可用作蛋白激酶抑制剂的吡唑并(1,5－A)(1,3,5)三嗪和吡唑并(1,5－A)嘧啶衍生物

摘要

例如可用作蛋白激酶抑制剂用于治疗癌症、神经障碍、自身免疫病和其他疾病的具有结构式(I)的基于嘧啶和基于三嗪的化合物，以及使用这些化合物的方法。

说明书

蛋白激酶抑制剂

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2006年9月18日提交的美国临时专利申请第60/845,314号和2007年9月17日提交的美国专利申请第11/856476号的优先权。

上述参考专利申请的内容以其全文纳入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及适合在治疗癌症、神经障碍、自身免疫病和其他疾病中用作蛋白激酶抑制剂的化合物以及使用该化合物的方法。

发明背景

内环境稳定要求细胞间信号转导以协调注入细胞增殖和分化等活动。不恰当的信号转导可导致或加剧免疫系统病理状态，如变态反应、自身免疫病和炎症，以及神经和心血管病。具体说，癌症(细胞不受控制地增殖)与正常细胞信号转导途径的断裂紧密相关。信号转导常常涉及磷酰基与蛋白质上的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基之间的催化转移作为信号转导的一部分，一个由称为蛋白激酶的酶催化的步骤。出于这个原因，治疗癌症和其他疾病的努力关注对蛋白激酶的抑制。

CK2，一种必需的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，直到最近才被认为是癌症化疗可能的靶点，但许多类型的癌症表现与肿瘤生长加剧有关的CK2活性水平的升高。而且，利用小分子、显性负相过度表达的激酶无活性突变体，反义方法或小干扰RNA降低CK2活性，可降低细胞增殖、增加癌细胞凋亡水平，根除荷瘤小鼠PC3人前列腺癌细胞。现有的C2抑制剂如大黄素、香豆素、TBB(三唑)、喹唑啉、DRB和槲皮素虽然可用于实验室研究，但缺乏临床适用化疗药的品质。

因此，仍然需要能够抑制CK2活性的化合物，用于治疗与该蛋白激酶催化的磷酰化有关的病理状态。

发明概述

本发明的一方面提供了一类基于大环吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪和吡唑并[1，5-a]嘧啶化合物的新的蛋白激酶抑制剂，使用它们、它们药学上可接受的前药、药学活性代谢物及其药学上可接受的盐的方法。这些化合物、前药、代谢物、多晶型物和药学上可接受的盐统称为“药剂”。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含有效量的药剂及一种或多种药学上可接受的载体。

因此，本发明药剂和含有该药剂的药物组合物可用于治疗各种疾病，包括但不限于与不受控制或不希望的细胞增殖有关的疾病，如癌症、自身免疫病、病毒疾病、真菌病、神经变性疾病和心血管病。

优选的药剂能够调节和/或抑制CK2蛋白激酶的活性。因此，含该药剂的药物组合物可用于治疗激酶活性介导的疾病，如癌症。

本发明一般涉及通式(I)的化合物，及其前药、药学活性代谢物、多晶型物和药学上可接受的盐：

式中，

R1是烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基。

R2是氢、烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基；

R3独立地是氢、任选取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或卤素；

(C)选自：任选取代的烷基、烯基和炔基，其中n＝2-6；

X是CH或N。

本发明还涉及治疗增殖性疾病，如癌症、自身免疫病、病毒疾病、真菌病、神经变性疾病和心血管病的方法，该方法包括给予需要这种治疗的对象有效量的本发明药剂。

本发明还涉及调节和/或抑制CK2蛋白激酶活性的方法，该方法包括给予通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、药学上可接受的前药、或该化合物或其代谢物药学上可接受的盐。

发明详述

除非另有说明，技术术语采取其常用涵义，具体是在第6版麦格劳-希尔科技术语词典(McGraw-Hill Dictionary of Scientific和Technical Terms)中规定的涵义。

“烷基”表示含有1-8个碳原子的直链或支链烃链，而“亚烷基”和“炔基”分别表示含有双键或三键的相应的链。烷基、亚烷基和炔基可任选地被一个或多个选自下组的取代基所取代：巯基、硝基、氰基、叠氮基和卤素。

