黄尾鰤腹水病毒的实时定量RT－PCR快速检测方法

摘要

本发明公开了一种黄尾鰤腹水病毒的实时定量RT－PCR快速检测方法，该方法利用正向引物、反向引物和荧光探针并以体外转录RNA标准品作为逆转录和扩增的双重对照，可以对黄尾鰤腹水病毒进行定性、定量检测。本发明具有快速，准确、特异性好、灵敏度高的优点，可以应用于水产养殖场以及检验检疫部门对鱼类病毒的快速检验检疫，也可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景广泛。

说明书

技术领域

本发明属于水产动物病原的检测技术，涉及一种采用实时定量逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，简称RT-PCR)技术检测鱼类黄尾鰤腹水病毒的方法——黄尾鰤腹水病毒的实时定量RT-PCR快速检测方法。

背景技术

黄尾鰤腹水病毒隶属于双片段RNA病毒科(Birnaviridae)、水生双片段RNA病毒属(Aquabirnavirus)，于1985年首次从黄尾鰤(Seriola quinqueradiata)分离到。该病毒可以感染鲈鱼、真鲷、日本比目鱼、琥珀鱼、黄尾鰤等鱼类，目前也已经从贝——日本珍珠贝中分离到黄尾鰤腹水病毒。黄尾鰤腹水病毒是严重影响海水养殖鱼类的一种传染性疾病的病原，对亚洲海洋水产养殖业造成了严重的危害。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局与韩国海洋水产部于2005年发布的《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》中规定，中国出口到韩国的鲈鱼、真鲷、大菱鲆、牙鲆等主要海水养殖鱼类必须进行黄尾鰤腹水病毒的检验检疫。在一些海水养殖和海洋鱼类消费的主要国家中，也将该病作为重要的检疫对象。

目前鱼类病毒的检测方法主要包括细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术三大类。细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察，其操作繁琐，检测周期长，且灵敏度低；免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交，其方法具有特异性强、敏感性高的优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测；分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)，比较快速、灵敏，但是需要琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色观察结果，溴化乙锭是致癌物，对人体和环境有危害，并且交叉污染问题比较严重；另外PCR只能进行定性检测，不能对病毒进行定量检测。

黄尾鰤腹水病毒的检测方法目前主要采用细胞学诊断技术。我国水产养殖业和国际贸易的迅速发展迫切需要建立快速、灵敏、准确的黄尾鰤腹水病毒的检测方法，以尽快检测病原体，打破国外技术壁垒，为国家贸易服务。定量PCR技术目前已被广泛应用于检测水生生物病原体，如对虾白斑综合症病毒、鱼传染性造血器官坏死病毒、副溶血弧菌等，据检索，目前尚未见采用实时定量RT-PCR技术检测黄尾鰤腹水病毒的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄尾鰤腹水病毒的实时定量RT-PCR快速检测方法，以克服现有检测技术的不足，为我国水产养殖业和国际鱼类贸易提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法。

为了实现上述目的，本发明的主要原理是采用荧光探针法实时定量PCR技术，反应体系中包括一对PCR引物和一条荧光探针，荧光探针可以与靶序列特异性的结合，荧光探针的5′端标记有荧光报告基团，5′端标记有荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的能量由于荧光共振能量转移而被淬灭基团吸收，因此反应体系中检测不到荧光信号；在PCR反应过程中，引物和探针都与模板结合，Taq酶发挥5′-3′外切核酸酶活性，将荧光探针切断从而使荧光报告基团远离淬灭基团，因此产生可以检测到的荧光信号。随着PCR循环次数的增加，释放出来的荧光信号不断增加，荧光信号强度与扩增产物的数量呈正比关系，仪器记录荧光信号强度，最终计算出循环阈值(Threshold cycle，简称Ct值)。Ct值是指荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，Ct值与模板的初始拷贝数成反比，初始拷贝数越多，Ct值越小；利用已知拷贝数的标准品制备出标准曲线，再根据样品的Ct值，可以对样品中的黄尾鰤腹水病毒进行准确的定量检测。

