抗VEGFR－2抗体嵌合Fab抗体片段及其制备方法、应用

摘要

本发明涉及的是抗VEGFR－2抗体嵌合Fab抗体片段及其制备方法、应用，利用基因重组技术，对抗VEGFR－2杂交瘤细胞株8H1进行改造，将鼠源性抗体的可变区与人IgG1的CH1、Cκ重组，以VH－linker－VL形式将其与原核表达载体连接，制备抗VEGFR－2抗体嵌合Fab抗体片段。该抗VEGFR－2抗体杂交瘤细胞株8H1已于2009年4月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.3013。所述的抗VEGFR－2抗体嵌合Fab抗体片段在制备抗VEGFR－2的诊断性试剂、治疗性药物中的应用。

说明书

技术领域：

本发明涉及的是抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段及其制备方法、应用，利用基因重组技术，对抗VEGFR-2杂交瘤细胞株8H1进行改造，将鼠源性抗体的可变区与人IgG1的CH1、Cκ重组，以VH-linker-VL形式将其与原核表达载体连接，制备抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段，以降低抗体的鼠源性成分，潜在用于血管相关疾病(包括一些高表达VEGFR-2的肿瘤)的诊断和治疗，本发明涉及基因工程技术和免疫靶向诊疗领域。

背景技术：

近几年免疫靶向疗法在临床诊疗中的作用有了较大进步，血管生成和血管相关疾病(包括肿瘤)密切相连，而血管的生成主要依靠血管生长因子(VEGF)和血管生长抑制因子的调控，其中最密切的是血管内皮生长因子及其受体(VEGFR)，特别是VEGFR-2。若有理想的靶向药物识别VEGR/VEGFR通道，则可起到诊疗疾病的作用。

由于抗体的高度特异性，利用抗体将药物导向靶点细胞是一种理想的途径，抗体导向的药物治疗在动物模型和临床试验中显示出较强的诊疗作用。当前单克隆抗体药物或抗体偶联药物已成为制药行业中增长最快、获利最大的市场之一。随着临床治疗用单抗大量上市，未来临床治疗用单抗制造的需求也相当可观，抗体临床治疗成功的病例也屡见不鲜。

随着现代生物技术的迅猛发展，运用功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学等现代生化与分子生物学技术，结合基因工程、蛋白质工程、细胞工程等技术，使得生物技术药物研发高潮迭起。治疗性抗体成热点抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，其在感染、心血管疾病、自身免疫性疾病、肿瘤治疗中有巨大的潜力与应用前景。当前，治疗性抗体药物研发已成为生物技术药物领域的热点，而抗体药物作用靶点的选择性、抗体药物的人源化、小型化和高效化也是今后的研究重点。抗体Fab片段由重链Fd段和完整的轻链组成，是完整抗体分子的三分之一，属于小分子抗体，具穿透力强，半衰期短的优势，尤其适用于人体疾病的靶向诊疗。

由于鼠源单克隆抗体的临床应用的产生人抗鼠抗体反应(HAMA)和过敏反应，减低了药物的疗效，因而运用基因工程技术将鼠源抗体进行改造，降低HAMA反应同时提高治疗效果，成为该领域的研究热点。

发明内容

本发明目的是针对上述背景，提供一种抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段及其制备方法、应用，是利用基因重组技术对鼠源性的抗VEGFR-2抗体杂交瘤细胞株8H1进行改造，将抗VEGFR-2抗体的重链可变区、轻链可变区分别和人IgG₁抗体的CH₁和Cκ片段重组，再通过重叠延伸PCR扩增到一个全长为1.5kb左右的抗VEGFR-2嵌合Fab抗体片段的核苷酸片段。

该抗VEGFR-2抗体杂交瘤细胞株8H1已于2009年4月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.3013。

嵌合Fab抗体片段的核苷酸片段和原核表达质粒pComb3XSS分别用SfiI限制性内切酶酶切后进行连接，构建嵌合Fab片段的原核表达载体，转入大肠杆菌TOP10F′后诱导表达嵌合的Fab抗体片段，其中嵌合Fd段分子量约为29kDa，嵌合L链分子量约为24kDa，两者通过链间二硫键连接组成抗VEGFR-2抗体人鼠嵌合Fab抗体片段，并构建了嵌合Fab抗体片段的原核表达质粒并进行可溶性表达，建立了表达蛋白的纯化方法，获得了高纯度的可溶性蛋白，该蛋白保持了鼠源性抗VEGFR-2抗体具备的抗体性质和特异性，在用于血管相关疾病(包括一些高表达VEGFR-2的肿瘤)的靶向诊疗药物中具有潜在的应用前景。

抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段及其制备方法、应用是采取以下技术方案实现的：

抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段，即鼠源性抗VEGFR-2抗体的重链和轻链可变区与人IgG₁的重链部分恒定区(CH₁)及轻链恒定区(Cκ)进行重组形成的融合蛋白；鼠源性抗VEGFR-2抗体的轻链可变区与人IgG₁的轻链恒定区Cκ重组的嵌合L链及鼠源性抗VEGFR-2抗体的重链可变区VH与人IgG₁的CH₁重组的嵌合Fd段，两者中间通过前导序列pelB连接，嵌合Fd段、L链分泌到细菌周质腔时前导序列pelB被剪切，两者通过链间二硫键连接构成嵌合Fab抗体片段；

嵌合L链的氨基酸序列为：

Glu Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala

Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp

Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg

Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe

Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Leu

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys ter Phe ter

嵌合Fd段的氨基酸序列为：

Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys

Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser His Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys

Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu

Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Arg Gly Tyr Tyr Ala Met Asp

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His

His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser ter

抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段的制备方法，该抗体片段是利用基因工程技术制备，具体方法如下：

1)抗体可变区基因片段的扩增及验证：

鼠源性抗VEGFR-2抗体杂交瘤细胞8H1培养至对数生长期，Trizol-氯仿-异丙醇法抽提细胞总RNA；以总RNA中的mRNA为模板，以oligodT₁₅为引物，反转录扩增获得单链cDNA。

设计鼠源性抗VEGFR-2抗体的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)的扩增引物，分别扩增VH、VL片段，轻链可变区(VL)的上游引物为VLF：5′-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGACATTGTGATGA CACAGTC-3’，下游引物为VLR：5′-AGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3′，在VLF的5′端引入了SfiI的酶切识别位点即下划线部分序列，VLR的5′端引入了与人IgG₁的Cκ上游引物5′端互补的21个碱基即斜体部分序列，以利于鼠源性抗VEGFR-2抗体的VL与人IgG₁的Cκ片段的重叠PCR扩增；重链可变区(VH)的上游引物为VHF：5′-GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCTCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3′，下游引物为VHR：5′-CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3′，在VHF的5′端引入了和人IgG₁的Cκ下游引物互补的21个碱基序列即斜体部分序列，VHR的5′端引入了和人IgG₁的CH₁上游引物互补的21个碱基序列，即斜体部分，以利于抗VEGFR-2抗体的VH与人IgG₁的CH₁片段的重叠PCR扩增。

分别以反转录扩增的cDNA为模板，用引物VHF、VHR扩增鼠源性抗VEGFR-2抗体的VH基因片段，用引物VLF、VLR扩增鼠源性抗VEGFR-2抗体的VL基因片段。扩增条件均为95℃ 4分钟；95℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒，30个循环；72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化扩增基因片段，VH、VL PCR胶回收纯化产物分别与pMD-18T载体进行TA连接。连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue，涂布含浓度100μg/ml氨苄青霉素、30μg/ml四环素的LB平板，置37℃ 12-16h。次日随机挑取转化菌及空质粒转化对照菌，37℃摇菌5小时后分别用VH、VL基因片段的上下游特异引物对菌液进行PCR鉴定，含有插入VH基因片段质粒的菌株扩增出一条351bp左右的条带，含有插入VL基因片段质粒的菌株扩增出一条336bp左右的条带。菌液PCR验证扩增出大小正确条带的菌液送生物公司进行测序。

