利用人类皮肤黑色素细胞分析美白剂毒性和功效的方法

摘要

一种利用原代培养的人皮肤黑色素细胞对美白化学物质进行毒性和功效分析的实验方法：1.原代人皮肤黑色素细胞培养鉴定；2.利用原代人黑色素细胞对美白化学物质进行毒性分析；3.利用原代人黑色素细胞对美白化学物质的功效，即黑色素含量和酪氨酸酶活性两方面进行分析。本方法具有以下优点：体外培养的人黑色素细胞分裂增殖能力强、标准化程度高、批间差异小，具有与体内相同的产生黑色素颗粒的功能；利用健康人黑色素细胞比动物或人源的黑色素瘤细胞获得的结果更可信；从定性和定量两方面评价待测物质的毒性作用和美白功效。本发明建立的方法可以代替活体动物和人类皮肤，直接用于化学品、化妆品、药品等产品中美白物质的毒性和功效试验。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用原代培养的人类皮肤黑色素细胞对美白剂进行毒性分析和功效分析的方法，可以替代活体动物(或人体)皮肤及瘤性黑色素细胞，应用于美白化学原料或含美白剂的化妆品配方的毒理学和功效学实验领域。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，是外源化学因素(化学品、药品、化妆品等)或物理机械因素(紫外线、微波等)毒性作用的主要器官。利用动物或人体皮肤进行皮肤毒性测试和功效测试是化妆品、药品、食品添加剂及原料、农药、生物制品、化学品健康安全评价的常规检测项目。传统的皮肤安全性评价实验不仅要求一定数量和高质量的实验动物，而且试验周期长，成本高，某些反应会给动物造成极大的痛苦。世界各国非常重视实验动物的福利问题，如上世纪欧洲各国、美国颁布的动物福利法，中国的《实验动物管理条例》等。随着国际动物保护和动物福利运动的兴起，40多年前国外最先提出了以″减少(reduce)″、″替代(replace)″和″优化(refine)″为核心内容的“3R原则”，并在此基础上大力开展动物实验替代方法的研究。特别是近20年，不再以动物模式为基础的毒理学系统已被科学家采用，并被许多国家的政府、欧洲和国际法规所接受。2002年11月7日欧洲议会与欧盟理事会在布鲁塞尔达成协议，决定“从2009年3月11日起在欧盟范围内禁止使用动物进行化妆品毒性和过敏实验”，也“不允许成员国从外国进口和销售进行动物实验的化妆品”。欧盟新化学品法规REACH(化学品的注册、评估、许可和限制)也提出鼓励动物试验替代方法的开发和应用。采用体外培养的细胞或构建的组织工程器官进行毒性评价和功能性评价是动物试验替代技术的关键领域之一。

表皮和真皮交界处的黑色素细胞是皮肤中的黑色素颗粒的产生部位，在外界各种刺激(如UV，化学物，超氧化物等)和体内一些激素、代谢产物(如促黑色素分泌激素，碱性成纤维细胞生长因子，内皮素等)作用下，黑色素颗粒分泌增加，经过与表皮基底部的角质形成细胞的突触连接，将生成的黑色素颗粒传递到角质形成细胞中发挥其生物学效应。大约一个黑色素细胞和其周围的40个角质形成细胞形成一个这样的功能单位，称之为表皮黑色单位。正常的黑色颗粒的形成对于皮肤抗紫外，抗氧化具有着积极的作用。但是在一些病理情况(如过敏性皮炎，日光性皮炎，炎症，黑斑病等)下出现的黑色素过度表达，则对患者的精神和身体都产生很大的影响。所以对抗这种黑色素过度表达的美白剂常用于化妆品、药品中。另一方面，各种功能性的化妆品日益成为人们日常生活中的必需生活品，在满足消费者改善肤质愿望的过程中，也给消费者带来了精神上的愉悦。越来越多的来源于合成化工产品、天然动植物提取物、生物活性因子等被开发利用为美白物质，同时，也应注意到各种具有美白功效的化学物质的广泛使用可能给消费者带来一定程度的潜在健康风险，而建立一种既安全、高效又人道(既替代动物实验)的毒性和功效的评估方法则是我们此发明中所解决的问题。

目前的美白物质毒性与功效评价主要采用活体动物试验或体内人体志愿者试用试验，体外方法主要利用人源或啮齿类(大鼠、小鼠)动物的黑色素瘤细胞试用试验。但现有的体外方法有其不足之处：通常黑色素表达不够稳定，而且肿瘤的或动物的细胞与正常的人体细胞形态和基因都存在一定差异。

开发含黑色素细胞的组织工程化皮肤是进行美白毒性和功效评价的另一途径，如2003年，Yoon T.J.等将分离培养的原代黑色素细胞加到组织工程化皮肤中，构建含黑色素细胞的人工皮肤(Yoon T.J.，Lei T.C.，Yamaguchi Y.，Batzer J.，Wolber R.，Hearing V.J.，Anal.Biochem.，318，260—269(2003))，但这种含黑色素细胞的工程化皮肤还不成熟，而且造价昂贵且培养不易。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题，就是提供一种成熟的利用人类黑色素细胞对美白剂进行毒性和功效分析的实验方法，因为细胞来源于人类，故实验结果能真实地反映人类皮肤组织中的黑色素细胞对受测试物质的反应效果，因而能满足化妆品领域对美白剂毒性和功效实验的研究。