本发明的技术方案如下：

首先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后提取待测样品的RNA，之后配制实时定量RT-PCR反应体系并按照反应程序进行反应，同时利用体外转录含有目的扩增片段的核糖核酸(Ribonucleic acid，简称RNA)作为标准品进行反应以绘制标准曲线；最后根据定量PCR仪得到的待测样品的Ct值来判定待测样品中是否含有黄尾鰤腹水病毒并进行定量。

本发明所述的设计特异性引物序列和荧光探针序列：选取黄尾鰤腹水病毒的衣壳蛋白基因保守序列，利用已有的Primer Express 2.0软件设计特异性引物序列和荧光探针序列，为：

正向引物：5′-GGCTGATCTCACGGAAATACG-3′；

反向引物：5′-GTCCCATTCAGGGCATACAGA-3′；

荧光探针：5′-FAM-TCCAGAGCTCAACCCTACCCGCTG-TAMRA-3′。

荧光探针的5′端标记荧光报告基团6-羧基荧光素(6-Carboxyfluorescein，简称FAM)，3′端标记荧光淬灭基团6-羧基四甲基罗丹明(6-Carboxytetramethylrhodamine，简称TAMRA)，扩增片断长度为70bp。

本发明所述的提取待测样品的RNA：采用传统的TRIZOL法或者商业化的RNA提取试剂盒提取待测样品的RNA，之后用核酸分析仪进行OD₂₆₀/OD₂₈₀检测。

本发明所述的配制实时定量RT-PCR反应体系并按照反应程序进行反应：实时定量RT-PCR反应体系由以下成分组成：12.5μL 2×实时定量RT-PCR反应液，1-2μL 10μmol/L正向引物，1-2μL 10μmol/L反向引物，0.5-1μL 10μmol/L荧光探针，1-2μL 100ng/μL待测样品的RNA，补充双蒸水至反应体系总体积为25μL。在PCR反应管中配制好反应体系后，将反应管放到定量PCR仪器中进行扩增反应，反应程序为：48℃-52℃反应30-60min；95℃反应10min；之后95℃反应15sec-30sec，57℃-63℃再反应30sec-1min；进行40个循环。

本发明所述的制备体外转录含有目的扩增片段的RNA作为标准品进行定量PCR反应绘制标准曲线：首先将PCR产物电泳后切下含有目的片段的凝胶，用凝胶纯化试剂盒纯化，与pGEM-T载体4℃过夜连接，转化感受态细胞，转化产物涂平板培养，挑取白斑PCR产物鉴定阳性后测序，根据测序结果将筛选的阳性克隆接种到含氨苄青霉素的溶菌肉汤培养基，过夜培养，制备质粒脱氧核糖核酸纯化后，经过Nco I酶切后，利用T7启动子体外转录制备RNA模板，乙醇沉淀后于紫外分光光度计测定OD₂₆₀定量，并梯度稀释，为6×10⁶-6×10¹拷贝/μL；将梯度稀释的标准品进行实时定量RT-PCR反应；由定量PCR仪得到标准品的Ct值(Threshold cycle，循环阈值)，根据标准品的浓度和Ct值，仪器自动绘制出标准曲线。

本发明所述的根据待测样品的Ct值来判定待测样品中是否含有黄尾鰤腹水病毒并进行定量：若待测样品的Ct值≤36.0，则判定待测样品中含有黄尾鰤腹水病毒，而其病毒含量通过Ct值和标准曲线由定量PCR仪自动计算；若待测样品的Ct值>36.0，则判定待测样品中不含有黄尾鰤腹水病毒。

本发明适用于对黄尾鰤腹水病毒进行快速检测，可广泛应用于鱼类特别是鲈鱼、真鲷等养殖场的疫病监控及进出口水生动物贸易中黄尾鰤腹水病毒的检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