其中VH的核苷酸序列为：

GTG AAG CTG GTG GAG TCA GGA CCT GGC CTA GTG CAG CCC TCA CAG AGC CTG TCC ATC ACC TGC

ACA GTC TCT GGT TTC TCA TTA ACT AGC CAT GGT GTA CAC TGG GTT CGC CAG TCT CCA GGA AAG

GGT CTG GAG TGG CTG GGA GTG ATA TGG AGT GGT GGA AGC ACA GAC TAT AAT GCA GCT TTC ATA

TCC AGA CTG AGC ATC AGC AAG GAC AAT TCC AAG AGC CAA GTT TTC TTT AAA ATG AAC AGT CTG

CAA GCT AAT GAC ACA GCC ATA TAT TAC TGT GCC AGA AAT AGG AGG GGG TAC TAT GCT ATG GAC

TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA

VL的核苷酸序列为：

GAC ATT GTG ATG ACA CAG TCT GCA TTC TCC AAT CCA GTC ACT CTT GGA ACA TCA GCT TCC ATC

TCC TGC AGG TCT AGT AAG AGT CTC CTA CAT AGT AAT GGC ATC ACT TAT TTG TAT TGG TAT CTG

CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCT CAG CTC CTG ATT TAT CAG ATG TCC AAC CTT GCC TCA GGA GTC

CCA GAC AGG TTC AGT AGC AGT GGG TCA GGA ACT GAT TTC ACA CTG AGA ATC AGC AGA GTG GAG

GCT GAG GAT GTG GGT GTT TAT TAC TGT GCT CAA AAT CTA GAA CTT CCT CTC ACG TTC GGT GCT

GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA

2)嵌合Fab片段的扩增：

(1)人IgG₁抗体的CH₁和Cκ段的扩增：

以质粒pComb3XTT为模板，分别扩增人IgG₁抗体的Cκ和CH₁核苷酸片段；Cκ段的上游引物为CκF：5′-CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC-3′，下游引物为CκR：5′-GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC-3′；CH₁的上游引物为CH₁F：5′-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3′，下游引物为CH₁R：AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3′。扩增条件均为95℃ 4分钟；95℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环；72℃延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳，分别扩增出约393bp、321bp的条带，胶回收纯化扩增条带，溶于去离子水内，-20℃冻存备用；

(2)嵌合L链、Fd段基因片段的扩增：

以鼠源性抗VEGFR-2抗体的VL及人IgG₁抗体的Cκ的PCR扩增产物为模板，用上游引物LF：5′-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGACATTGTGATGACACAGTC-3′和下游引物LR：5′-GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC-3′进行重叠延伸PCR扩增嵌合L链，扩增条件为95℃，4分钟；95℃，30秒、56℃，30秒、72℃，30秒，30个循环；72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳，扩增出约657bp的条带，胶回收扩增条带，溶于去离子水内，-20℃冻存备用。

以鼠源性抗VEGFR-2抗体的VH及人IgG₁抗体的CH₁的PCR扩增产物为模板，用上游引物FdF：5′-GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCTCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3′和下游引物FdR：5′-AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3′进行重叠延伸PCR扩增嵌合Fd片段，扩增条件为95℃，4分钟；95℃，30秒、56℃，30秒、72℃，30秒，30个循环；72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳，扩增出约774bp的条带，胶回收扩增条带，溶于去离子水内，-20℃冻存备用。

(3)嵌合Fab基因片段的扩增：

以扩增获得的嵌合Fd段和L链核苷酸序列的胶回收纯化产物为模板，用上游引物Fab F：5′-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGACATTGTGATGACACAGTC-3′和下游引物FabR：5′-AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3′进行重叠延伸PCR扩增，扩增时，先不加引物，95℃ 4分钟；94℃ 30秒、45℃ 30秒、72℃ 90秒，8个循环；而后加入FabF、FabR引物后94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 90秒，22个循环；72℃延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳扩增出约1.5kb的条带，胶回收纯化扩增条带，溶于去离子水内，-20℃冻存备用。

3)嵌合Fab原核表达载体的构建和鉴定：

提取质粒pComb3XSS，质粒及Fab片段的PCR胶回收产物用SfiI限制性内切酶在50℃酶切12-16h，电泳后胶回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水中。取pComb3XSS、Fab扩增产物的酶切产物按1：4摩尔比混匀，在同一离心管内用T4连接酶16℃连接12-16h。

将连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10F′，涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，置37℃12-16h；次日随机挑取转化菌及空质粒转化对照菌，37℃摇菌5小时后，分别用Fab的特异引物对对菌液进行PCR扩增鉴定，含有插入Fab片段质粒的菌株扩增出一条约1.5kb左右的条带；菌液PCR验证扩增出大小正确条带的菌液送生物公司进行测序，DNA序列分析证实在重组质粒中含有构建的嵌合Fab片段，序列正确，其中横线部分ATG AAA TAC CTA TTG CCTACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC为前导序列pelB，TAG为嵌合Fd链、L链翻译终止密码子，GCC AGA GCG GCC、GGC CAG GCC GGC为连接嵌合Fab抗体片段基因和载体pComb3XSS的SfiI酶切位点，GAG CTC为载体pComb3XSS的SacI酶切位点，CAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT GGC GCA TAC CCG TAC GAC GTT CCG GAC TAC GCT TCT为载体pComb3XSS上序列含His标签，ACT AGT为SpeI酶切位点，C TAG A为XbaI酶切位点，CTC GAG为XhoI酶切位点；