在上述基础上，本发明还涉及实验中所用的人类黑色素细胞的培养技术，该培养技术成熟，培养容易周期短，重复性好，而且价格低廉。

本发明原代人类黑色素细胞的培养技术主要分以下几个步骤：

I、人类皮肤原代黑色素细胞的培养

(1)人类皮肤黑色素细胞培养液的配置

1)配制人类黑色素细胞培养液：

A.完全培养液：将角质细胞无血清培养液K-SFM(Keratinocyte Serum-FreeMedium)与胎牛血清按体积比9∶1混合，并添加以下辅助因子：氢化可的松(Hydrocortisone)，其终浓度为0.4ug/ML；牛胰岛素(insuilin)，其终浓度为10ug/ML；L-谷氨酰胺(L-glutamine)，其终浓度为6mmol；12-o-十四烷酰佛波醋酸酯-13(简写TPA，英文名12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)，其终浓度为81.06nmol/L；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(简写为IBMX，即3-isobutyl-l-methylxanthine)，其终浓度为0.1nmol/L；转铁蛋白(transferrin)，其终浓度为10ug/ML；霍乱毒素(cholera toxin，CT)，其终浓度为10ng/ML；碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和表皮生长因子(EGF)，两者的终浓度均为10ng/ML；

B.基础培养液：K-SFM与10％胎牛血清按体积比9∶1混合，仅添加终浓度为6mmol的L-谷氨酰胺和终浓度为10ug/ML的胰岛素；

2)细胞培养瓶的包被：将每毫升含50微克的胶原蛋白的IV型胶原包被液2-3ml加入一个新的25ml塑料培养瓶中，使包被液覆盖在培养瓶的底部，过夜或室温孵育2-3小时，将包被液吸出之后，或是将塑料培养瓶在室温下放置约2-3小时晾干，或是将已经包被好的培养瓶放在4℃保存备用；

(2)人类原代黑色素细胞的分离与培养

1)将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.01mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2-3次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织；将清洗干净的包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；将皮片展开，表皮朝向上方浸泡于质量浓度0.25％的裂解酶(Dispases II)中分离表皮和真皮，方式有37℃消化2±0.5小时或是4℃过夜12-18小时；

2)将分离的皮片从裂解酶(Dispases II)中取出，用镊子轻轻将表皮和真皮分离，将表皮收集在含有双抗(100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素)的0.01mol/L的PBS中；将表皮用此PBS液彻底清洗2-3次，用已经灭菌的眼科手术剪彻底将表皮组织剪碎，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA彻底消化真皮，并用吸头反复吹打3分钟；加入血清中止消化，将所得的表皮细胞混悬液通过100目的滤器过滤，去除未消化分离的组织细胞；将得到的细胞悬液离心，室温下1200rpm/min，5分钟，得到的沉淀即为多种表皮细胞(黑色素细胞，表皮干细胞，角质形成细胞，以及少量的成纤维细胞)；用K-SFM培养液清洗一次细胞后，将其用已经配置好的黑色素细胞培养液按照1×10⁵cell/cm²—2×10⁵cell/cm²重悬细胞，并将其接种到已经用collageIV包被好的细胞培养瓶中；隔天换一次培养液，大约10-14天，黑色素细胞即可长满培养瓶；

(3)人类黑色素细胞的鉴定

采用以下(3)2)-4)所述的三种方法中的一种或同时采用2-3种进行黑色素细胞鉴定：

1)制备细胞爬片：将培养的原代人类黑色素细胞按照4×10⁴cell/cm²密度接种于放置盖玻片的六孔板中，24小时后贴壁生长到70％时终止培养，制备爬片；

2)L-DOPA染色鉴定：将上步所得细胞爬片经4℃ PBS洗2次，5％甲醛固定30min，加入0.2％L-dopa，37℃染色5小时，结束染色后用PBS洗3次，10％甲醛后固定20min，甘油封片后在显微镜下观察，黑色素细胞中含有大量被L-dopa染色的黑色素颗粒；

3)人类黑色素细胞特异性抗体MART-1免疫荧光染色：将(3)中1)步所得细胞爬片，4℃ PBS洗2次，4％多聚甲醛固定30min，4℃ PBS洗3次，每次5分钟，用正常山羊血清封闭30min，加一抗(MART-1用PBS按照1：100-1：200倍稀释)，4度冰箱保湿过夜；4℃ PBS洗3次，每次5分钟，加入二抗(德克萨斯红，用PBS按照1：200稀释)，室温保湿避光孵育1小时；0.1％ DAPI染液复染细胞核，室温避光孵育10min，PBS洗3次，每次5分钟，缓冲甘油封片，在绿光激发下，相差荧光显微镜观察可见黑色素细胞呈强烈红色荧光；

3)电镜照片：按常规方法收集细胞，制备扫描电镜照片，观察到细胞中大量黑色素颗粒。

本发明解决的第一个技术问题主要分以下几个步骤：

I利用(包括以上所得的)人类黑色素细胞对美白剂的毒性进行分析；

(1).美白剂贮备溶液的配制：

PEP液的配置：将2-丙二醇、无水乙醇和无菌双蒸水按照5：3：2配置：

PEH液的配置：将PEP液用0.01mol/L的PBS稀释10倍配置；

以曲酸(kojic acid)和熊果苷(arbutin)作为美白剂毒性试验的对照参考标准品，曲酸、熊果苷和待测化学物质用PEH液溶解(一般使用的贮备液浓度为1mg/ml)，并用0.22um滤器过滤除菌，分装，-20度保存；