1.检测快速、效率高：采用一步法实时定量RT-PCR反应，即反转录和聚合酶链反应在同一管中进行，大大减少交叉污染和加样误差，并节约了时间；该检测方法在反应结束后，可立即通过仪器软件进行结果判定，不需要琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色观察结果，减少了环境污染和样品交叉污染，从核酸提取到结果判定仅需要4小时；一次可以进行96个样品的检测，具有高效性。

2.可实现准确定量：通过体外转录制备RNA作为标准品，可以对逆转录和PCR扩增同时进行对照，这样建立的标准曲线更直接、准确；再通过样品的Ct值，可以对待测样品中的黄尾鰤腹水病毒进行定量，准确度高，做到了真正意义上的定量检测。

3.特异性强：特异性引物和荧光探针只与黄尾鰤腹水病毒特异性地结合，与弹状病毒科的其他病毒都没有交叉反应。

4.检测范围广，灵敏度高：在标准品浓度为6×10⁶-6×10¹拷贝之间，都有扩增反应，检测范围可达6个数量级；检测限达60个RNA拷贝，灵敏度高。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1以患病鲈鱼样品为例，采用实时定量RT-PCR方法定量检测黄尾鰤腹水病毒。

自黄海沿岸某养殖场取五尾鲈鱼作为检测样品，该样品具有感染黄尾鰤腹水病毒的典型临床症状，体表和鳍充血，腹部膨胀，内有腹水。

本实施例具体检测步骤包括：

(1)设计特异性引物序列和荧光探针序列

在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/中搜索黄尾鰤腹水病毒的序列，利用已有的DNALASERGENE7.1软件分析比较各个基因序列的保守性，结果表明黄尾鰤腹水病毒的衣壳蛋白基因序列比较保守；因此，以衣壳蛋白基因为目标基因，利用Primer Express 2.0软件设计特异性引物序列和荧光探针序列。设计过程中要求引物的退火温度(melting temperature，简称Tm)在57℃-63℃之间，两条引物的Tm值相差2℃以内，且不形成引物二聚体，荧光探针的Tm值比引物高8℃-10℃。设计的特异性引物序列和荧光探针序列如下：

正向引物：5′-GGCTGATCTCACGGAAATACG-3′；

反向引物：5′-GTCCCATTCAGGGCATACAGA-3′；

荧光探针：5′-FAM-TCCAGAGCTCAACCCTACCCGCTG-TAMRA-3′。

扩增片断长度为70bp。

设计好特异性引物序列和荧光探针序列后，通过TAKARA商业公司，采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行特异性引物和荧光探针的合成与荧光标记。荧光探针的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA。

(2)提取待测样品的RNA

采用RNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 3.0)，按照说明书进行RNA的提取。具体步骤为取50mg的取鲈鱼的肾、脾、脑等组织匀浆，放入到1.5ml离心管中，加入500μL Solution A，剧烈振荡混匀室温放置5分钟。加入125μL Solution B和125μL DB buffer，充分混匀后，12,000rpm离心5分钟。将试剂盒中的Spin Column安置于Collection tube(2ml)上，将离心后的850μL上清液转移到Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。加入500μL的RinseA至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。加入500μL的Rinse B至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。再加入500μL的Rinse B至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30～200μL的灭菌蒸馏水或者Elutionbuffer，室温静置1分钟。12,000rpm离心1分钟，即得到待测样品的RNA。用核酸分析仪进行定检测，结果表明样品核酸的OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.0之间，调整RNA浓度为100ng/μL。

(3)配制实时定量RT-PCR反应体系并按照反应程序进行扩增反应

在PCR反应管中加入12.5μL 2×实时定量RT-PCR反应液，1μL 10μmol/L正向引物、1μL10μmol/L反向引物，0.5μL 10μmol/L荧光探针，1μL 100ng/μL待测样品RNA，9μL双蒸水，使得反应体系总体积为25μL。采用美国产的ABI 7900HT型定量PCR仪器进行反应，实时定量RT-PCR反应程序为：48℃反应40min 95℃反应10min；之后95℃反应15sec，58℃再反应40sec并进行40个循环。

