含有人源原癌基因c－Ha－ras的转基因小鼠的制作方法及其用途

摘要

本发明提供了一种在基因组中整合有人原癌基因c－Ha－ras DNA的转基因小鼠的制作方法。转入DNA含有人c－Ha－ras基因的4个编码外显子、内含子及调控序列。调节序列优先选自c－Ha－ras基因本身的启动子区域和polyA加尾信号序列。利用该方法制作的转基因小鼠、子代、胚胎、器官和/或衍生的细胞可用于多种癌症的癌变机理研究、致癌物或抑癌物的筛选研究、药物的临床前安全性评价。

说明书

技术领域

本发明涉及制作癌症转基因动物模型的方法；该动物模型在多种癌症的癌变机理研究、致癌物或抑癌物的筛选研究、药物的临床前安全性评价研究中的用途；以及由该模型动物衍生出来的细胞、组织、器官及胚胎及其在上述领域中的用途。

背景技术

自80年代初首例转基因小鼠诞生以来，已经建立和发展了较多的基因导入方法，包括显微注射、反转录病毒介导的基因转移、胚胎干细胞技术、核移植技术、基因敲除(敲入)技术与RNA干涉，以及精子载体等，并由此也产生了众多专利(美国专利：US6576811B1，2003)。

其中，因为其稳定性和成功率较高，显微注射方法成为转基因的最为常用的方法之一。它是将含有重组DNA的溶液直接注射进入胚胎中，在多数情况下，是将DNA注射到雄性前核中。在精制用于显微注射的DNA溶液时，一般采用酶切、回收目的DNA片段，凝胶DNA纯化等步骤获得纯净的DNA样品。合适的显微注射针和持定针是把DNA成功注射入0.5天的胚胎雄性前核的关键。胚胎的质量也是转基因成功的关键，良好的胚胎形状规则，饱满。

把经显微注射的胚胎移植到假孕母鼠受体是一项技术性强但很直接的一项外科技术，它的全套操作必须做到无菌，快速和灵巧。待假孕鼠怀孕生仔后，通过剪取幼仔尾尖或者通过打孔器取得部分耳阔，获取2～4周龄的可能的转基因首建鼠的组织样品，用于提取DNA，通过PCR或者Southern杂交技术确定目的基因的整合情况。

小鼠在6～8周龄性成熟时可以用于交配建系。出生的转基因后代也通过PCR或Southern杂交方法鉴定，留存含有转基因的动物，进一步繁殖扩大，以便实现①通过几代的繁育来观察转基因的表达和遗传性；②扩大群体数量为试验研究提供更多的小鼠；以及③产生纯合转基因鼠并与杂合转基因鼠进行比较。

疾病动物模型的建立是转基因研究的重要领域，其中癌症动物模型的建立尤为受到重视。这是因为，癌症是威胁当今人类生命的第二大疾病。据WHO报道，2005年全球有5800万人因病死亡，二其中有13％为罹患癌症死亡。世界各国不断投入大量的资金和人力用于癌症发生机理研究和治疗性药物的研制(Wynn，2007；Clin Invest.117：524-529；Galanski and Keppler，2007，Anticancer Agents Med Chem，7：55-73)。但是，无论是在基础研究领域还是在药物研发领域，都会遇到因缺乏合适的评价手段和研究平台而导致工作停滞不前的被动局面，为适应这一需求，各种通过现代生物技术手段对受体动物基因组进行改造的遗传修饰动物模型(Genetic Modified Animal model)应运而生(Barone Metal，2006，Mol Med，12：115-23；Choedon et al，2006，World JGastroenterol，12：2517-2522)。癌症转基因小鼠模型的出现有力的推动了癌症研究的发展，它是在分子水平和整体水平开展有关癌发生、发展、转移(Tanaka et al，2006，Ann N YAcad Sci.2006，1086：1-10)和防治研究(Galanski and Keppler，2007，Anticancer Agents Med Chem，7：55-73)的良好活体材料，也是癌相关药物研制、新药安全性评价的优良平台(Mitsummori，2003，J Toxicol Sci.28：371-383)。从中获得的信息和数据、以及这些数据与人体的相关性是其它离体手段难以取代的。