(2)按步骤I所述方法制备黑色素细胞，将生长至80％-90％融合的人类黑色素细胞用0.25％胰酶/0.02％ EDTA消化，1200rpm/min，5min离心，得到的细胞沉淀，用黑色素细胞完全培养液制成悬液，1×10⁴cell/孔的密度(每孔100ul)接种于96孔板，37度，5％的CO₂培养箱中培养2天；

(3)用黑色素细胞完全培养液将待测化学物质溶解至不同的待测浓度，将96孔板中原来的培养液移走，加入新鲜的含有待测美白剂的培养液液(每孔200ul，180ul基础培养液，20ul含药物的PEH液)，同时设立阳性对照孔(有细胞，加入药物为SDS)，阴性对照孔(有细胞，不加药物，仅20ulPEH液)和空白孔(无细胞，不加药物，仅20ul的PEH液)，37度，5％的CO₂培养箱中培养3天；

(4)加入MTT溶液和DMSO溶液：在每孔中加入已经配置好的5mg/ml的MTT溶液20ul，在37度孵化4小时，移走上清液，每孔中加入DMSO 150ul，37度孵化30min，充分混匀后用酶标仪在570nm处测量每孔的吸光度；

(5)结果的分析：细胞活力抑制率＝[1—(各浓度平均吸光度值—空白孔平均吸光度值)÷(对照组平均吸光度值—空白孔平均吸光度值)]×100％；根据抑制率曲线，计算得出待测药物的致死剂量范围以及半数致死剂量(IC50)，即为该美白剂的毒性指标；

II、利用人类黑色素细胞对美白物质进行功效分析

该美白剂对黑色素细胞的功效实验采用两种方法：

(1)黑色素细胞黑色素含量的改变

1)按步骤I(1)用PEH液将待测物质溶解成不同浓度的溶液，用黑色素细胞基础培养液(K-SFM，10％胎牛血清，L-谷氨酰胺，胰岛素)溶解至待测的终浓度，以质量浓度为20umol/L的α-MSH作为美白功效实验的阳性对照；

2)原代黑色素细胞的制备：按上述培养制备黑色素细胞，按密度1×10⁵cell/孔接种于6孔板；

3)待测化学物质干预：将6孔板中原来的培养液移走，每孔加入1000ul含待测化学物质的培养液(900ul基础培养液+100ul含待测化学物质的PEH液)，同时设立阳性对照孔(有细胞，加入药物为α-MSH)，阴性对照孔(有细胞，不加药物，仅100ulPEH液)，37度，5％的CO₂培养箱中培养6天，每隔两天换液一次；

4)收集药物处理以后的细胞：移走培养液，用冷的PBS清洗两遍，用细胞刮刀将不同细胞处理组以及阳性、阴性对照组的细胞分别收集到不同的EP管中，10000rpm/min，4度离心1min收集细胞；

5)裂解细胞，释放黑色素颗粒：收集后的细胞用1N NaOH溶液150ul溶解，并在100度下加热10min，将获得的每种溶有各组处理后细胞的1N NaOH溶液100ul加入到96孔中；

6)每孔细胞蛋白浓度的分析：在96孔板中每孔加入99ul protein assay和1ul 1N NaOH溶解的细胞溶液，每孔细胞设立三个测试组；

7)酶标仪测量及结果分析：用酶标仪在405nm处测量步骤(5)加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的黑色素含量的吸光度值；用酶标仪在490nm处测量步骤(6)加入96孔板中各孔的吸光度，得到每孔的蛋白浓度吸光度值；

黑素合成抑制率＝[1-(药物孔黑色素含量的吸光度值÷药物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照组黑色素含量的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％；

(2)黑色素细胞酪氨酸酶活性的改变

1)同步骤III(1)1)-4)；

5)裂解细胞，释放黑色素颗粒：收集后的细胞用细胞裂解液(lysis buffer)(0.1M磷酸盐缓冲液，含有质量百分比1％的Triton-X-100和100ug/ml的苯甲基磺酰氟)150ul溶解，用声裂法充分裂解(操作均在冰上进行)，充分裂解后，13000rpm/min，4度离心20min；得到的上清液即含酪氨酸酶的胞质蛋白；

6)每孔细胞蛋白浓度的分析：在96孔板中每孔加入98ul protein assay和2ul细胞裂解液溶解的胞质蛋白，每孔细胞设立三个测试组；用酶标仪在490nm处测量各孔的蛋白浓度的吸光度值；

7)酪氨酸酶活性试验：在96孔板中每孔加入90ul各孔含胞质蛋白的细胞裂解液，10ul 2mg/ml的L-DOPA溶液，对照组为90ul不含蛋白的细胞裂解液和10ul 2mg/ml的L-DOPA溶液，因为无色的L-DOPA在胞质蛋白中所含的酪氨酸酶的作用下会变成黑色的多巴醌，而在无酪氨酸酶的作用下，无色的L-DOPA也会在空气中的氧化作用下慢慢变黑；所以在37度下反应1小时，每十分钟用酶标仪在475nm处测量一次各孔的吸光度，即通过黑色多巴醌的吸光度来反应酪氨酸酶的活性；

8)结果分析：酪氨酸酶活性抑制率＝[1-(各药物浓度孔的吸光度值÷药物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照孔的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％。

