而且有30％的心脏病患者表现为心电图正常，从而不能做出准确的诊断；而心肌酶谱的检测也不够理想，肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌钙蛋白缺乏敏感性，胸痛后6-8小时浓度才逐渐上升，而肌红蛋白的升高又缺乏特异性，所以目前的检测手段尚不能对急性心肌梗死作出早期诊断，不易发现病情的进展，延误治疗时机。因此迫切需要一种新的高特异性和敏感性的生化指标来辅助诊断心肌梗死的发生，更重要的是作为一种预警指标来判断急性心肌梗死的严重程度，对其预后和并发症的发生及时作出有效的评断和防治。

microRNA在1993年即被发现，是长约19-25的核苷酸(RNA)分子，为非编码小RNA。它可以通过与特定mRNA结合，抑制mRNA编码蛋白质的翻译过程来调控基因表达。目前人类基因组中已确认的microRNA有近八百个，可能参与30％人类蛋白质的表达调控。功能学研究表明microRNA参与调节包括细胞的增值、分化、凋亡、肿瘤发生等许多病理生理过程。近年来，microRNA在心律失常中的作用，取得了令人瞩目的研究成果，一系列的研究证实microRNA参与调控多种心脏电活动相关蛋白的表达，是潜在的心律失常作用靶点。其中研究较多的是肌肉特异表达的miR-1和miR-133。发明人发现miR-1是导致缺血性心律失常发生的关键因子，与各种心律失常关系密切。实验证明miR-1在冠心病患者心肌组织中的表达水平是正常人心肌组织的2.8倍；在大鼠实验性心肌缺血模型中观察到同样的结果：缺血12h后缺血区心肌miR-1表达量比正常对照组高2.6倍。应用在体转染技术将miR-1特异性反义寡聚(脱氧)核苷酸(AMO-1)导入缺血心肌时，心律失常发生率明显降低。另外，我们发现microRNA328可导致房颤的发生，miR-124-1与心衰和心肌纤维化有关联，microRNA21可导致心肌肥厚。因此，我们设想心肌缺血引起某些miRNAs表达的改变，如microRNA1，microRNA133，microRNA328，miR-124-1，microRNA21是否会在血液中亦被检测到，并与某些循环系统疾病的进展具有相关性。如果此假设成立，这些针对这些miRNA的检测即可作为预警信号，通过对循环外周血的检测，就可对疾病的预后判断提供依据，为心肌梗死患者发生恶性心律失常等并发症的早期发现提供依据，以便对心律失常作出早期诊断和处理，挽救患者生命，具有现实的临床意义和良好的应用前景及经济、社会效益。

目前测定Northern blot是国际上公认的miRNAs检测的“金标准”方法，也发展了很多衍生方法，但是用这类方法检测必须事先准备大量的总RNA样本，且过程冗长，技术相对复杂，对检测人员专业程度要求相对较高，所以可能限制其应用。何文蕾等人(生物化学与生物物理进展，2008，35(11)：1332～1338)利用纳米金银染增强技术建立了一种简单快速的microRNA定量方法，以纳米金标记的寡核苷酸分子作为信号探针，以生物素标记寡核苷酸分子作为捕获探针，经链霉亲和素-生物素作用将靶序列捕获在固相载体酶标孔上，继而通过纳米金催化的银染增强放大效应产生灵敏的识别信号，记录其吸光度值从而实现microRNA分子的定量。其用于检测小鼠肝脏、脑组织中miR-122a和miR-128各自的含量及合成miR-122a，在良好的线形范围(10pmol/L～10fmol/L)内最低检测限为10fmol/L。该方法简单易行，无需放射性标记、荧光等昂贵设备。然而其灵敏度和特异度仍有待提高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供用于测量样本中microRNA的核苷酸序列以及一种新型的简便、快捷、定量测量样本中microRNA的方法。