(4)制备含有目的扩增片段的体外转录RNA作为标准品进行反应绘制标准曲线

按照常规分子克隆操作方法，首先PCR产物电泳后切下含有目的片段的凝胶，用TAKARA公司的凝胶纯化试剂盒纯化，与pGEM-T载体4℃过夜连接，转化感受态细胞，转化产物涂平板培养，挑取白斑PCR产物鉴定阳性后送TAKARA公司测序，根据测序结果将筛选的阳性克隆接种到含氨苄青霉素的LB培养基过夜培养，制备质粒DNA纯化后，经过Nco I酶切后，利用T7启动子体外转录制备RNA模板，乙醇沉淀后于核酸分析仪测定OD₂₆₀定量，测定浓度为6×10⁶拷贝/μL。

将标准品进行系列稀释，分别得到浓度为6×10⁶、6×10⁵、6×10⁴、6×10³、6×10²、6×10¹拷贝/μL的标准品，以6个不同浓度梯度的标准品为模板，每个浓度做3个重复，进行实时定量RT-PCR反应，反应体系和反应程序与步骤(3)相同，只是将反应体系中的待测样品RNA替换为标准品。ABI 7900HT型定量PCR仪在反应过程中自动收集荧光信号，反应结束后，利用仪器自带的SDS2.1软件进行数据分析，得到各个浓度的标准品的Ct值，见表1。

表1  标准品的浓度及Ct值

 

样品名称样品类型循环阈值(Ct)标准品的浓度(拷贝/μL)标准品1-1标准品18.914626×10⁶标准品1-2标准品18.861566×10⁶标准品1-3标准品18.978526×10⁶标准品2-1标准品21.609396×10⁵标准品2-2标准品21.437116×10⁵标准品2-3标准品21.649706×10⁵标准品3-1标准品24.903236×10⁴标准品3-2标准品24.632306×10⁴标准品3-3标准品24.867046×10⁴标准品4-1标准品28.288596×10³标准品4-2标准品28.310736×10³标准品4-3标准品28.481966×10³标准品5-1标准品31.904106×10²标准品5-2标准品31.792726×10²标准品5-3标准品32.000396×10²标准品6-1标准品35.744986×10¹标准品6-2标准品35.698426×10¹标准品6-3标准品34.179976×10¹

根据标准品拷贝数与Ct值的关系，定量PCR仪的SDS2.1分析软件自动绘制出标准曲线，即样品的RNA浓度(X)与Ct值的关系为：Ct＝-3.271gX+37.48，相关系数R²＝0.9963，

(5)根据待测样品的Ct值判定待测样品中黄尾鰤腹水病毒的含量并进行定量

标准品浓度最低为60个拷贝时，其Ct值的平均值为35.20，因此建立检测的判定标准为：以Ct值＝36作为临界值，若待测样品的Ct值≤36.0，则判定样品中含有黄尾鰤腹水病毒，并根据其Ct值和标准曲线进行定量；若待测样品的Ct值>36.0，则判定样品中不含有黄尾鰤腹水病毒。

经定量RT-PCR检测，五尾鲈鱼待测样品的Ct值分别为19.09322、21.08242、25.60087、22.49328、31.00698(见表2)，Ct值都小于36.0，判定样品都含有黄尾鰤腹水病毒；再根据待测样品的Ct值和标准曲线，SDS2.1分析软件定量计算出鲈鱼样品中的黄尾鰤腹水病毒拷贝数，见表2。

表2　五尾鲈鱼样品的黄尾鰤腹水病毒的定量RT-PCR检测结果

 

样品名称样品类型循环阈值(Ct)黄尾鰤腹水病毒的浓度(拷贝/μL)鲈鱼1待测样品19.09322419631鲈鱼2待测样品21.08242103407鲈鱼3待测样品25.600874293鲈鱼4待测样品22.4932838290鲈鱼5待测样品31.0069895