所述的裂解酶dispase II为商品化购买，使用质量浓度为0.25％裂解酶。

所述的IV型胶原(collageIV)，主要成份为来源于人类胎盘的IV型胶原粉末，商品化购自sigma公司。

所述的角质细胞无血清培养基KSM(Keratinocyte Serum-Free Medium)为商业化购自国外公司，如美国BioWhittaker公司的KBM(Keratinocyte Basal Medium)或GIBCO公司的DK-SFM(Defined Kerat inocyte Serum Free Medium)；

所述的胎牛血清(fetal bovine serum)为商业化购自GIBCO公司的FBS。

所述的黑色素细胞培养液中的辅助因子：insulin，TPA，IBMX，transpferrin，CT均商业化购自sigma公司；L-谷氨酰胺商业化购自invitrogen公司；碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子商业化购自peprotech公司。

所述的MTT英文全称为3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料，MTT比色法是一种常用的检测细胞存活和生长的方法。

所述的黑色素细胞促进因子α-MSH作为促进黑色素颗粒生成的物质，曲酸(kojidacid)和熊果苷(arbutin)作为抑制黑色素颗粒生成的标准美白物质，均商品化购自sigma公司。

所述作为黑色素细胞酪氨酸酶活性反应底物的L-DOPA(3.4-Dihydroxy-L-phenylalanine)商品化购自sigma公司。

有益效果：本发明建立了人类原代黑色素细胞分离培养技术，所培养的细胞分裂增殖能力强，具有人类活体黑色素细胞产生黑色素颗粒的功能，能满足美白剂毒性和功效研究的需要。由于人工培养的黑色素细胞标准化程度高、批间差异小；人工培养的人类黑色素细胞比以往实验所用的人类或者鼠类黑色素瘤细胞更接近于人类天然皮肤实验。且全程采用标准化的黑色素细胞基础培养液，明确待测药物在对黑色素细胞的毒性和美白功效上的作用，因而其应用于毒性和功效性检验的方式和检测指标更符合实际情况，可以代替整体动物和人类皮肤，直接应用于化学品、化妆品、药品等健康相关产品中美白物质的毒性和功效的试验。

具体实施方式

实施例1

I、人类皮肤原代黑色素细胞的培养与鉴定

(1)人类皮肤黑色素细胞培养液的配置

1).配制人类黑色素细胞培养液：

A.完全培养液：将角质细胞无血清培养液K-SFM(Keratinocyte Serum-FreeMedium)与胎牛血清按体积比9∶1混合，并添加以下辅助因子：氢化可的松(Hydrocortisone)，其终浓度为0.4ug/ML；牛胰岛素(insuilin)，其终浓度为10ug/ML；L-谷氨酰胺(L-glutamine)，其终浓度为6mmol；12-o-十四烷酰佛波醋酸酯-13(简写TPA，英文名12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)，其终浓度为81.06nmol/L；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(简写为IBMX，即3-isobutyl-l-methylxanthine)，其终浓度为0.1nmol/L；转铁蛋白(transferrin)，其终浓度为10ug/ML；霍乱毒素(cholera toxin，CT)，其终浓度为10ng/ML；碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和表皮生长因子(EGF)，两者的终浓度均为10ng/ML；

B.基础培养液：K-SFM与10％胎牛血清按体积比9：1混合，仅添加终浓度为6mmol的L-谷氨酰胺和终浓度为10ug/ML的胰岛素；

2)细胞培养瓶的包被：将2ml 50ug/mlIV型胶原包被液加入一个新的25ml塑料培养瓶中，使包被液覆盖在培养瓶的底部，过夜室温孵育。将包被液吸出，室温下晾干2小时备用。

(2)人类原代黑色素细胞的分离与培养

1)将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.01mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织。将清洗干净的包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；将皮片展开，表皮朝向上方浸泡于质量浓度0.25％的裂解酶(Dispases II)中37℃消化2±0.5小时。

2)将分离的皮片从Dispases II中取出，用镊子轻轻将表皮和真皮分离，将表皮收集在含有双抗的0.01mol/L的PBS中。将表皮用此PBS液彻底清洗2次，用灭菌的眼科手术剪将表皮剪碎，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA消化真皮，反复吹打3分钟。加入血清中止消化，将所得的表皮细胞混悬液通过100目的滤器过滤，去除未消化分离的组织细胞。将得到的细胞悬液室温下1200rpm/min离心5分钟。得到的沉淀即为多种表皮细胞(黑色素细胞，表皮干细胞，角质形成细胞，以及少量的成纤维细胞)。用K-SFM培养液清洗一次细胞后，将其用已经配置好的黑色素细胞培养液按照1×10⁵cell/cm²—2×10⁵cell/cm²重悬细胞，并将其接种到已经用collageIV包被好的细胞培养瓶中。隔天换一次培养液，大约12天，黑色素细胞即可长满培养瓶。

3.人类黑色素细胞的鉴定

1)制备细胞爬片：原代人类黑色素细胞按4×10⁴cell/cm²密度接种于放置盖玻片的六孔板中，24小时后贴壁生长到70％时终止培养，制备爬片。

2)将1)步所得细胞爬片经4℃ PBS洗2次，5％甲醛固定30min。加入0.2％ L-dopa，37℃染色5小时，结束染色后用PBS洗3次，10％甲醛后固定20min。甘油封片后在显微镜下观察，黑色素细胞中含有大量被L-dopa染色的黑色素颗粒。