对于致癌性评价而言，传统的致癌性实验多采用大小鼠进行，时间长(需2年)、费用高、结果针对性差。鉴于此，ICH等国际机构倡用导新的手段来评价药物的致癌性，转基因癌症动物模型是理想替代手段。因此，建立优秀的癌症动物模型十分必要。

rasH2转基因小鼠和大鼠(美国专利US6576811B1)就是此类癌症转基因模型之一。该小鼠模型最先由日本实验动物中心研究所于1989年建立(Katsuki et al，1989)，导入的是人的正常全长ras基因(c-Ha-ras)(Sekiya et al，1985)。c-Ha-ras是ras原癌基因家族的一员，编码由189个氨基酸组成的p21蛋白。p21蛋白是细胞内信号传导系统中的重要信号转导因子，对细胞的增殖和分化起着调节作用(Douglas R，1993)。ras基因第12、13、61位编码子突变可引起p21蛋白构象改变，导致发生多种癌症(Mitsummori，2003)。rasH2癌症模型在致癌性风险评价方面有着十分重要的用途。根据2003年国际生命科学研究所(ILSI)，环境与健康科学研究所(HESI)和国际毒理项目(NTP)等多家国际机构对几十种已知遗传毒性致癌物的联合测试，发现该模型能够准确的区分致癌物和非致癌物，反应灵敏，结果可靠，实验周期仅需26周，是符合ICH新药短期致癌性检测指导原则的最佳替代模型(替代传统2年期大小鼠致癌性实验)。

在诱导致癌的机理研究方面业已做了大量的工作，加深了人们对致癌机理的认识(Mitsummori，2003)。起初人们认为，转入多拷贝人原癌基因后，为化学致癌物将原癌基因转化为癌基因提供了更多靶点(Saitoh et al，1990，Oncogene，5：1195-1200)，致使该模型对致癌物更为敏感。转基因点突变活化也是一个原因，如前胃和皮肤乳头瘤的产生(Ando et al，1992，Cancer Res，52：978-982；Mori et al，2000，Toxicol.Pathol.13：165-172)；但对肝肿瘤而言，与点突变的相关性不甚明确(Hayashi et al，1998，Toxicol.Pathol.26：556-561)。后来的研究显示，过表达的转基因产物与癌变信号通路中其它的癌基因和抑癌基因相互作用可能是该模型对致癌物敏感的深层原因(Tamaoki，2001，ToxicolPathol.29suppl：81-89)。在致癌物诱导下，鼠内源ras基因表达上调，cks1b，tpm1，reck，gelsolin等癌相关基因转录水平改变的事实(OkamuraM，et al，2007，Cancer Lett.245：321-330)为这一假设提供了部分证据。

尽管如此，由于该模型的基因来源于一个肿瘤病人(Sekiya T et al，1984；1985)，原本已经发生突变。为了获得正常的转基因，不得不经过多步分子生物学操作，校正突变位点。另一方面，该模型的转基因较大，在5-端有较长的“冗余”序列。这些不足会给基因操作增加难度，而且不利于重复。

鉴于此，本申请人在实际工作中，构建了含有人原癌基因c-Ha-ras的转基因动物模型。该模型的转基因来自于正常人基因组，分离完成后可直接用于转基因。对转基因进行了优化，比以前使用的转基因在5-端减少了0.4kb。

更为重要的是，获得的动物模型具有独到的表型。以前的转基因属于诱导型模型，其外观和体重与正常鼠几乎无异(http://www.rash2.com/-phenotype)，一般只有在给予阳性致癌物时才诱导产生肿瘤，自发瘤的几率很低(<1.1％)，发生时间晚(8～27周，皮肤鳞状细胞乳头瘤，http://www.rash2.com/-background data)。而本研究获得的首建鼠出生后2周左右，即在背部自发产生可见瘤状物，生长速度快，并且由一处发展成多处。也就是说，与日本的rasH2模型相比，本研究获得的癌症转基因模型由诱导型变成了自发型，发生的时间较之早，表明可以作为一个新的癌症动物模型，用于癌症发生机理研究。主要表现在：本模型为自发型，而且发生时间比日本rasH2模型早，这暗示了本模型可能对于致癌物的反应比rasH2更为敏感，更适合用于癌症发生机理方面的研究。鉴于人类癌症发生的深层原因是“人体本身与环境因素长期相互作用的结果”，而一般情况下，人体接触类似大剂量强致癌物的几率很低，所以有理由相信，自发型模型得出的有关癌症机理的数据比诱发型更接近人体真实。此外，本模型是转基因现象学研究的良好材料。已有研究表明，转基因的表达强烈的受到宿主染色体整合位点的影响，转基因表达水平的高低与拷贝数的关系不甚明星，而与整合位点有关。本研究中获得转基因首建鼠在早期即出现了瘤状物，暗示了转基因的表达水平高或发生突变(奚涛，2001，药物生物技术，2001，8：301-305)。本模型与日本的模型进行比较研究，可回答插入位点与转基因表达的关系等基本问题。因此，在基础研究方面，本模型也必将有着重要的用途。