“杂芳基”表示具有一个或多个独立地选自N、O或S的杂原子的5-和6元芳环。

在本发明优选的实施方式中，R1是芳基，优选取代的芳基，更优选取代的苯基。已发现，R1是N-烷基-N-烷基吡咯烷基-羰基-苯基(如，N-甲基-N-(1-甲基-吡咯烷基)-羰基)-苯基，如化合物11g)或N-烷基-N-烷基氨基烷基(如，N-甲基-N-乙基氨基乙基，如化合物11s)的化合物是尤其有用的。在某些优选的化合物中，R2和R3各自是氢，(C)是烷基，n＝4，和/或X是N。

通式(I)的嘧啶-(X＝C)和三嗪-基(X＝N)化合物是有用的，例如，用于影响蛋白激酶的活性。更具体说，该化合物可用作抗增殖药剂，从而提供对癌症或与蛋白激酶介导的细胞增殖有关的其他疾病的治疗。

本发明药剂可通过下面所示的合成方案制备。例如，通式(I)的三嗪-基化合物可根据方案1制备：

该化合物的合成从二氰基化合物(1)开始。用NaH处理，然后用甲酸乙酯处理，得到中间体2-甲酰基-二腈衍生物，用肼处理后环化形成4-取代的氨基吡唑(2)。然后，用乙氧基羰基异硫氰酸酯处理化合物(2)以形成硫脲中间体，硫脲中间体在碱性条件下自发环化形成化合物(3)。

化合物(3)苄基化然后氯化，得到相应的化合物(4)和(5)。然后，化合物(5)的氯化基团在温和条件下被伯胺取代，得到(6)。用mCPBA处理化合物(6)，苄基硫烷基氧化形成相应的苄基磺酰基(7)。然后，化合物(7)的活化的苄基磺酰基被苯二胺取代，形成化合物(8)。

用在甲醇中的氯化氢气体处理化合物(8)，得到化合物(9)，化合物(9)在碱性条件下水解得到化合物(10)。用偶联剂处理化合物(10)得到所需的大环化合物(11)。

以类似的方式，根据方案2制备通式(I)的嘧啶基(X＝CH)化合物：

方案2

先用氯代羰基乙酸乙酯处理4-取代的氨基吡唑(2)，得到二酰化中间体，然后在碱的存在下环化形成化合物(12)。二氯化形成化合物(13)，然后胺置换得到化合物(14和15)。化合物(15)用在甲醇中的氯化氢气体进行处理并在甲醇中回流，得到化合物(16)。碱水解得到化合物(17)，大环化形成最终产物(18)。

也可使用本发明化合物药学上可接受的盐和/或溶剂合物。这些盐包括：例如由盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、丙二酸和甲磺酸形成的盐。

某些化合物可包括手性中心，在这种情况下每个对映异构体以及相应的外消旋物包括在本发明范围内。

本发明还涉及包括本发明化合物的药物制剂而无论指定的给药模式。

本发明化合物的治疗剂量不难通过本领域公知的方法进行确定。

实施例

在下面描述的实施例中，除非另有说明，所有份数和百分比是重量份数和重量百分比。反应试剂购自例如阿尔得里奇化学公司(Aldrich ChemicalCompany)或兰开斯特合成公司(Lancaster Synthesis)的市场供应商，除非另有说明，无需进一步纯化即可使用。

下述反应通常在氮气正压或干燥试管中，在环境温度(除非另有说明)，无水溶剂中进行，反应烧瓶配有橡胶隔片，用于经注射器引入底物和反应试剂。反应通过TLC，HPLC，LC/MS或NMR进行分析，通过原料的消耗判断反应终止。

实施例1

5-(5-氨基-1H-吡唑-4-基)-戊烷腈(2)

向1，5-二氰基戊烷(1)(6.5毫升，50毫摩尔)和甲酸乙酯(20毫升，250毫摩尔)的无水乙醚(200毫升)溶液中加入氢化钠(60％，4克，100毫摩尔)。将该反应混合物回流4小时，冷却至室温，过滤，用醚淋洗，并干燥。向上述所得白色固体在80％乙醇/水中的溶液中加入盐酸肼(6.29克，61毫摩尔)。用浓盐酸将反应混合物调节至pH3，然后回流2小时，冷却至室温，用NaHCO₃中和。减压去除溶剂，残余物真空干燥。将残余物悬浮在乙醇中，过滤。浓缩滤出液，溶解在5％ MeOH/CH₂Cl₂中，通过硅胶短柱过滤，用5％MeOH/CH₂Cl₂淋洗，浓缩得到油状5-(5-氨基-1H-吡唑-4-基)-戊烷腈2。LCMS(API-ES)m/z：164.2，165.1[M+H+]；163.1[M-H+]。