II.利用人类黑色素细胞对美白剂的毒性进行分析；

(1).美白剂配制：

PEP液的配置：将2-丙二醇：无水乙醇：无菌双蒸水按照5：3：2配置：

PEH液的配置：将PEP液用0.01mol/L的PBS稀释10倍配置。

以曲酸(kojic acid)和熊果苷(arbutin)作为美白剂毒性试验的对照参考标准品。曲酸、熊果苷和待测化学物质用PEH液溶解(一般使用的溶解浓度为1mg/ml)，并用0.22um滤器过滤除菌，分装，-20度保存。

(2)按步骤I所述方法制备黑色素细胞，将生长至80％-90％融合的人类黑色素细胞用0.25％胰酶/0.02％ EDTA消化，1200rpm/min，5min离心，得到的细胞沉淀，用黑色素细胞完全培养液制成悬液，1×10⁴cell/孔的密度(每孔100ul)接种于96孔板。37度，5％的CO₂培养箱中培养2天。

(3)用PEH液将待测化学物质溶解成不同浓度的溶液，用黑色素细胞完全培养液溶解至待测的终浓度。将96孔板中原来的培养液移走，加入新鲜的含有药物的培养液(每孔200ul，180ul基础培养液，20ul含药物的PEH液)，同时设立阳性对照孔(有细胞，加入药物为SDS)，阴性对照孔(有细胞，不加药物，仅20ulPEH液)和空白孔(无细胞，不加药物，仅20ul的PEH液)。37度，5％的CO₂培养箱中培养3天。

(4)加入MTT溶液和DMSO溶液：在每孔中加入已经配置好的5mg/ml的MTT溶液20ul，在37度孵化4小时，移走上清液，每孔中加入DMSO 150ul，37度孵化30min，充分混匀后用酶标仪在570nm处测量每孔的吸光度。

(5)结果的分析：细胞活力抑制率＝[1—(各浓度平均吸光度值一空白孔平均吸光度值)÷(对照组平均吸光度值一空白孔平均吸光度值)]×100％。根据抑制率曲线，计算得出待测药物的致死剂量范围以及半数致死剂量(IC50)。

III、利用人类黑色素细胞对美白物质进行功效分析

(1).黑色素细胞黑色素含量的改变

1)按步骤II(1)用PEH液将待测物质溶解成不同浓度的溶液，用黑色素细胞基础培养液(K-SFM，10％胎牛血清，L-谷氨酰胺，胰岛素)溶解至待测的终浓度。以质量浓度为20umol/L的α-MSH作为美白功效实验的阳性对照。

2)原代黑色素细胞的制备：按步骤I(2)制备黑色素细胞，按密度1×10⁵cell/孔接种于6孔板。

3)待测化学物质干预：将6孔板中原来的培养液移走，每孔加入1000ul含待测化学物质的培养液(900ul基础培养液+100ul含待测化学物质的PEH液)，同时设立阳性对照孔(有细胞，加入药物为α-MSH)，阴性对照孔(有细胞，不加药物，仅100ulPEH液)。37度，5％的CO₂培养箱中培养6天，每隔两天换液一次。

4)收集药物处理以后的细胞：移走培养液，用冷的PBS清洗两遍，用细胞刮刀将不同细胞处理组以及阳性、阴性对照组的细胞分别收集到不同的EP管中，10000rpm/min，4度离心1min收集细胞。

5)裂解细胞，释放黑色素颗粒：收集后的细胞用1N NaOH溶液150ul溶解，并在100度下加热10min，将获得的每种溶有各组处理后细胞的1N NaOH溶液100ul加入到96孔中。

6)每孔细胞蛋白浓度的分析：在96孔板中每孔加入99ul protein assay和1ul 1N NaOH溶解的细胞溶液，每孔细胞设立三个测试组。

7)酶标仪测量及结果分析：用酶标仪在405nm处测量步骤(5)加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的黑色素含量的吸光度值。用酶标仪在490nm处测量步骤(6)加入96孔板中各孔的吸光度，得到每孔的蛋白浓度吸光度值。

黑素合成抑制率＝[1-(药物孔黑色素含量的吸光度值÷药物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照组黑色素含量的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％

实施例2

I、人类皮肤原代黑色素细胞的培养与鉴定

(1)人类皮肤黑色素细胞培养液的配置

1)配制人类黑色素细胞培养液：

A.完全培养液：将角质细胞无血清培养液K-SFM(Keratinocyte Serum-FreeMedium)与胎牛血清按体积比9：1混合，并添加以下辅助因子：氢化可的松(Hydrocortisone)，其终浓度为0.4ug/ML；牛胰岛素(insuilin)，其终浓度为I0ug/ML；L-谷氨酰胺(L-glutamine)，其终浓度为6mmol；12-o-十四烷酰佛波醋酸酯-13(简写TPA，英文名12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)，其终浓度为81.06nmol/L；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(简写为IBMX，即3-isobutyl-l-methylxanthine)，其终浓度为0.1nmol/L；转铁蛋白(transferrin)，其终浓度为10ug/ML；霍乱毒素(choleratoxin，CT)，其终浓度为10ng/ML；碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和表皮生长因子(EGF)，两者的终浓度均为10ng/ML；