为了达到上述目的，本发明提供三种核苷酸序列，通过这三种核苷酸序列结合纳米金技术可以准确快速的检查样本(包括血清，全血，细胞裂解，组织等)中microRNA的含量，其具体包括：

本发明提供一种用于检测样本中mircoRNA含量的由生物素标记的核苷酸序列I，其特征在于，所述序列为

5’-(y)_n-(CH₂)_a-3’，

其中a为3-20；(y)_n表示一种与从miRNAs 5’端起6-16个碱基长度互补的核苷酸序列，所述生物素标记在3’端；所述miRNAs的序列选自SEQ ID NO：1-3中的任一序列。

优选的，所述由生物素标记的核苷酸序列I为5’-tttacattcca-(CH₂)₆-3’或5’-gagagggcctg-(CH₂)₆-3’或5’-gcgtgcctta-(CH₂)₈-3’中的任一序列。

本发明还提供一种用于检测样本中mircoRNA含量的核苷酸序列II，其特征在于，所述序列为

5’-(A)_b-(Y)_m-3’，

其中b为8-50；(Y)_m表示一种与从miRNAs 5’端起第7至17个碱基中的任一位点起延伸至3’末端的碱基长度互补的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与前述由生物素标记的核苷酸序列I能够同时与所述miRNAs的全长序列互补结合；A为腺嘌呤。

优选的，所述核苷酸序列II为5’-(A)₃₀-ATACACACTTC-3’或5’-(A)₂₅-ACGGAAGGGCA-3’或5’-(A)₁₅-GGCATTCACC-3’中的任一序列。

本发明进一步提供一种用于检测样本中mircoRNA含量的核苷酸序列III，其特征在于，所述序列为

5’-(T)_d-(CH₂)_e-SH-3’，

其中e为3-20；d与所述核苷酸序列II中的b相等，且所述序列可与所述核苷酸序列II互补结合；T为胸腺嘧啶；SH为巯基。

优选的，所述核苷酸序列III为5’-(T)₃₀-(CH₂)₆-SH-3’或5’-(T)₂₅-(CH₂)₆-SH-3’或5’-(T)₁₅-(CH₂)₆-SH-3’中的任一序列。

本发明还提供一种检测样本中microRNA含量的试剂盒，其特征在于其包括所述由生物素标记的核苷酸序列I，所述核苷酸序列II及所述核苷酸序列III，基因提取材料，纳米金溶液及银增强液。

本发明还提供一种以核酸碱基配对识别互补结合为基础，经银染增强的纳米金标记探针的microRNAs检测方法，其特征在于其主要步骤包括：

(1)样本的制备与总RNA的提取；

(2)杂交：将样本、捕获探针、信号探针与纳米金标记探针混合，将该混合物体系转移到各链霉亲和素包被的酶标板孔内孵育；其中，所述捕获探针为所述的由生物素标记的核苷酸序列I，所述信号探针为所述的核苷酸序列II，所述纳米金标记探针为通用T探针与纳米金溶液混合得到，所述通用T探针为所述的核苷酸序列III；

(3)纳米金标记探针定量检测microRNA：前述酶标板每孔加入银增强液，室温避光条件下反应至出现灰度信号后用超纯水冲洗终止反应，酶标板置入酶标仪中，单波长扫描，通过酶标仪实时检测溶液的A值。

优选的，所述由生物素标记的核苷酸序列I为5’-tttacattcca-(CH₂)₆-3’或5’-gagagggcctg-(CH₂)₆-3’或5’-gcgtgcctta-(CH₂)₈-3’中的任一序列；所述核苷酸序列II为5’-(A)₃₀-ATACACACTTC-3’或5’-(A)₂₅-ACGGAAGGGCA-3或5’-(A)₁₅-GGCATTCACC-3’中的任一序列；