实施例2 分析外观健康的真鲷样品是否感染黄尾鰤腹水病毒。

真鲷样品采自黄海南岸某养殖场，共六尾，外观正常，无黄尾鰤腹水病毒的症状，利用实时定量RT-PCR快速检测真鲷样品体内是否携带黄尾鰤腹水病毒。

本实施例具体检测步骤包括：

(1)设计特异性引物序列和荧光探针序列

同实施例1。

(2)提取待测样品的RNA

采用传统的TRIZOL法进行核酸的提取。具体步骤为取待测样品的脑、肾、脾等组织进行匀浆，加入600μL TRIZOL，颠倒混匀，再加入200μL氯仿，混匀器上震荡混匀5sec。于4℃ 12000rpm离心15min。吸取上清液500μL，加入400μL异丙醇，-20℃放置30分钟。12000rpm离心15min，倒去上清；然后加入600μL 75％乙醇，洗涤沉淀，于12000rpm离心5min，轻轻倒去上清。将RNA沉淀室温干燥3min后，加入20μL双蒸水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA。2000rpm离心5sec，在冰上保存备用。之后用核酸分析仪进行检测，结果表明样品核酸的OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.0之间，调整RNA浓度为100ng/μL。

(3)配制实时定量RT-PCR反应体系并按照反应程序进行扩增反应

在PCR反应管中加入12.5μL 2×实时定量RT-PCR反应液，1.5μL 10μmol/L正向引物、1.5μL 10μmol/L反向引物，0.5 10μmol/L荧光探针μL，2μL待测样品RNA，7μL双蒸水，反应体系总体积为25μL。采用ABI 7900HT型定量PCR仪器进行反应，实时定量RT-PCR反应程序为：48℃反应40min；95℃反应10min之后95℃反应20sec，58℃再反应50sec共进行40个循环。

(4)制备含有目的扩增片段的体外转录RNA作为标准品以绘制标准曲线

同实施例1。

(5)根据仪器软件得到的待测样品的Ct值来判定待测样品中的黄尾鰤腹水病毒并定量

经实时定量RT-PCR检测，仪器给定的六尾真鲷样品的Ct值都大于36.0，判定外观正常的真鲷样品都不含有黄尾鰤腹水病毒。

实施例3 分析从某国进口的外观健康的大菱鲆是否感染黄尾鰤腹水病毒。

本实施例具体检测步骤包括：

(1)设计特异性引物序列和荧光探针序列：同实施例1。

(2)提取待测样品的RNA：同实施例2。

(3)进行实时定量RT-PCR反应：同实施例2。

(4)制备含有目的扩增片段的体外转录RNA作为标准品以绘制标准曲线：同实施例1。

(5)根据仪器软件得到的待测样品的Ct值来判定待测样品中的黄尾鰤腹水病毒并定量：

经实时定量RT-PCR检测，仪器给定的大菱鲆样品的Ct值大于36.0，判定外观正常的大菱鲆样品不含有黄尾鰤腹水病毒。

核苷酸序列表

<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>黄尾鰤腹水病毒的实时定量RT-PCR快速检测方法

<160>4

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)...(21)

<223>根据定量RT-PCR反应要求设计，用于扩增黄尾鰤腹水病毒的正向引物。

<400>1

ggctgatctc acggaaatac g                                21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)...(21)

<223>根据定量RT-PCR反应要求设计，用于扩增黄尾鰤腹水病毒的反向引物。

<400>2

gtcccattca gggcatacag a                                 21

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<222>(1)...(24)

<223>根据定量RT-PCR反应要求设计，用于扩增黄尾鰤腹水病毒的荧光探针。

<400>3

tccagagctc aaccctaccc gctg　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 24

<210>4

<211>70

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<222>(1)...(70)

<223>定量RT-PCR反应的目的扩增片段序列

<400>4

ggcugaucuc acggaaauac gacguccaga gcucaacccu acccgcuggu cuguaugccc 60

ugaaugggac                                                       70