实施例2

5-(4-羟基-2-巯基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基)-戊烷腈(3)

环境温度下，搅拌的同时向化合物(2)(4.6克，14毫摩尔)的EtOAc(50毫升)溶液中逐滴加入乙氧基羰基异硫氰酸酯(1.69毫升，15毫摩尔)。将该反应混合物回流2小时，冷却至室温。加入氢氧化铵(10毫升)并将反应混合物在室温下搅拌20小时。反应混合物用1M NaOH萃取两次，合并水性萃取液，用浓盐酸酸化，用EtOAc萃取两次。合并的有机萃取物用无水Na₂SO₄干燥，浓缩得到白色固体5-(4-羟基-2-巯基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基)-戊烷腈(3)(2.5克，67％)。

LCMS(API-ES)m/z：249.3，249.9[M+H+]；247.9[M-H+]。

实施例3

5-(2-苄基硫烷基-4-羟基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基)-戊烷腈(4)

将化合物(3)(5.3克，21，3毫摩尔)的N-甲基吡咯烷酮(30毫升)溶液真空脱气5分钟。加入苄基溴(2.28毫升，19.1毫摩尔)和DIEA(4.4毫升，25毫摩尔)，室温下将反应混合物真空搅拌30分钟。减压去除溶剂，残余物用EtOAc稀释。乙酸酯溶液用1M HCl洗涤，然后用盐水洗涤。有机萃取物在无水Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。残余物在己烷、醚和EtOAc的混合溶剂中研磨，过滤，得到固体5-(2-苄基硫烷基-4-羟基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基)-戊烷腈(4)(6.0克，93％)。

LCMS(API-ES)m/z：339.4，340.0[M+H+]；338.0[M-H+]。

实施例4

5-(2-苄基硫烷基-4-氯-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基)-戊烷腈(5)

将化合物(4)(6.0克，17.7毫摩尔)和N，N-二甲基苯胺(2.24毫升，17.7毫摩尔)的磷酰氯(20毫升)溶液在密闭试管中加热回流1小时。去除溶剂，残余物溶解在EtOAc(200毫升)中，用饱和NaHCO₃水溶液，稀HCl，然后用盐水洗涤，在无水Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩，得到5-(2-苄基硫烷基-4-氯-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基)-戊烷腈(5)，可直接用于下一步骤。

LCMS(API-ES)m/z：357.8.358.0.360.0[M+H+]。

实施例5

5-(2-苄基硫烷基-4-环丙基氨基-吡唑并-1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基)-戊烷腈(6A)

环境温度下将化合物(5)和环丙胺(1.2克，17.7毫摩尔)的无水乙醇(10毫升)溶液搅拌0.5小时。然后将混合物用EtOAc(200毫升)稀释，用饱和NaHCO₃水溶液和盐水洗涤，并在无水Na₂SO₄上干燥。去除溶剂后得到5-(2-苄基硫烷基-4-环丙基氨基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基)-戊烷腈(6)(4.3克，两步产率65％)。

LCMS(API-ES)m/z：378：379[M+H+]。

实施例6

5-(4-环丙基氨基-2-苯基甲磺酰基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基)-戊烷腈(7A)

向化合物(6a)(3.78克，10毫摩尔)的CH₂Cl₂((200毫升)溶液中加入mCPBA(5.5克，22毫摩尔，77％)。将该反应混合物搅拌2小时并过滤。滤液用饱和NaHCO₃洗涤，然后用盐水洗涤，在无水Na₂SO₄上干燥。去除溶剂，得到固体5-(4-环丙基氨基-2-苯基甲磺酰基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基)-戊烷腈7a(3.5克，85％)。

LCMS(API-ES)m/z：410.15.411.0[M+H+]；409.0[M-H+]。

实施例7

5-[2-(3-氨基-苯基氨基)-4-环丙基氨基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基]-戊烷腈(8A)