GCC AGA GCG GCC GAG CTC GAC ATT GTGATG ACA CAG TCT GCA TTC TCC AAT CCA GTC ACT

CTT GGA ACA TCA GCT TCC ATC TCC TGC AGG TCT AGT AAG AGT CTC CTA CAT AGT AAT GGC ATC

ACT TAT TTG TAT TGG TAT CTG CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCT CAG CTC CTG ATT TAT CAG ATG

TCC AAC CTT GCC TCA GGA GTC CCA GAC AGG TTC AGT AGC AGT GGG TCA GGA ACT GAT TTC ACA

CTG AGA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT GTG GGT GTT TAT TAC TGT GCT CAA AAT CTA GAA

CTT CCT CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT

GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG

CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG

GGT AAC TCC GAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC

ACC CTG ACG GTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT

CAG GGC CTG AGC TTG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAG TTC TAG ATA ATT

AAT TAG GAG GAA TTT AAA ATG AAA TAG CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC

GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG CTG GTG GAG TCA GGA CCT GGC CTA GTG CAG

CCC TCA CAG AGC CTG TCC ATC ACC TGC ACA GTC TCT GGT TTC TCA TTA ACT AGC CAT GGT GTA

CAC TGG GTT CGC CAG TCT CCA GGA AAG GGT CTG GAG TGG CTG GGA GTG ATA TGG AGT GGT GGA

AGC ACA GAC TAT AAT GCA GCT TTC ATA TCC AGA CTG AGC ATC AGC AAG GAC AAT TCC AAG AGC

CAA GTT TTC TTT AAA ATG AAC AGT CTG CAA GCT AAT GAC ACA GCC ATA TAT TAC TGT GCC AGA

AAT AGG AGG GGG TAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA

GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC

ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC

TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC

TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC

GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA

ACT AGT GGC CAG GCC GGC CAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT GGC GCA TAC CCG TAC GAC GTT CCG

GAC TAC GCT TCT TAG

构建的重组质粒表达嵌合的L链及Fd段重组的嵌合Fab片段，两者之间前导肽序列pelB翻译的22个氨基酸连接，翻译的蛋白片段分泌至细菌周质腔时前导肽pelB被剪切，嵌合L链和Fd段通过链间二硫键连接。

4)表达嵌合Fab细菌的筛选鉴定及表达蛋白的纯化

将含有正确重组质粒的菌液按1：100转入2ml SB溶液中，氨苄青霉素工作浓度为100μg/ml，葡萄糖终浓度为4％，37℃摇菌过夜；过夜的细菌10000g离心15分钟，弃去上清液，而后用2ml SB重悬，将重悬后的菌液按1：100转入2ml含氨苄青霉素终浓度为100μg/ml的SB培养基中，37℃培养OD600＝1.0左右，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，蔗糖终浓度至4％，23℃振荡培养20h，离心收集菌体，分别处理培养上清、菌体超声上清及超声沉淀，进行SDS-PAGE及western-blot检测，嵌合Fab片段在培养上清、菌体超声上清及超声沉淀中均有表达，其中可溶性蛋白主要是在菌体超声上清中，其中嵌合Fd段分子量约为29kDa，嵌合L链分子量约为24kDa，而对照菌TOP10F′中无目的蛋白条带；

细菌大量诱导表达后菌液10000g离心15分钟，弃培养上清，沉淀中加入原菌液1/10体积的20mM磷酸盐平衡缓冲液将细菌重悬，该缓冲液中含0.5M/L NaCl，10mM咪唑；而后对菌液进行超声，超10秒，停10秒，共超90次，而后4℃ 12000rpm离心30分钟，弃沉淀，超声上清用0.22μm滤膜过滤，然后用5ml Histrap HP柱子进行纯化。先用用5倍柱体积的水以2.5ml/min的速度洗柱子，而后用至少10倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，然后以2ml/min的速度上样；用平衡缓冲液平衡镍柱至基线，分别用5倍柱体积的含50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM咪唑的缓冲液洗柱子，并收集相应浓度咪唑的洗脱液，进行12％SDS-PAGE电泳，观察蛋白纯化情况。结果含400mM咪唑的洗脱液中见纯化的Fab蛋白，用10KD的millpore超滤柱子进行除盐浓缩，PBS洗3次，即获得纯化的嵌合Fab抗体片段。

5)嵌合Fab抗体片段的活性鉴定：

I酶联免疫法：用含0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6的包被液稀释重组人VEGFR-2蛋白，该蛋白购自美国R&D公司，产品编号357-KD-050。重组人VEGFR-2蛋白以2μg/ml的浓度包被96孔ELISA板，每孔加入100μl，4℃过夜；PBST洗涤后，用5％脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭，37℃孵育2h；PBST洗涤5次后，每个孔中加入100μl抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段，以200μg/ml起始浓度，11个浓度梯度稀释，4℃过夜；以1：5000稀释的羊抗人Fab第二抗体100μl/孔加入到孔内，37℃孵育1h；过氧化物酶底物显色液100μl/孔，室温下15分钟后用2M硫酸中止反应，上机检测比色采用双波长450nm/630nm。结果嵌合Fab抗体片段能与重组人VEGFR-2蛋白起抗原抗体ELISA反应。