肿瘤的自发性与宿主的遗传背景有较大的关系。自发肿瘤对模型动物在安全评价中应用是不利的，因为自发肿瘤会与有致癌性风险的待试物诱导产生的肿瘤混淆。为了解决这一问题，可与转基因动物C57与另一个近交系如BALB/c杂交，使用产生的F1即可。

发明内容

本发明涉及含有人源原癌基因c-Ha-ras的转基因小鼠的制作方法及其用途。该动物模型被人为的转入了人源原癌基因c-Ha-ras。该基因来自人体正常组织，转基因含有该基因的调控序列、全部外显子和内含子，以充分保证所表达蛋白的完整性。实施该发明的途径主要有显微注射法，是本发明的实施方案之一。首先从人体组织中分离基因，经过多级纯化精制获得转基因，经显微注射方法注入鼠胚胎中，然后移植到假孕鼠体内；经过分子生物学方法检测，获得含有转基因的阳性转基因动物；进一步交配建系，获得转基因动物种群。在此基础上，可以进一步获得该动物模型的细胞、器官及胚胎。

本发明所述的人原癌基因c-Ha-ras，其序列如SEQ ID NO：1所示。所述的人原癌基因c-Ha-ras含有4个编码外显子、启动子区域及多聚腺苷酸加尾信号序列polyA。其中所述的启动子是啮齿类绒毛蛋白启动子、巨细胞病毒CMV的启动子；所述的加尾序列是SV40、BGH的polyA信号序列。

本发明还包括含有所述的人原癌基因c-Ha-ras的宿主细胞，以及由所述的宿主细胞形成的组织，器官。

本发明涉及所述的宿主细胞、组织或器官在致癌物筛选或评价、抑癌物的筛选、药物的安全性评价中的用途；在毒理学中的用途和在免疫毒理学中的用途。

本发明涉及制备基因组中含有所述的人原癌基因c-Ha-ras的啮齿类受精卵的方法，其步骤为：

(1)分离获得人原癌基因c-Ha-ras基因；

(2)通过超排卵、交配、受精卵筛选分离步骤获得啮齿类受精卵；

(3)通过显微注射方法将c-Ha-ras基因注入受精卵中，获得含有人原癌基因c-Ha-ras的啮齿类受精卵；

本发明还涉及制备基因组中含有所述的人原癌基因c-Ha-ras的啮齿类转基因动物的方法，步骤为：

(1)制作输精管结扎雄鼠，然后让其与正常的发情期雌鼠交配，获得假孕鼠；

(2)将如权利要求9所述的受精卵直接移植或者在CO2培养箱中过夜培养至2细胞时移植入假孕鼠的输卵管内；

(3)让假孕鼠生仔，待离乳后通过分子生物学方法检测获得转基因阳性子代，即首建鼠；

(4)在首建鼠性成熟后进行交配建系，获得该转基因动物。

本发明的有益效果在于本申请人对人原癌基因c-Ha-ras进行了优化，使其比现有技术中的转基因在5-端减少了0.4kb。更为重要的是，提供本发明的方法获得的动物模型具有独到的表型，所获得的首建鼠出生后2周左右，即在背部自发产生可见瘤状物，生长速度快，并且由一处发展成多处。即本发明获得的癌症转基因模型为自发型，发生的时间较早，表明可以作为一个新的癌症动物模型，用于癌症发生机理研究。