B.基础培养液：K-SFM与10％胎牛血清按体积比9：1混合，仅添加终浓度为6mmol的L-谷氨酰胺和终浓度为10ug/ML的胰岛素；

2)细胞培养瓶的包被：将3ml50ug/ml collageIV包被液加入一个新的25ml培养瓶中，使包被液覆盖在培养瓶的底部，过夜室温孵育。将包被液吸出，塑料培养瓶在室温下放置约3小时晾干，放在4℃保存备用。

(2)人类原代黑色素细胞的分离与培养

1)将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.01mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2-3次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织。将清洗干净的包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；将皮片展开，表皮朝向上方浸泡于质量浓度0.25％的裂解酶(Dispases II)中4℃过夜15小时。

2)将分离的皮片从Dispases II中取出，用镊子轻轻将表皮和真皮分离，将表皮收集在含有双抗(100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素)的0.01mol/L的PBS中。将表皮用此PBS液彻底清洗2-3次，用已经灭菌的眼科手术剪彻底将表皮组织剪碎，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA彻底消化真皮，并用吸头反复吹打3分钟。加入血清中止消化，将所得的表皮细胞混悬液通过100目的滤器过滤，去除未消化分离的组织细胞。将得到的细胞悬液离心，室温下1200rpm/min，5分钟。得到的沉淀即为多种表皮细胞(黑色素细胞，表皮干细胞，角质形成细胞，以及少量的成纤维细胞)。用K-SFM培养液清洗一次细胞后，将其用已经配置好的黑色素细胞培养液按照1×10⁵cell/cm²—2×10⁵cell/cm²重悬细胞，并将其接种到已经用collageIV包被好的细胞培养瓶中。隔天换一次培养液，大约10-14天，黑色素细胞即可长满培养瓶。

(3)人类黑色素细胞的鉴定

1)制备细胞爬片：将培养的原代人类黑色素细胞按照4×10⁴cell/cm²密度接种于放置盖玻片的六孔板中，24小时后贴壁生长到70％时终止培养，制备爬片。

2)将1)步所得细胞爬片，4℃PBS洗2次，4％多聚甲醛固定30min。4℃PBS洗3次，每次5分钟，用正常山羊血清封闭30min。加一抗(MART-1用PBS按照1：100-1：200倍稀释)，4度冰箱保湿过夜。4℃ PBS洗3次，每次5分钟，加入二抗(德克萨斯红，用PBS按照1：200稀释)，室温保湿避光孵育1小时。0.1％DAPI染液复染细胞核，室温避光孵育10min，PBS洗3次，每次5分钟，缓冲甘油封片，在绿光激发下，相差荧光显微镜观察可见黑色素细胞呈强烈红色荧光。

II.利用人类黑色素细胞对美白剂的毒性进行分析；

(1).美白剂贮备液配制：

PEP液的配置：将2-丙二醇：无水乙醇：无菌双蒸水按照5：3：2配置：

PEH液的配置：将PEP液用0.01mol/L的PBS稀释10倍配置。

以曲酸(kojic acid)和熊果苷(arbutin)作为美白剂毒性试验的对照参考标准品。曲酸、熊果苷和待测化学物质用PEH液溶解(一般使用的贮备液浓度为1mg/ml)，并用0.22um滤器过滤除菌，分装，-20度保存。

(2)按步骤I所述方法制备黑色素细胞，将生长至80％-90％融合的人类黑色素细胞用0.25％胰酶/0.02％EDTA消化，1200rpm/min，5min离心，得到的细胞沉淀，用黑色素细胞完全培养液制成悬液，1×10⁴cell/孔的密度(每孔100ul)接种于96孔板。37度，5％的CO₂培养箱中培养2天。

(3)用黑色素细胞完全培养液将等测物质溶解至待测的终浓度。将96孔板中原来的培养液移走，加入新鲜的含有药物的培养液(每孔200ul，180ul基础培养液，20ul含药物的PEH液)，同时设立阳性对照孔(有细胞，加入药物为SDS)，阴性对照孔(有细胞，不加药物，仅20ulPEH液)和空白孔(无细胞，不加药物，仅20ul的PEH液)。37度，5％的CO₂培养箱中培养3天。

(4)加入MTT溶液和DMSO溶液：在每孔中加入已经配置好的5mg/ml的MTT溶液20ul，在37度孵化4小时，移走上清液，每孔中加入DMSO 150ul，37度孵化30min，充分混匀后用酶标仪在570nm处测量每孔的吸光度。

(5)结果的分析：细胞活力抑制率＝[1—(各浓度平均吸光度值一空白孔平均吸光度值)÷(对照组平均吸光度值一空白孔平均吸光度值)]×100％。根据抑制率曲线，计算得出待测药物的致死剂量范围以及半数致死剂量(IC50)。

III、利用人类黑色素细胞对美白物质进行功效分析

采用黑色素细胞酪氨酸酶活性改变检测美白功效：

1)按步骤II(1)用PEH液将待测物质溶解成不同浓度的溶液，用黑色素细胞基础培养液(K-SFM，10％胎牛血清，L-谷氨酰胺，胰岛素)溶解至待测的终浓度。以质量浓度为20umol/L的α-MSH作为美白功效实验的阳性对照。

2)原代黑色素细胞的制备：按步骤I(2)制备黑色素细胞，按密度1×10⁵cell/孔接种于6孔板。

3)待测化学物质干预：将6孔板中原来的培养液移走，每孔加入1000ul含待测化学物质的培养液(900ul基础培养液+100ul含待测化学物质的PEH液)，同时设立阳性对照孔(有细胞，加入药物为α-MSH)，阴性对照孔(有细胞，不加药物，仅100ulPEH液)。37度，5％的CO₂培养箱中培养6天，每隔两天换液一次。