所述核苷酸序列III为5’-(T)₃₀-(CH₂)₆-SH-3’或5’-(T)₂₅-(CH₂)₆-SH-3’或5’-(T)₁₅-(CH₂)₆-SH-3’中的任一序列。

所述纳米金可以从商业途径购买(例如购自Sino-American BiotechnologyCo.，SABC)，也可以采用如下方法制备：将20ml的1.0mM HAuCl₄置于容器中加热至煮沸，加入2ml 1％的双水柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，然后在回流条件下剧烈搅拌15min直至观察不到颜色的进一步改变，形成金溶胶，过滤即得本发明纳米金溶液。用此方法制备的纳米金在518nm处有最大吸收峰，平均直径12-13nm。

所述纳米金标记探针的制备方法如下：将上述纳米金溶液离心弃上清，加入通用T探针(MST-probe)再分散纳米金，加入缓冲液孵育后取上清离心；弃上清，加缓冲液洗涤沉淀物后离心，再次弃上清；洗涤沉淀物两次以去除多余的未标记上的单链寡核苷；最后，加入缓冲液重悬沉淀物即得。

所述银增强液(SES)的制备如下：将氢醌(0.085g溶于1.5ml H₂O中)、柠檬酸盐液(0.255g柠檬酸和0.235g柠檬酸三钠溶于1ml H₂O中，pH3.8)、硝酸银(AgNO₃，0.25g溶于1ml H₂O中)以75∶25∶3的比例混匀直至溶液变透明。

本发明方法的原理如下：烷巯基修饰的DNA探针在一定的条件下能够吸附结合固定在纳米金颗粒的表面，形成纳米金探针，在一定的盐离子浓度和温度条件下孵育一定时间后，纳米金标记探针、信号探针、生物素标记的捕获探针和互补的靶miRNAs之间杂交形成一个一端标记纳米金颗粒，一端标记有生物素的杂交双链。随后转移该杂交产物于链霉亲和素包被的酶标板中，37℃孵育30min后，杂交产物通过链霉亲和素-生物素特异识别系统固定于酶标板上，经PBS、PBN溶液洗涤，去除酶标板中游离的纳米金探针，随后经银染增强显色反应放大纳米金信号。酶标仪在518nm波长处记录银染增强液的光吸收A值或光密度A值，通过对靶miRNAs浓度和相应的A值的分析，绘制出miRNAs的浓度与银染增强液A值之间的剂量-效应关系曲线(图1)。

本发明方法与已有文献相比较，存在准确度，灵敏度高的特点。本发明的探针中n和m的设计满足所得的核苷酸序列可以与所检测的miRNA特异性的结合，提高了灵敏度；另外从配对关系上一组A和一组T不容易形成错配，而纳米金直接连接在通用T探针上，这就增加了检查信号的准确性；并且本发明检测方法简单易行，无需放射性标记、荧光等昂贵设备就可获得高灵敏度、高特异度的检测信号，为miRNAs的研究开辟了新途径，可以起到方便快捷的作用。

附图说明

图1为本发明较佳实施例的流程示意图；

图2为采用本发明方法测得的外周血提取的总RNA中miRNA-1的含量曲线图；

图3为采用本发明方法测得的miRNA-1的浓度对数值与A值关系图。

具体实施方式

本发明提供了三种核苷酸序列，以这三种核苷酸序列为探针并结合纳米金技术可以准确快速的检查样本(包括血清，全血，细胞裂解，组织等)中microRNA的含量，其具体包括：

捕获探针：即为由生物素标记的核苷酸序列I，其序列为5’-(y)_n-(CH₂)_a-3’，其中a为3-20；(y)_n表示一种与从miRNAs 5’端起6-16个碱基长度互补的核苷酸序列，所述生物素标记在3’端；所述miRNAs的序列选自SEQ ID NO：1-3中的任一序列。