此外，本模型是转基因现象学研究的良好材料。已有研究表明，转基因的表达强烈的受到宿主染色体整合位点的影响，转基因表达水平的高低与拷贝数的关系不甚明星，而与整合位点有关。本研究中获得转基因首建鼠在早期即出现了瘤状物，暗示了转基因的表达水平高或发生突变(奚涛，2001，药物生物技术，2001，8：301-305)。本模型与日本的模型进行比较研究，可回答插入位点与转基因表达的关系等基本问题。因此，在基础研究方面，本模型也必将有着重要的用途。

肿瘤的自发性与宿主的遗传背景有较大的关系。自发肿瘤对模型动物在安全评价中应用是不利的，因为自发肿瘤会与有致癌性风险的待试物诱导产生的肿瘤混淆。为了解决这一问题，可与转基因动物C57与另一个近交系如BALB/c杂交，使用产生的F1即可。

附图说明

图1显示本发明所用c-Ha-ras基因的结构示意图及与现有技术中(美国专利US6576811B1)公开的基因的长度对比。本发明所用转基因长度为6.5kb(图1-A)，含有4个外显子，依次为Ex1，Ex2，Ex3和Ex4，以实心方框表示；现有技术公开的转基因为6.9kb(图1-B)，在5’端侧翼区比本发明所述的c-Ha-ras基因多出0.4kb。图中表明了与全基因拼接相关的酶切位点。

图2显示转基因c-Ha-ras的全序列。画线部分为4个外显子区域。

图3显示转基因c-Ha-ras的分离策略。从正常人血液中分离基因组DNA，然后采用PCR方法分别扩增5’端1991bp、中段的1853bp，以及3’端的3180bp。扩增的1853bp片段5’端含有KpnI位点，而在3’端，添加EcoRI位点。扩增片段用KpnI+EcoRI双切，获得1400bp的片段，插入同样双切的pUC19载体中，获得第一个中间载体pUC19-1400。然后将扩增的1991bp片段用HindIII+KpnI，获得具有两个粘端的1900bp片段，插入上述中间载体pUC19-1400，获得第二个中间载体pUC19-3300。将扩增获得3180bp的片段测序后，用EcoRI再次切下，并将pUC19-3300用EcoRI线性化，并将3180片段插入，获得含有全长转基因c-Ha-ras载体pUC19-6500。由于3180bp片段两端均为EcoRI位点，需要对插入的方向进行鉴定，以获得插入方向正确的载体。

图4显示首建鼠在出生2周内即在背部发生多处瘤状物(箭头所示)。首先出现的前背部，圆形，较坚硬，约2×3mm大小，生长速度快，6周左右最大者达1×1cm，并且由一处发展成多处。这一特性在以前同类模型中未见描述。

图5显示首建鼠的自发肿瘤。在出生后一年左右，有两只首建鼠在颈部出现显著肿瘤，一只在后背部出现显著肿瘤。图4-A，在颈部出现明显的肿瘤；图4-B，在肺部发现多处肿瘤，箭头所示其中较大者图。4-C，从小鼠身体分离下来肿瘤，箭头所示在大的肿瘤内部含有多个小型肿瘤；图4-D，显示分离下来的长有肿瘤的肺叶。即使在这些转基因阳性小鼠发生明显肿瘤时，而其同窝转基因阴性小鼠表型正常。

图6显示转基因的突变检测。从转基因动物首建鼠、包括其子代的尾尖组织提取DNA，通过高保真PCR扩增转基因的部分片段。该片段长1853bp，包含c-Ha-ras基因的4个外显子，也既是包含了易发生突变的部位，即12，13和61位氨基酸编码子。将PCR扩增所得片段经T-A克隆后测序，并通过DNAssist软件进行序列比对。图中Sequence0为原始序列，以此为基准，图6-A中，第96-98碱基、99-101碱基分别编码12、13氨基酸；图6-B中，第510-512碱基编码第61位氨基酸。可见，这3个敏感位点均未发生突变。