4)收集药物处理以后的细胞：移走培养液，用冷的PBS清洗两遍，用细胞刮刀将不同细胞处理组以及阳性、阴性对照组的细胞分别收集到不同的EP管中，10000rpm/min，4度离心1min收集细胞。

5)裂解细胞，释放黑色素颗粒：收集后的细胞用细胞裂解液(lysis buffer)(0.1M磷酸盐缓冲液，含有质量百分比1％的Triton-X-100和100ug/ml的苯甲基磺酰氟)150ul溶解，用声裂法充分裂解(操作均在冰上进行)，充分裂解后，13000rpm/min，4度离心20min。得到的上清液即含酪氨酸酶的胞质蛋白。

6)每孔细胞蛋白浓度的分析：在96孔板中每孔加入98ul protein assay和2ul细胞裂解液溶解的胞质蛋白，每孔细胞设立三个测试组。用酶标仪在490nm处测量各孔的蛋白浓度的吸光度值。

7)酪氨酸酶活性试验：在96孔板中每孔加入90ul各孔含胞质蛋白的细胞裂解液，10ul 2mg/ml的L-DOPA溶液。对照组为90ul不含蛋白的细胞裂解液和10ul 2mg/ml的L-DOPA溶液。因为无色的L-DOPA在胞质蛋白中所含的酪氨酸酶的作用下会变成黑色的多巴醌，而在无酪氨酸酶的作用下，无色的L-DOPA也会在空气中的氧化作用下慢慢变黑。所以在37度下反应1小时，每十分钟用酶标仪在475nm处测量一次各孔的吸光度，即通过黑色多巴醌的吸光度来反应酪氨酸酶的活性。

8)结果分析：酪氨酸酶活性抑制率＝[1-(各药物浓度孔的吸光度值÷药物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照孔的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％

实施例3

I、人类皮肤原代黑色素细胞的培养与鉴定

(1)人类皮肤黑色素细胞培养液的配置

1)配制人类黑色素细胞培养液：

A.完全培养液：将角质细胞无血清培养液K-SFM(Keratinocyte Serum-FreeMedium)与胎牛血清按体积比9：1混合，并添加以下辅助因子：氢化可的松(Hydrocortisone)，其终浓度为0.4ug/ML；牛胰岛素(insuilin)，其终浓度为10ug/ML；L-谷氨酰胺(L-glutamine)，其终浓度为6mmol；12-o-十四烷酰佛波醋酸酯-13(简写TPA，英文名12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)，其终浓度为81.06nmol/L；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(简写为IBMX，即3-isobutyl-l-methylxanthine)，其终浓度为0.1nmol/L；转铁蛋白(transferrin)，其终浓度为10ug/ML；霍乱毒素(choleratoxin，CT)，其终浓度为10ng/ML；碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和表皮生长因子(EGF)，两者的终浓度均为10ng/ML；

B.基础培养液：K-SFM与10％胎牛血清按体积比9：1混合，仅添加终浓度为6mmol的L-谷氨酰胺和终浓度为10ug/ML的胰岛素；

2).细胞培养瓶的包被：将2-3ml50ug/ml collageIV包被液加入一个新的25ml塑料培养瓶中，使包被液覆盖在培养瓶的底部，过夜室温孵育。将包被液吸出，塑料培养瓶在室温下放置约2-3小时晾干，或将已经包被好的培养瓶放在4℃保存备用。

(2)人类原代黑色素细胞的分离与培养

1)将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.01mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2-3次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织。将清洗干净的包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；将皮片展开，表皮朝向上方浸泡于质量浓度0.25％的裂解酶(Dispases II)中4℃过夜12小时。

2)将分离的皮片从Dispases II中取出，用镊子轻轻将表皮和真皮分离，将表皮收集在含有双抗(100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素)的0.01mol/L的PBS中。将表皮用此PBS液彻底清洗2-3次，用已经灭菌的眼科手术剪彻底将表皮组织剪碎，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA彻底消化真皮，并用吸头反复吹打3分钟。加入血清中止消化，将所得的表皮细胞混悬液通过100目的滤器过滤，去除未消化分离的组织细胞。将得到的细胞悬液离心，室温下1200rpm/min，5分钟。得到的沉淀即为多种表皮细胞(黑色素细胞，表皮干细胞，角质形成细胞，以及少量的成纤维细胞)。用K-SFM培养液清洗一次细胞后，将其用已经配置好的黑色素细胞培养液按照1×10⁵cell/cm²—2×10⁵cell/cm²重悬细胞，并将其接种到已经用collageIV包被好的细胞培养瓶中。隔天换一次培养液，大约10-14天，黑色素细胞即可长满培养瓶。

(3)人类黑色素细胞的电镜鉴定：将接种在培养皿中快速生长期的细胞用细胞刮刀刮下，用电镜固定液固定细胞，制备扫描电镜照片，观察到细胞中大量黑色素颗粒。

II.利用人类黑色素细胞对美白剂的毒性进行分析；

(1).美白剂贮备液配制：

PEP液的配置：将2-丙二醇：无水乙醇：无菌双蒸水按照5：3：2配置：

PEH液的配置：将PEP液用0.01mol/L的PBS稀释10倍配置。

以曲酸(kojic acid)作为美白剂毒性试验的对照参考标准品。曲酸、熊果苷和待测化学物质用PEH液溶解(一般使用的贮备注浓度为1mg/ml)，并用0.22um滤器过滤除菌，分装，-20度保存。