TT免疫印迹法：高表达VEGFR-2的人脐内皮静脉细胞(HUVEC)、低或无表达VEGFR-2的小鼠成纤维(NIH3T3)细胞总蛋白为天然抗原。细胞分别培养至1×10⁷，4℃条件下去除培养基用PBS清洗，用500μl RIPA裂解液充分裂解细胞，10000g离心5分钟取上清及细胞总蛋白，测定各细胞总蛋白的浓度。将各细胞总蛋白浓度制成1mg/ml相等浓度后分装冻存-20℃备用。

将HUVEC、NIH3T3细胞总蛋白进行10％SDS-PAGE电泳并电转到硝酸纤维膜上，将此膜与50μg/ml的抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段和1：2000稀释的内参抗体β-actin同时37℃孵育2h，PBST洗涤间隔5分钟4次，羊抗人Fab二抗37℃孵育1h，DAB显色结果，HUVEC总蛋白泳道从上向下出现一粗亮条带、三暗条带，分别依次对应于VEGFR-2蛋白三条带230kDa、200kDa、150kDa及内参β-actin条带；NIH3T3细胞总蛋白泳道则仅出现43kDa的内参β-actin条带。

III流式细胞术：采用流式细胞仪(FACS)分析抗VEGFR-2抗体人鼠嵌合Fab抗体片段与VEGFR-2天然抗原的结合活性。具体方法为，分别将2×10⁶个HUVEC和NIH3T3细胞用含0.1％多聚甲醛PBS固定细胞半小时后无菌预冷4℃的PBS冲洗三遍，分别用抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段，60μg/ml和120μg/ml两个不同浓度共孵育4℃过夜，PBS洗三遍后加入羊抗人Fab罗丹明荧光二抗，避光室温孵育2小时后PBS洗三遍，含0.1％多聚甲醛PBS400μl重悬，在FACS上进行免疫荧光分析并测定平均荧光强度，以只加二抗为本底，结果60μg/ml和120μg/ml两个不同浓度的抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段与HUVEC结合率分别为34.46％和35.16％；同样浓度的抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段与NIH3T3细胞结合率分别为14.06％和16.26％。

以上结果显示，抗VEGFR-2抗体人鼠嵌合Fab抗体片段能与VEGFR-2抗原结合，说明该嵌合Fab片段保留了原制备的抗VEGFR-2抗体具备的抗体性质和特异性。

所述的抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段，其特征在于：利用上述获得的嵌合Fab基因片段，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞中进行重组表达、制备。

所述的抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段用于血管相关疾病，特别是高表达VEGFR-2的肿瘤研究。

所述的抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段在制备抗VEGFR-2的诊断性试剂、治疗性药物中的应用。

本发明与现有技术相比具有的优点：

随着现代生物技术的迅猛发展，运用功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学等现代生化与分子生物学技术，结合基因工程、蛋白质工程、细胞工程等技术，使得生物技术药物研发高潮迭起。治疗性抗体是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，以其特异性强、安全有效而成为当前生物技术药物研发的热点。制备的抗VEGFR-2抗体人鼠嵌合Fab抗体片段，通过试验表明保留了鼠源性抗VEGFR-2抗体的模拟抗原性质和特异性，用于血管相关疾病，特别是高表达VEGFR-2的肿瘤研究，可用于制备抗VEGFR-2的诊断性试剂、治疗性药物。

使用基因重组技术对该鼠源单克隆抗体进行改造制备嵌合Fab抗体片段，制备的抗体片段有以下优点：

(1)大大降低了抗VEGFR-2抗体的鼠源性成分，有利于进一步开展体内试验。

(2)保留了鼠源性抗体具备的抗体性质和特异性，可潜在用于血管相关疾病(包括一些高表达VEGFR-2的肿瘤)的靶向诊疗。

(3)原核表达载体易于构建，可大量表达，生产快速且便于纯化。

(4)有利于制备嵌合全分子抗体或抗体的人源化改造，进一步降低抗VEGFR-2抗体中的鼠源成分以开展血管相关疾病(包括一些高表达VEGFR-2的肿瘤)的靶向诊疗研究。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明：

图1是单克隆抗VEGFR-2单克隆抗体杂交瘤细胞总RNA电泳结果，显示RNA抽提较好，没有发生降解。

图2是单克隆抗VEGFR-2抗体重链可变区及轻链可变区PCR扩增产物电泳结果，M：核酸标准分子量(Takara DL2000)；1：336bp的VL基因片段；2：351bp的VH基因片段。