具体实施方式

实施例1：人源原癌基因c-Ha-ras DNA的分离

1.人源原癌基因c-Ha-ras DNA的结构

本发明涉及基因组中整合了含有人源原癌基因c-Ha-ras DNA的啮齿类转基因动物的制作方法。本发明所用转基因(Transgene)为c-Ha-ras基因，全长6.5kb，含有4个外显子，含有该基因本身的启动子、调控序列和polyA信号序列。它来自于正常人血液组织，比前文献报道所用转基因短0.4kb(图1)，其全长序列见图2。

2.人源原癌基因c-Ha-ras DNA的分离

在之前的文献报道中，转基因c-Ha-ras DNA获得采用构建文库的方式进行(Sekiya T et al，1984；1985)，分离基因的起始DNA来自一名恶性黑色瘤日本病人。由于该原癌基因的12、13和61位氨基酸易发生突变，突变后往往导致该基因的活化，并进一步诱发癌变。而来自肿瘤组织的DNA往往已经发生突变，这对进一步显微注射不利。在以前的文献报道中，多采用分子生物学方法进行改造，获得完整的未发生突变的转基因，增加较多的工作量。

由于文库构建是一个较复杂，较费时费力的工作。而PCR技术如今已很成熟，故本发明采用PCR方法分段扩增、T-A克隆测序，然后拼接成完整基因的策略。根据序列特征，将基因分成前、中、后三段进行分离(图3)。首先从正常人血液中分离基因组DNA，然后采用PCR方法分别扩增5’端长度为1991bp的片段，扩增的引物对为Pri.F6506：gctaagcttggtcccggcggatcccagcctttc和Pri.R371：gagaattccagcctctccctggtacctctcatgcc；为了便于连接，在前端引物Pri.F6506中添加了酶切位点HindIII；中段的1853bp的片段，扩增的引物对为Pri.F4886：gctaagcttggcaggtggggcaggagaccctgtag，在引物中添加了HindIII位点，和Pri.RN1735：gcgaattcctgcggtcagcagcctcccttgtgcc，在引物中添加了EcoRI位点；以及3’端的3180bp片段，扩增采用的引物对为Pri.FN1735：acgaattctcctgacgcaggtgagggggactc，在引物中添加了EcoRI，和Pri.RXN(E)：gctgaattcaatgagggatccctggagggatgcctggtg，也在引物中添加了EcoRI位点。扩增的1853bp片段5’端含有KpnI位点，而在3’端，添加EcoRI位点。将该扩增片段用KpnI+EcoRI双切，回收1400bp的片段，插入同样双切的pUC19载体中，获得第一个中间载体pUC19-1400。然后将扩增的1991bp片段用HindIII+KpnI，插入用中间载体pUC19-1400，获得第二中间载体pUC19-3300。将扩增获得3180bp的片段经T-A克隆测序后，用EcoRI再次切下，回收纯化，并将pUC19-3300用EcoRI线性化，并将3180片段插入，获得含有全长转基因c-Ha-ras载体pUC19-6500。由于3180bp片段的两端均为EcoRI位点，所以需对插入的方向进行鉴定，将插入方向正确的质粒保存用于转基因的扩增。

实施例2：人源原癌基因c-Ha-ras DNA的导入

如本领域人员所知，通过显微注射(Microinjection)生产转基因动物的过程包括以下多个步骤：(1)制备不育雄鼠和假孕母鼠；(2)超排卵；(3)收获受精卵；(4)目的DNA的制备；(5)将目的DNA导入受精卵；(6)受精卵的移植；(7)首建鼠Founder中目的DNA整合情况的检测；(8)通过杂交繁育转基因小鼠品系。在本发明中，显微注射方法均根据标准方法进行的，故不作更多的叙述。但是，本发明在实施过程中，建立了一种适用的将DNA溶液注入显微注射针的方法，此方法可在2分钟左右完成DNA溶液的填充，非常迅速。这一技术大大推进了显微注射工作进程(生物技术通讯，2007年04期)。

实施例3：转基因动物的选择

任何适当的啮齿类动物可作为受体动物以用于生产本发明所述的“转基因动物”。显然，“转基因动物”还包括转基因动物所产生的新生儿、年幼的子代、发育成熟的动物及其胚胎；以及转基因动物的子代的新生儿、年幼的子代、发育成熟的动物及其胚胎。转基因动物及其子代的例子包括小鼠、大鼠、豚鼠等等，优选的啮齿类动物是小鼠，如C57小鼠。这是引物C57为成熟的近交系，遗传背景清楚，稳定，而且其受精卵适合做显微注射，相对易于制作模型动物。