信号探针：即为核苷酸序列II，其序列为5’-(A)_b-(Y)_m-3’，其中b为8-50；(Y)_m表示一种与从miRNAs 5’端起第7至17个碱基中的任一位点起延伸至3’末端的碱基长度互补的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与前述由生物素标记的核苷酸序列1能够同时与所述miRNAs的全长序列互补结合；A为腺嘌呤。

通用T探针：即为核苷酸序列III，其序列为5’-(T)_d-(CH₂)_e-SH-3’，其中e为3-20；d与所述核苷酸序列II中的b相等，且所述序列可与所述核苷酸序列II互补结合；T为胸腺嘧啶；SH为巯基。

例如，对于miR-1(SEQ ID NO：1)：5’-uggaauguaaaGAAGUGUGUAU-3’，

捕获探针为：5’-tttacattcca-(CH₂)₆-Bio-3’，

信号探针为：5’-(A)₃₀-ATACACACTTC-3’，

通用T探针为：5’-(T)₃₀-(CH₂)₆-SH-3’。

又例如，对于miR-328(SEQ ID NO：2)：5’-cuggcccucucUGCCCUUCCGU-3’，

捕获探针为：5’-gagagggcctg-(CH₂)₆-Bio-3’，

信号探针为：5’-(A)₂₅-ACGGAAGGGCA-3’，

通用T探针为：5’-(T)₂₅-(CH₂)₆-SH-3’。

再例如，对于miR-124-1(SEQ ID NO：3)：5’-uaaggcacgcGGUGAAUGCC-3’，

捕获探针为：5’-gcgtgcctta-(CH₂)₈-Bio-3’，

信号探针为：5’-(A)₁₅-GGCATTCACC-3’，

通用T探针为：5’-(T)₁₅-(CH₂)₆-SH-3’。

本发明所述的三种核苷酸序列是采用常规方法合成HPLC级的脱氧寡核苷酸探针，所有的寡核苷酸溶解于TE缓冲液，分装，贮存于-80℃备用。

本发明的一种测量样本中microRNA含量的试剂盒，其包括所述捕获探针、所述信号探针、纳米金标记探针及银增强液，其中纳米金标记探针是由所述通用T探针与纳米金溶液混合得到。

本发明的一种以核酸碱基配对识别互补结合为基础，经银染增强的纳米金标记探针的miRNAs检测方法，其主要步骤包括：

1.样本的制备与总RNA的提取，是采用常规方法和试剂提取；

2.杂交：将样本、捕获探针、信号探针与纳米金标记探针混合，将该混合物体系转移到各链霉亲和素包被的酶标板孔内孵育，所述纳米金标记探针为通用T探针与纳米金溶液混合得到；

3.纳米金标记探针定量检测microRNA：前述酶标板每孔加入银增强液，室温避光条件下反应至出现灰度信号后用超纯水冲洗终止反应，酶标板置入酶标仪中，单波长扫描，通过酶标仪实时检测溶液的A值。

其中，所述纳米金可以从商业途径购买(例如购自Sino-AmericanBiotechnology Co.，SABC)，也可以采用如下方法制备：将20ml的1.0mM HAuCl4置于容器中加热至煮沸，加入2ml 1％的双水柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，然后在回流条件下剧烈搅拌15min直至观察不到颜色的进一步改变，形成金溶胶，过滤即得本发明纳米金溶液。用此方法制备的纳米金在518nm处有最大吸收峰，平均直径12-13nm。

所述纳米金标记探针可以采用如下方法制备得到：将上述纳米金溶液离心弃上清，加入通用T探针(MST-probe)再分散纳米金，加入缓冲液孵育后取上清离心；弃上清，加缓冲液洗涤沉淀物后离心，再次弃上清；洗涤沉淀物两次以去除多余的未标记上的单链寡核苷；最后，加入缓冲液重悬沉淀物即得。