将化合物(7a)(0.41克，1毫摩尔)和苯-1，3-二胺(2.16克，20毫摩尔)在50毫升AcOH中的混合液在70℃加热2小时。然后将混合液浓缩，残余物用NaHCO₃中和并用EtOAc萃取。然后，乙酸酯溶液用柠檬酸(10％)洗涤，再用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，浓缩，得到稠厚油状3-[2-(3-氨基-苯基氨基)-8-(4-氰基-丁基)-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基氨基]-苯甲酸乙酯(8)(0.22克，60％)。

LCMS(API-ES)m/z：362.2.363.0[M+H+]；361.0[M-H+]。

实施例8

5-[2-(3-氨基-苯基氨基)-4-环丙基氨基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基]-戊酸甲酯(9A)

0℃下，向化合物(8a)(0.18克，0.5毫摩尔)的30毫升MeOH溶液中通入氯化氢气体5分钟。将该反应混合物密封并在室温下搅拌20小时。得到酯和亚胺的混合物，然后回流2小时，排他性地得到甲基酯。然后将该混合物浓缩，残余物溶解在EtOAc中，用NaHCO₃、再用盐水洗涤。有机萃取物经干燥、浓缩、快速色谱(CH₂Cl₂(/EtOAc 2:1)纯化，得到5-[2-(3-氨基-苯基氨基)-4-环丙基氨基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基]-戊酸甲酯9a(0.13克，65％)。LCMS(API-ES)m/z：395.2.396.0[M+H+]；394.0[M-H+]。

实施例9

5-[2-(3-氨基-苯基氨基)-4-环丙基氨基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基]-戊酸(10A)

向化合物(9a)(0.12克，0.3毫摩尔)的10毫升MeOH和0.5毫升H₂O的溶液中加入NaOH(40毫克，1毫摩尔)。将反应混合物回流1小时，浓缩以去除MeOH。用盐酸将反应溶液调节至pH4，过滤收集固体，用水洗涤，在P₂O₅上真空干燥，得到5-[2-(3-氨基-苯基氨基)-4-环丙基氨基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-8-基]-戊酸(10a)(0.1克，90％)。

LCMS(API-ES)m/z：381.2，382.0[M+H+]；380.0[M-H+]。

实施例10

(11，14)3，5-N-{环丙基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮(11A)

将化合物(10a)(0.1克，0.25毫摩尔)和HATU(0.12克，0.3毫摩尔)在5％DIEA/NMP(1毫升)中的溶液在室温下搅拌30分钟。由制备型RP-HPLC得到(11.14)3，5-N-{环丙基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮(11a)(0.05克，55％)。

LCMS(API-ES)m/z：363.1，364.0[M+H+]；362.0[M-H+]。

以类似于实施例1-10所述的方式，合成并纯化具有以下通式的化合物。

实施例11

(11，14)3，5N-{[{N-甲基-N-(1-甲基-吡咯烷-3-基)-羰基}-苯-3-基]-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮(11G)

方案4

以类似于实施例8所述的方式得到1，3-[2-(3-氨基-苯基氨基)-8-(4-甲氧基羰基-丁基)-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基氨基]-苯甲酸甲酯(9b)。

LCMS(API-ES)m/z：489.5.490.1[M+H+]；488.0[M-H+]。

实施例12

3-[2-(3-氨基-苯基氨基)-8-(4-羧基-丁基)-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基氨基]-苯甲酸(10B)

向化合物(9b)(1.5克，3.06毫摩尔)在50毫升MeOH和5毫升H₂O中的溶液中加入NaOH(400毫克，10毫摩尔)。将该反应混合物回流1小时并浓缩。加入浓盐酸以酸化溶液。过滤收集固体，用水洗涤，在P₂O₅上真空干燥，得到1，3-[2-(3-氨基-苯基氨基)-8-(4-甲氧基羰基-丁基)-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基氨基]-苯甲酸甲酯(13a)(1.3克，93％)。

LCMS(API-ES)m/z：461.4.462.0[M+H+]；460.1[M-H+]。

实施例13

(11，14)3，5N-{[{N-甲基-N-(1-甲基-吡咯烷-3-基)-羰基}-苯-3-基]-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮(11G)