图3：以pComb3XTT为模板扩增的人IgG₁的轻链恒定区及重链恒定区1片段电泳结果，M：核酸标准分子量(Takara DL2000)；1：321bp的Cκ基因片段；2：393bp的CH₁基因片段。

图4：嵌合Fd段及L链扩增产物的核酸电泳结果，M：核酸标准分子量(Takara DL2000)；1：657bp的L基因片段；2：744bp的Fd基因片段。

图5：嵌合Fab扩增产物的核酸电泳结果，M：核酸标准分子量(Takara DL2000)；1：约1.5kb的Fab基因片段。

图6：以标记HRP的羊抗人Fab抗体的western-blot结果，抗原为嵌合Fab菌和对照菌TOP10F′的超声沉淀、菌体超声上清及培养上清：M为Fermentas，#SM0641，1-3分别为嵌合Fab菌的超声沉淀、菌体超声上清及培养上清；4-6分别为对照菌TOP10F′的超声沉淀、菌体超声上清及培养上清。

图7：嵌合Fab纯化蛋白SDS-PAGE电泳结果，M为蛋白质标准(Fermentas，#SM0441)，1-6分别为含50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM咪唑的洗脱液，其中5为400mM咪唑的洗脱液中纯化的嵌合Fab片段。

图8：以商品化重组人VEGFR-2蛋白为抗原，抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段为一抗的ELISA结果。

图9：以HUVEC、NIH3T3细胞总蛋白为天然抗原，抗VEGFR-2抗体嵌合Fab分子为一抗的western-blot(DAB显色)结果，M为蛋白marker；1为HUVEC细胞总蛋白，2为NIH3T3细胞总蛋白。

图10：以抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段为一抗，与HUVEC和NIH3T3细胞反应的FACS结果，以不加一抗只加二抗为本底：1为本底；2、3为抗VEGFR-2抗体Fab分子与HUVEC的结合图；4、5为抗VEGFR-2抗体Fab分子与NIH3T3细胞的结合图。

具体实施方式

实施例1、抗VEGFR-2抗体人鼠嵌合Fab抗体片段的制备方法：

1)抗体可变区基因片段的扩增及验证：

鼠源性抗VEGFR-2抗体杂交瘤细胞8H1培养至对数生长期，Tri zol-氯仿-异丙醇法抽提细胞总RNA；将干燥后的细胞总RNA溶于10μl水中，取1μl做10g/l琼脂糖凝胶电泳，电泳后出现3条带(见图1)，28s、18s和5s。说明RNA的抽提较好且降解少，其含量约为0.1g/l。取9μl的RNA进行逆转录，以总RNA中的mRNA为模板，以oligodT₁₅为引物，反转录扩增获得单链cDNA。

设计19条VH上游引物和17条Vκ上游引物，4条VH下游引物和3条Vκ下游引物引物：

Vκ5’上游引物：

Vκ-1

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TCC AGC TGA CTC AGC C-3’

Vκ-2

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCW CCC AGT C-3’

Vκ-3

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGM TMA CTC AGT C-3’

Vκ-4

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGY TRACAC AGT C-3’

Vκ-5

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TRA TGA CMC AGT C-3’

Vκ-6

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTM AGA TRA MCC AGT C-3’

Vκ-7

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTC AGA TGA YDC AGT C-3’

Vκ-8

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TYC AGA TGA CAC AGA C-3’

Vκ-9

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCA WCC AGT C-3’

Vκ-10

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG WGC TSA CCC AAT C-3’

Vκ-11

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTS TRA TGA CCC ART C-3’

Vκ-12

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTK TGA TGA CCC ARA C-3’

Vκ-13

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CBC AGK C-3’

Vκ-14

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TAA CYC AGG A-3’

Vκ-15

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CCC AGW T-3’

Vκ-16

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CAC AAC C-3’

Vκ-17

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTT TGC TGA CTC AGT C-3’

Vκ3’下游引物

VκR1

5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT KAT TTC CAG YTT GGT CCC-3’

VκR2

5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC-3’

VκR3

5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’

VH5’上游引物

VH 1

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR MAG CTT CAG GAG TC-3’

VH 2

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTB CAG CTB CAG CAG TC-3’

VH 3

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG CTG AAG SAS TC-3’

VH 4

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC-3’

VH 5

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAG CTB CAG CAR TC-3’

VH 6

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAR CTG CAG CAG TC-3’

VH 7

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAC GTG AAG CAG TC-3’

VH 8

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAS STG GTG GAA TC-3’

VH 9

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AWG YTG GTG GAG TC-3’

VH 10

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG SKG GTG GAG TC-3’

VH 11

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAM CTG GTG GAG TC-3’