所述银增强液(SES)的制备如下：将氢醌(0.085g溶于1.5ml H₂O中)、柠檬酸盐液(0.255g柠檬酸和0.235g柠檬酸三钠溶于1ml H₂O中，pH3.8)、硝酸银(AgNO₃，0.25g溶于1ml H₂O中)以75∶25∶3的比例混匀直至溶液变透明。

本发明提供的三种核苷酸序列、试剂盒及检测方法可以在心血管领域检测样品(包括血清，全血，细胞裂解，组织等)中microRNA含量。

下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本专利的保护范围以权利要求为准。

一、材料

1.酶联免疫测定板(酶标板；购自Genetimes Technology，Inc)

二、仪器

1.酶标仪

2.分光光度计

三、试剂

1.链霉亲和素

2.硝酸银(AgNO₃，0.25g溶于1ml H₂O中)

3.柠檬酸

4.柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)

5.柠檬酸盐液：0.255g柠檬酸和0.235g柠檬酸三钠溶于1ml H₂O中，pH3.8

6.氢醌(0.085g溶于1.5ml H₂O中)

7.Trizol裂解液

8.TE缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.4

9.PBN缓冲液：0.3M NaNO₃和10mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液，pH7.0

10.1mM HAuCl₄(四氯金酸)：0.1g HAuCl₄(美国Aldrich公司，货号G4022)溶于500ml去离子水。三价金离子储存液可提前准备如储存在棕色瓶内。

11.NaCl溶液

12.裂解液：20mM Tris-HCl(pH 8.5)，0.5％NP-40，20μg/mL tRNA(不添加二价阳离子)

13.PBS(无MgCl₂和CaCl₂，购自Invitrogen)

14.MOPS(pH7.5)(购自美国Sigma公司)

四、制备方法

1.捕获探针(MSB-探针)、信号探针(MPA-探针)及通用T探针的制备，是采用常规方法合成HPLC级的脱氧寡核苷酸探针，所有的寡核苷酸溶解于TE缓冲液，分装，贮存于-80℃备用。

对于miR-1：5’-uggaauguaaaGAAGUGUGUAU-3’

MSB-探针：5’-(CH₂)₆-tttacattcca-Bio-3’

MPA-探针：5’-(A)₃₀-ATACACACTTC-3’

通用T探针：5’-(T)₃₀-(CH₂)₆-SH-3’。

2.纳米金(GNP)溶液的制备

纳米金的形成可由颜色的变化观察到，小的纳米金颗粒是红色的。纳米颗粒的表面吸附一层柠檬酸阴离子可使颗粒分离。胶体悬液的存在可由粒子对激光束的反射检测到。变成更小的阴离子可使颗粒更接近，并观察到另一个颜色的改变。

(1)加20ml的1.0mM HAuCl₄入50ml锥形瓶内，将锥形瓶置于磁力搅拌电热板上，放入磁力搅拌棒，并加热溶液至煮沸；

(2)向煮沸的溶液中加入2ml1％的双水柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)；

(3)在回流条件下剧烈搅拌15min直至观察不到颜色的进一步改变。柠檬酸盐还原三价金逐渐形成金溶胶；

(4)用0.2μm孔膜过滤胶体溶液，4℃储存，使用前高压灭菌。

用此方法制备的纳米金在518nm处有最大吸收峰，平均直径12-13nm。

胶体悬液的存在可由粒子对激光束的反射检测到。因为激光指示器发射极化光，可使光束显示不可见。当激光束在一个视野可见时，那么在它的垂直视野是不可见的。加入5-10滴1M NaCl溶液，注意溶液颜色的变化，表明纳米颗粒结合的紧密度。

3.纳米金标记探针的制备.