向化合物(10b)(300毫克，0.6毫摩尔)、DIEA(0.45毫升)在60毫升NMP中的混合物中加入HATU(410毫克，1.08毫摩尔)。将该反应混合物超声处理5分钟，然后在室温下静置0.5小时。加入甲基-(1-甲基-吡咯烷-3-基)-胺(0.117毫升，0.9毫摩尔)，再加入额外的HATU(228毫克，0.6毫摩尔)。在室温下搅拌该反应混合物0.5小时。粗产物通过制备型RP-HPLC纯化，得到(11，14)3，5N-{[{N-甲基-N-(1-甲基吡咯烷-3-基)-羰基}-苯-3-基]-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮(11g)(210毫克，57％)。LCMS(API-ES)m/z：539.6.540.2[M+H+]；538.1[M-H+]。

以类似于上述实施例所述的方式，合成并纯化具有以下通式的化合物。

实施例14

(11，14)3，5N-{[(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-羰基)-苯-3-基]-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2.4-基-二氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-6-酮(18A)

实施例15

5-(5，7-二羟基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)-戊烷腈(12A)

在冰水浴中，搅拌的同时向5-(5-氨基-1H-吡唑-4-基)-戊烷腈(2a)(1克，6.09毫摩尔)在20毫升EtOAc中的溶液中逐滴加入3-氯-3-氧代丙酸乙酯(2.34毫升，18.27毫摩尔)，然后加入TEA(3.08毫升，30.45毫摩尔)。将该反应混合物在室温下搅拌2小时。反应混合物用EtOAc稀释，用10％HCl水溶液、饱和NaHCO₃和盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并浓缩。

将上述残余物的MeOH(10毫升)和TEA(2毫升)溶液回流2小时，浓缩，真空干燥，得到5-(5，7-二羟基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)-戊烷腈(15)，无需进一步纯化即可用于下一步骤(1.56克)。

LCMS(API-ES)m/z：232.2.233.0[M+H+]；231.0[M-H+]。

实施例16

5-(5，7-二氯-吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)-戊烷腈(13A)

将化合物(12a)(1.56克，6.74毫摩尔)和N，N-二甲基苯胺(854微升，6.74毫摩尔)在磷酰氯(25毫升)中的混合物在密闭试管中加热回流4小时，然后浓缩。残余物溶解在EtOAc(50毫升)中，用饱和NaHCO₃水溶液、10％HCl和盐水洗涤，在无水Na₂SO₄上干燥。去除溶剂，得到5-(5，7-二氯-吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)-戊烷腈(13a)(1.24克，69％)。LCMS(API-ES)m/z：269.1，269.0.271.0[M+H+]。

实施例17

3-[5-氯-3-(4-氰基-丁基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基氨基]-苯甲酸乙酯(14A)

向化合物(13a)(1.24克，4.62毫摩尔)在10毫升乙醇中的溶液中加入3-氨基苯甲酸乙酯(764毫克，4.62毫摩尔)。将该反应混合物在50℃加热2小时，然后冷却至室温。去除溶剂，残余物溶解在EtOAc(50毫升)中，用饱和NaHCO₃水溶液、10％HCl和盐水洗涤，在无水Na₂SO₄上干燥。去除溶剂，得到残余物，用EtOAc/己烷(25％-50％)进行快速柱色谱纯化，得到3-[5-氯-3-(4-氰基-丁基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基氨基]-苯甲酸乙酯(14a)(1.0克，50％)。

LCMS(API-ES)m/z：397.8.398.0.400.0[M+H+]；395.9.398.0[M-H+]。

实施例18

3-[5-(3-氨基-苯基氨基)-3-(4-氰基-丁基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基氨基]-苯甲酸乙酯(15A)

将化合物(14a)(0.63克，1.6毫摩尔)和苯-1，3-二胺(69毫克，0.636毫摩尔)在2毫升NMP中的混合物在160℃加热过夜。反应混合物用EtOAc(50毫升)稀释，用饱和NaHCO₃水溶液和盐水洗涤，在无水Na₂SO₄上干燥。HPLC纯化后得到3-[5-(3-氨基-苯基氨基)-3-(4-氰基-丁基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基氨基]-苯甲酸乙酯(15a)(0.37克，50％)。