VH 12

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG CTG ATG GAR TC-3’

VH 13

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAR CTT GTT GAG TC-3’

VH 14

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR AAG CTT CTC GAG TC-3’

VH 15

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAR STT GAG GAG TC-3’

VH 16

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTT ACT CTR AAA GWG TST G-3’

VH 17

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAACTV CAG CAR CC-3’

VH 18

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAC TTG GAA GTG TC-3’

VH 19

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG GTC ATC GAG TC-3’

VH 3’下游引物

VH R1

5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT-3’

VH R2

5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT-3’

VH R3

5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT-3’

VH R4

5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT-3’

将Vκ 5’上游引物、Vκ 3’下游引物、VH 5’上游引物，VH 3’下游引物各溶为终浓度100pmol/ul，然后均以1：1体积比例混匀，分别扩增VH、VL基因，扩增条件为95℃ 4分钟，95℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环；最后72℃延伸10分钟，电泳结果示VH基因351bp的条带，VL基因336bp的条带(见图2)，回收、纯化扩增的基因片段，连至pMD-18T载体，转化大肠杆菌Top10F’，测序后获得轻链、重链可变区序列，序列如下：

其中VH的核苷酸序列为：

GTG AAG CTG GTG GAG TCA GGA CCT GGC CTA GTG CAG CCC TCA CAG AGC CTG TCC ATC ACC TGC

ACA GTC TCT GGT TTC TCA TTA ACT AGC CAT GGT GTA CAC TGG GTT CGC CAG TCT CCA GGA AAG

GGT CTG GAG TGG CTG GGA GTG ATA TGG AGT GGT GGA AGC ACA GAC TAT AAT GCA GCT TTC ATA

TCC AGA CTG AGC ATC AGC AAG GAC AAT TCC AAG AGC CAA GTT TTC TTT AAA ATG AAC AGT CTG

CAA GCT AAT GAC ACA GCC ATA TAT TAC TGT GCC AGA AAT AGG AGG GGG TAC TAT GCT ATG GAC

TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA

VL的核苷酸序列为：

GAC ATT GTG ATG ACA CAG TCT GCA TTC TCC AAT CCA GTC ACT CTT GGA ACA TCA GCT TCC ATC

TCC TGC AGG TCT AGT AAG AGT CTC CTA CAT AGT AAT GGC ATC ACT TAT TTG TAT TGG TAT CTG

CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCT CAG CTC CTG ATT TAT CAG ATG TCC AAC CTT GCC TCA GGA GTC

CCA GAC AGG TTC AGT AGC AGT GGG TCA GGA ACT GAT TTC ACA CTG AGA ATC AGC AGA GTG GAG

GCT GAG GAT GTG GGT GTT TAT TAC TGT GCT CAA AAT CTA GAA CTT CCT CTC ACG TTC GGT GCT

GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA

2)嵌合Fab片段的扩增：

根据上述测序正确的序列分别设计扩增单链抗体的V_H、V_L4条寡聚核苷酸引物，分别扩增VH、VL片段，轻链可变区(VL)的上游引物为VLF：5′-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGACATTGTGATGACACAGTC-3’，下游引物为VLR：5′-AGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3′，在VLF的5′端引入了SfiI的酶切识别位点即下划线部分序列，VLR的5′端引入了与人IgG₁的Cκ上游引物5′端互补的21个碱基即斜体部分序列，以利于鼠源性抗VEGFR-2抗体的VL与人IgG₁的Cκ片段的重叠PCR扩增；重链可变区(VH)的上游引物为VHF：5′-GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCTCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3′，下游引物为VHR：5′-CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3′，在VHF的5′端引入了和人IgG₁的Cκ下游引物互补的21个碱基序列即斜体部分序列，VHR的5′端引入了和人IgG₁的CH₁上游引物互补的21个碱基序列，即斜体部分，以利于抗VEGFR-2抗体的VH与人IgG₁的CH₁片段的重叠PCR扩增。

(1)人IgG₁抗体的CH₁和Cκ段的扩增：

以质粒pComb3XTT为模板，分别扩增人IgG₁抗体的Cκ和CH₁核苷酸片段；Cκ段的上游引物为CκF：5′-CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC-3′，下游引物为CκR：5′-GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC-3′；CH₁的上游引物为CH₁F：5′-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3′，下游引物为CH₁R：AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3′。扩增条件均为95℃ 4分钟；95℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环；72℃延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳，分别扩增出约393bp、321bp的条带(见图3)，胶回收纯化扩增条带，溶于去离子水内，-20℃冻存备用；