实施例4：转基因动物的表型

本发明获得的首建鼠具有新的表型。日本rasH2属于诱导型模型，其外观和体重与正常鼠几乎无异(http://www.rash2.com/-phenotype)，一般只有在给予阳性致癌物时才诱导产生肿瘤，自发瘤的几率很低(<1.1％)，发生时间晚(8～27周，皮肤鳞状细胞乳头瘤，http://www.rash2.com/-background data)。而本研究获得的首建鼠出生后2周左右，即在背部自发产生可见瘤状物(图4)，生长速度快，6周左右最大者达1×1cm，并且由一处发展成多处。也就是说，与日本的相比，本研究获得的癌症转基因模型由诱导型变成了自发型，发生的时间较之早。在该模型出生1年后，在颈部即出现明显的瘤(图5)，生长极其迅速。解剖后，在肺部肉眼可见多处肿瘤(图5-B，D)。

在有关ras基因的转基因动物模型研究中，在出生后两周即出现瘤状物的模型尚未见报道(奚涛等，2001)。经继续深入探索，有望实现：(1)获得一个可用于药物致癌性安全评价的动物模型。这是开展本研究的初衷，即替代传统的大小鼠，用于评价新药的致癌性、筛选抗癌药物、检测置入性医疗器械的致癌性等。用转基因动物模型替代传统的大小鼠致癌性实验可以大大缩短时间(6个月vs2年)、节省经费，减少动物的用量，符合国际上关于动物福利的“优化、替代、减少”3R原则要求。因此，本动物模型具有重要的实际应用价值。(2)本模型具有新的特性，可以作为一个新的癌症动物模型，用于癌症发生机理研究。主要表现在：本模型为自发型，而且发生时间比日本rasH2模型早，这暗示了本模型可能对于致癌物的反应比rasH2更为敏感，更适合用于癌症发生机理方面的研究。鉴于人类癌症发生的深层原因是“人体本身与环境因素长期相互作用的结果”，而一般情况下，人体接触类似大剂量强致癌物的几率很低，所以有理由相信，自发型模型得出的有关癌症机理的数据比诱发型更接近人体真实。(3)早期瘤状物的出现，意味着在用于致癌性实验时，比以前的同类模型更为敏感，这是最为重要的。

实施例5：转基因动物的交配与建系

采用如下方案交配建系：对于雌性首建鼠则与正常雄鼠交配，选择周龄在10周，具有交配经历、身体健壮的C57小鼠与之交配。同居，1周后开始检查妊娠情况，如果发现怀孕即将雌鼠单独饲养，直至生产。如果为雄性首建鼠，则选择8周以上，健壮的雌鼠与之交配。每一只首建鼠的后代单独标记，作为一个系对待。检测发现转基因能在后代中稳定遗传，每窝产仔数量与正常小鼠无异，一般能成功喂养，少有吃仔等母性不良现象。这些有利特性为下一步大规模繁殖建系打下了基础。

实施例6：转基因的突变检测

从转基因动物首建鼠、包括其子代的尾尖组织提取DNA，通过高保真PCR扩增转基因的部分片段。该片段长1853bp，包含c-Ha-ras基因的4个外显子，也既是包含了易发生突变的部位，即12，13和61位氨基酸。扩增的引物对为Pri.F4886：gctaagcttggcaggtggggcaggagaccctgtag和Pri.RN1735：gcgaattcctgcggtcagcagcctcccttgtgcc(EcoRI)。将PCR扩增所得片段经T-A克隆后测序，并通过DNAssist软件进行序列比对。结果显示这几个位点均未发生突变(图6)。

实施例7：转基因动物的生命周期

癌症转基因动物模型的生命周期较短，一般在6个月以上时出现自发肿瘤的几率上升，易死亡。本发明中，首建鼠的生命周期达到一年左右，且一般状态正常。

序列表

<110>中国药品生物制品检定所

<120>含有人源原癌基因c-Ha-ras的转基因小鼠的制作方法及其用途

<160>1

<170>PatentIn version3.4

<210>1

<211>6506

<212>DNA

<213>人

<400>1