LCMS(API-ES)m/z：469.5，470.1[M+H+]；468.0[M-H+]。

实施例19

3-[5-(3-氨基-苯基氨基)-3-(4-甲氧基羰基-丁基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基氨基]-苯甲酸甲酯(16A)

0℃，在化合物(15a)(0.24克，0.5毫摩尔)的5毫升MeOH溶液中通入氯化氢气体5分钟。将反应混合物密封并在室温下搅拌1小时，浓缩，残余物溶解在EtOAc中，用NaHCO₃、盐水和水洗涤。有机萃取物干燥，浓缩，得到3-[5-(3-氨基-苯基氨基)-3-(4-甲氧基羰基-丁基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基氨基]-苯甲酸甲酯(16a)(102.1毫克)。

LCMS(API-ES)m/z：488.5，489.1[M[+H+]；487.0[M-H+]。

实施例20

3-[5-(3-氨基-苯基氨基)-3-(4-羧基-丁基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基氨基]-苯甲酸(17A)

向化合物(16a)(102.1毫克，0.203毫摩尔)的5毫升MeOH溶液中加入1MNaOH(0.41毫升，0.407毫摩尔)。将该反应混合物回流1小时并浓缩。HPLC纯化后得到3-[5-(3-氨基-苯基氨基)-3-(4-羧基-丁基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基氨基]-苯甲酸(17a)(50毫克)。

LCMS(API-ES)m/z：460.5.461.1[M+H+]；459.0[M-H+]。

实施例21

(11，14)3，5N-{[(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-羰基)-苯-3-基]-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2，4-基-二氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-6-酮(18A)

向化合物(17a)(35毫克，0.075毫摩尔)、DIEA(50微升)在1毫升NMP中的混合液中加入HATU(50毫克，0.12毫摩尔)。将该反应混合物超声处理2分钟，室温下静置0.5小时。然后，加入二甲基-吡咯烷-3-基-胺(15微升，0.1毫摩尔)，再加入额外的HATU(5毫克，0.12毫摩尔)。在室温下搅拌该反应混合物0.5小时。制备型RP-HPLC纯化后得到(11，14)3，5N-{[(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-羰基)-苯-3-基]吡唑并[1，5-a]嘧啶-2，4-基-二氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-6-酮(18a)(15毫克)。

LCMS(API-ES)m/z：538.6，539.2[M+H+]；537.0[M-H+]。

以类似的方式，合成并纯化以下化合物。

实施例22

CK2蛋白激酶抑制实验：

利用分光光度计测量PK/LDH偶联试验检测ATP周转来确定CK2蛋白激酶活性。使全长His-标记的人CK2在大肠杆菌表达系统中克隆、表达和纯化。CK2磷酰化的肽底物是RRRDDDSDDD(基因脚本公司(GenscriptCorporation)，美国新泽西州皮斯卡塔韦)。典型的CK2酶试验包含约20nM人CK2、100μM肽底物、50mM Tris-HCl pH8.0、100mM NaCl、10mMMgCl₂、200μM EDTA、5mM2-巯基乙醇、1mM磷酸烯醇丙酮酸、150μMNADH、0.5％ PK/LDH混合物(西格玛(Sigma)#P-0294)、2.5％ DMSO和50μM ATP。将抑制剂化合物悬浮在100％ DMSO中，在DMSO比例恒定为2.5体积％的情况下抑制剂的加入量可实现各种浓度。在加入ATP启动磷酰化反应之前，将CK2酶与抑制剂和其他试验组分预先温育5分钟。通过340nm处紫外/可见吸收度的变化连续监控反应进程。将反应速率与抑制剂浓度作图，假设竞争抑制并采用Km值为10μM来拟合Ki值。在非常强效结合的情况下，采用紧密结合方法来测定Ki。结果记录在表1和2中。