(1)纳米金溶液500μl，4℃14000rpm离心10min，弃上清；

(2)加入300pM通用T探针50μl再分散纳米金，4℃孵育12h；

(3)再加入50μl TE缓冲液，4℃孵育24h；

(4)小心取上清，4℃，14000rpm离心10min；

(5)弃上清，加0.15M NaCl，10mM phosphate(pH7.4)缓冲液洗涤沉淀物；

(6)4℃，14000rpm离心10min，再次弃上清；

(7)洗涤沉淀物两次以去除多余的未标记上的单链寡核苷；

(8)最后，加入0.15M NaCl，10mM phosphate(pH8.5)缓冲液50μl重悬沉淀物，置4℃储存备用。

4.银增强液(SES)的制备

(1)以75∶25∶3的比例混合以下成分

氢醌(0.085g溶于1.5ml H₂O中)；

柠檬酸盐液(0.255g柠檬酸和0.235g柠檬酸三钠溶于1ml H₂O中，pH3.8)；

硝酸银(AgNO₃，0.25g溶于1ml H₂O中)；

(2)涡旋混匀直至溶液变透明。

五、检测方法

1.细胞裂解液的制备

(1)从培养的或血液中得到细胞悬液，密度大约1×10⁶；

(2)1000xg离心3min沉淀细胞；

(3)用1ml PBS(无MgCl₂和CaCl₂，购自Invitrogen)洗涤一次；

(4)1000xg离心3min沉淀细胞；

(5)10mM MOPS(pH7.5)，100mM KCl溶液100μl重悬细胞；

(6)取2μl细胞悬液，加入98μl裂解液(20mM Tris-HCl(pH 8.5)，0.5％NP-40，20μg/mL tRNA(不添加二价阳离子))；

(7)将样本在80℃加热15min；

(8)1000xg离心3min去除细胞碎片等杂质。

2.总RNA的提取

(1)总RNA可从培养细胞，血细胞或组织中提取，使用Trizol试剂，按厂家说明书操作即可；

(2)使用核酸定量仪测定提取的RNA浓度(假定1A260＝40μg/mL)；

(3)-80℃储存样本备用；

(4)使用前稀释RNA至终浓度为20μg/ml。

3.杂交

(1)混合以下溶液：

20μg/ml总RNA样本或细胞液(5μl)或血清(50μl)；

1μl100nM MSB-探针；

1μl100nM MPA-探针；

20μlTE缓冲液(pH 8.5)；

(2)混合物置于25℃，10min；

(3)加入上述纳米金标记探针3μl，混匀，25℃，10min；

(4)将该混合物体系转移到各链霉亲和素包被的酶标板孔内，25℃孵育30min；

(5)1xPBS缓冲液洗涤3min；

(6)2xPBN(0.3M NaNO₃和10mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液，pH 7.0)洗涤2次，每次3min。

4.纳米金标记探针定量检测miRNA

(1)前述酶标板每孔加入100μl银增强液；

(2)室温避光条件下使反应持续150s；

(3)反应出现灰度信号后用超纯水冲洗终止反应；

(4)酶标板置入酶标仪中，单波长扫描，通过酶标仪实时检测溶液的A值。

六、实验结果：

采用本发明的方法检测了外周血提取的总RNA中miRNA-1的含量，如图2所示，每个样本浓度检测3次，以TE缓冲液为阴性对照，结果表明仅需要2ng的外周血总RNA就可以对靶miRNA-1进行检测(图2)。

此外，将合成的miRNA-1序列稀释成不同浓度(从1nmol/L到1fmol/L)，用前述的方法检测，从图3可以看出，检测miRNA-1的最低检测限是1fmol/L，线性范围为(100pmol/L～1fmol/L)内，miRNA-1的浓度对数值与A值具有良好线性关系(R＝0.9923)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，甚至等效，同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。

序列表

<110>哈尔滨中医药大学

<120>用于检测样本中mircoRNAs含量的核苷酸序列及检测方法

<130>KLPI090

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>1

uggaauguaa agaagugugu au                                                         22

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>2

cuggcccucu cugcccuucc gu                                                         22

<210>3

<211>20

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>3

uaaggcacgc ggugaaugcc                                                            20