(2)按步骤I所述方法制备黑色素细胞，将生长至80％-90％融合的人类黑色素细胞用0.25％胰酶/0.02％EDTA消化，1200rpm/min，5min离心，得到的细胞沉淀，用黑色素细胞完全培养液制成悬液，1×10⁴cell/孔的密度(每孔100ul)接种于96孔板。37度，5％的CO₂培养箱中培养2天。

(3)用黑色素细胞完全培养液将待测化学物质溶解至待测的终浓度。将96孔板中原来的培养液移走，加入新鲜的含有药物的培养液(每孔200ul，180ul基础培养液，20ul含药物的PEH液)，同时设立阳性对照孔(有细胞，加入药物为SDS)，阴性对照孔(有细胞，不加药物，仅20ul PEH液)和空白孔(无细胞，不加药物，仅20ul的PEH液)。37度，5％的CO₂培养箱中培养3天。

(4)加入MTT溶液和DMSO溶液：在每孔中加入已经配置好的5mg/ml的MTT溶液20ul，在37度孵化4小时，移走上清液，每孔中加入DMSO 150ul，37度孵化30min，充分混匀后用酶标仪在570nm处测量每孔的吸光度。

(5)结果的分析：细胞活力抑制率＝[1一(各浓度平均吸光度值一空白孔平均吸光度值)÷(对照组平均吸光度值一空白孔平均吸光度值)]×100％。根据抑制率曲线，计算得出待测药物的致死剂量范围以及半数致死剂量(IC50)。

III、利用人类黑色素细胞对美白物质进行功效分析

同时采用两种方法进行美白功效评价：

(1).黑色素细胞黑色素含量的改变

1)按步骤II(1)用PEH液将待测物质溶解成不同浓度的溶液，用黑色素细胞基础培养液(K-SFM，10％胎牛血清，L-谷氨酰胺，胰岛素)溶解至待测的终浓度。以质量浓度为20umol/L的α-MSH作为美白功效实验的阳性对照。

2)原代黑色素细胞的制备：按步骤I(2)制备黑色素细胞，按密度1×10⁵cell/孔接种于6孔板。

3)待测化学物质干预：将6孔板中原来的培养液移走，每孔加入1000ul含待测化学物质的培养液(900ul基础培养液+100ul含待测化学物质的PEH液)，同时设立阳性对照孔(有细胞，加入药物为α-MSH)，阴性对照孔(有细胞，不加药物，仅100ul PEH液)。37度，5％的CO₂培养箱中培养6天，每隔两天换液一次。

4)收集药物处理以后的细胞：移走培养液，用冷的PBS清洗两遍，用细胞刮刀将不同细胞处理组以及阳性、阴性对照组的细胞分别收集到不同的EP管中，10000rpm/min，4度离心1min收集细胞。

5)裂解细胞，释放黑色素颗粒：收集后的细胞用1N NaOH溶液150ul溶解，并在100度下加热10min，将获得的每种溶有各组处理后细胞的1N NaOH溶液100ul加入到96孔中。

6)每孔细胞蛋白浓度的分析：在96孔板中每孔加入99ul protein assay和1ul 1N NaOH溶解的细胞溶液，每孔细胞设立三个测试组。

7)酶标仪测量及结果分析：用酶标仪在405nm处测量步骤(5)加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的黑色素含量的吸光度值。用酶标仪在490nm处测量步骤(6)加入96孔板中各孔的吸光度，得到每孔的蛋白浓度吸光度值。

黑素合成抑制率＝[1-(药物孔黑色素含量的吸光度值÷药物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照组黑色素含量的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％

(2)黑色素细胞酪氨酸酶活性的改变

1)同步骤III(1)1)-4)。

5)裂解细胞，释放黑色素颗粒：收集后的细胞用细胞裂解液(lysis buffer)(0.1M磷酸盐缓冲液，含有质量百分比1％的Triton-X-100和100ug/ml的苯甲基磺酰氟)150ul溶解，用声裂法充分裂解(操作均在冰上进行)，充分裂解后，13000rpm/min，4度离心20min。得到的上清液即含酪氨酸酶的胞质蛋白。

6)每孔细胞蛋白浓度的分析：在96孔板中每孔加入98ul protein assay和2ul细胞裂解液溶解的胞质蛋白，每孔细胞设立三个测试组。用酶标仪在490nm处测量各孔的蛋白浓度的吸光度值。

7)酪氨酸酶活性试验：在96孔板中每孔加入90ul各孔含胞质蛋白的细胞裂解液，10ul 2mg/ml的L-DOPA溶液。对照组为90ul不含蛋白的细胞裂解液和10ul 2mg/ml的L-DOPA溶液。因为无色的L-DOPA在胞质蛋白中所含的酪氨酸酶的作用下会变成黑色的多巴醌，而在无酪氨酸酶的作用下，无色的L-DOPA也会在空气中的氧化作用下慢慢变黑。所以在37度下反应1小时，每十分钟用酶标仪在475nm处测量一次各孔的吸光度，即通过黑色多巴醌的吸光度来反应酪氨酸酶的活性。

8)结果分析：酪氨酸酶活性抑制率＝[1-(各药物浓度孔的吸光度值÷药物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照孔的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％。