实施例23

细胞生长的抑制

将HCT-116和PC-3细胞分别在37℃、5％ CO2，含10％胎牛血清的McCoy’s 5A改良培养液和F-12K培养液中进行培养。细胞以每孔2,000-4,000个细胞的密度接种到96孔板中，体积为100微升培养液。培养过夜后，每孔中再加入50微升含各种量CK2抑制剂的培养液，在1％二甲亚砜中得到0.01-20μM的最终抑制剂浓度。对照孔仅在其培养液中含有1％二甲亚砜。再培育3-5天以使细胞生长，在对照细胞达到融合之前，加入15微升/孔MTT试剂(5毫克/毫升)并温育4小时。温育后，去除培养液，新产生的甲用二甲亚砜(100微升/孔)溶解并在540nm处测量。将吸收数据拟合成方程式，利用KaleidaGraph(协调软件公司(Synergy Software))程序计算IC₅₀值。IC₅₀的拟合方程式是y＝a+b/(1+(x/IC₅₀))；x是化合物浓度，a是540nm处的背景吸收，b是化合物浓度为零时的吸收。结果记录在表1和2中。

表1：三嗪基化合物。

 

化合物名称K_i(μM)IC₅₀HCT 116细胞(μM)IC₅₀PC-3(μM)11a(11，14)3，5N-{环丙基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1<111b(11，14)3，5N-{异丙基-吡唑并[1，5-a][1，3.5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮11c(11，14)3，5N-{正丙基-吡唑并[1.5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮

 

化合物名称K_i(μM)IC₅₀HCT 116细胞(μM)IC₅₀PC-3(μM)11d(11，14)3，5N-{吡啶-3-基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1<111e(11，14)3，5N-{(3-乙氧基苯基)-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1<111f(11，14)3，5N-{(3-乙氧基羰基苯基)-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮11g(11，14)3，5N-{3-(3-{[甲基(1-甲基吡咯烷-3-基)氨基]羰基}苯基)-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1<111h(11，14)3，5N-{3-(4-甲基哌嗪-1-基羰基)苯基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1<111i(11，14)3，5N-{[3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基]羰基}苯基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1<111j(11，14)3，5N-{4-[(3-{3-(二乙基氨基)羰基}苯基)氨基]-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1<111k(11，14)3，5N-{4-{[3-({[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}羰基)苯基]氨基}-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1<1

 

化合物名称K_i(μM)IC₅₀HCT 116细胞(μM)IC₅₀PC-3(μM)111(11，14)3，5N-{4-({3-[(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)羰基]苯基}氨基)-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1<111m(11，14)3，5N-{[(1-甲基氮杂环丁烷-3-基)氨基]羰基}苯基)氨基]-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1<111n(11，14)3，5N-{4-[(3-{[[2-(二甲基氨基)乙基](甲基)氨基]羰基}苯基)氨基]-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1<111o(11，14)3，5N-{4-[(3-{[甲基(1-甲基哌啶-4-基)氨基]羰基}苯基)氨基]-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<111p(11，14)3，5N-{[(3-{[3-(二乙基氨基)吡咯烷-1-基]羰基}苯基)-氨基]-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1<111q(11，14)3，5N-{[(3-{[3-(二乙基氨基)氮杂环丁烷-1-基]羰基}-苯基)-氨基]-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1<111r(11，14)3，5N-{{[3-(哌嗪-1-基羰基)苯基]氨基}-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1

 

化合物名称K_i(μM)IC₅₀HCT 116细胞(μM)IC₅₀PC-3(μM)11s(11，14)3，5N-{4-[(3-{[2-(二乙基氨基)乙基](甲基)-氨基]-羰基}苯基)氨基]-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基-氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-8-酮<0.1<1

表2：嘧啶基化合物

 

化合物名称K_i(μM)IC₅₀HCT 116细胞(μM)IC₅₀PC-3(μM)18a(11，14)3，5N-{[(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-羰基)-苯-3-基]-吡唑并-[1，5-a]-嘧啶-2，4-基-二氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-6-酮<0.1<3<318b(11，14)3，5N-{[(3-环丙基]-吡唑并-[1，5-a]-嘧啶-2，4-基-二氨基}-(2N，4N)-苯基-1，5-二氮杂-环十四烷-6-酮<0.1<3<3

上面的实施例阐述了通式(I)的化合物以及容易进行以确定其抗CK2蛋白激酶的活性水平的试验。应理解，这些试验及本领域已知的其他合适的试验可用于选择针对选定靶点具有所需活性水平的抑制剂。

虽然参考具体和优选的实施方式描述了本发明，但本领域技术人员应理解可通过常规实验和本发明的实践进行改变和改进。