(2)嵌合L链、Fd段基因片段的扩增：

以鼠源性抗VEGFR-2抗体的VL及人IgG₁抗体的Cκ的PCR扩增产物为模板，用上游引物LF：5′-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGACATTGTGATGACACAGTC-3′和下游引物LR：5′-GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC-3′进行重叠延伸PCR扩增嵌合L链，扩增条件为95℃，4分钟；95℃，30秒、56℃，30秒、72℃，30秒，30个循环；72℃，10延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳，扩增出约657bp的条带，胶回收扩增条带，溶于去离子水内，-20℃冻存备用。

以鼠源性抗VEGFR-2抗体的VH及人IgG₁抗体的CH₁的PCR扩增产物为模板，用上游引物FdF：5′-GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCTCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3′和下游引物FdR：5′-AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3′进行重叠延伸PCR扩增嵌合Fd片段(见图4)，扩增条件为95℃，4分钟；95℃，30秒、56℃，30秒、72℃，30秒，30个循环；72℃，10延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳，扩增出约744bp的条带(见图4)，胶回收扩增条带，溶于去离子水内，-20℃冻存备用。

(3)嵌合Fab基因片段的扩增：

以扩增获得的嵌合Fd段和L链核苷酸序列的胶回收纯化产物为模板，用上游引物FabF：5′-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGACATTGTGATGACACAGTC-3′和下游引物FabR：5′-AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3′进行重叠延伸PCR扩增，扩增时，先不加引物，95℃ 4分钟；94℃ 30秒、45℃ 30秒、72℃ 90秒，8个循环；而后加入FabF、FabR引物后94℃30秒、56℃ 30秒、72℃ 90秒，22个循环；72℃延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳扩增出约1.5kb的条带，见图5，胶回收纯化扩增条带，溶于去离子水内，-20℃冻存备用。

3)嵌合Fab原核表达载体的构建和鉴定：

采用pComb3XSS质粒，质粒及Fab片段的PCR胶回收产物用SfiI限制性内切酶在50℃酶切12-16h，电泳后胶回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水中。取pComb3XSS、Fab扩增产物的酶切产物按1：4摩尔比混匀，在同一离心管内用T4连接酶16℃连接12-16h。

将连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10F′，涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，置37℃12-16h；次日随机挑取转化菌及空质粒转化对照菌，37℃摇菌5小时后，分别用Fab的特异引物对对菌液进行PCR扩增鉴定，含有插入Fab片段质粒的菌株扩增出一条约1.5kb左右的条带；菌液PCR验证扩增出大小正确条带的菌液送生物公司进行测序，DNA序列分析证实在重组质粒中含有构建的嵌合Fab片段，序列正确，其中横线部分ATG AAA TAC CTA TTG CCTACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC为前导序列pelB，TAG为嵌合Fd链、L链翻译终止密码子，GCC AGA GCG GCC、GGC CAG GCC GGC为连接嵌合Fab抗体片段基因和载体pComb3XSS的SfiI酶切位点，GAG CTC为载体pComb3XSS的SacI酶切位点，CAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT GGC GCA TAC CCG TAC GAC GTT CCG GAC TAC GCT TCT为载体pComb3XSS上序列含His标签，ACT AGT为SpeI酶切位点，C TAG A为XbaI酶切位点，CTC GAG为XhoI酶切位点；

GCC AGA GCG GCC GAG CTC GAC ATT GTG ATG ACA CAG TCT GCA TTC TCC AAT CCA GTC ACTCTT GGA ACA TCA GCT TCC ATC TCC TGC AGG TCT AGT AAG AGT CTC CTA CAT AGT AAT GGC ATCACT TAT TTG TAT TGG TAT CTG CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCT CAG CTC CTG ATT TAT CAG ATGTCC AAC CTT GCC TCA GGA GTC CCA GAC AGG TTC AGT AGC AGT GGG TCA GGA ACT GAT TTC ACACTG AGA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT GTG GGT GTT TAT TAC TGT GCT CAA AAT CTA GAACTT CCT CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCTGTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTGCTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCGGGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGCACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CATCAG GGC CTG AGC TTG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAG TTC TAG ATA ATTAAT TAG GAG GAA TTT AAA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTCGCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG CTG GTG GAG TCA GGA CCT GGC CTA GTG CAGCCC TCA CAG AGC CTG TCC ATC ACC TGC ACA GTC TCT GGT TTC TCA TTA ACT AGC CAT GGT GTACAC TGG GTT CGC CAG TCT CCA GGA AAG GGT CTG GAG TGG CTG GGA GTG ATA TGG AGT GGT GGAAGC ACA GAC TAT AAT GCA GCT TTC ATA TCC AGA CTG AGC ATC AGC AAG GAC AAT TCC AAG AGCCAA GTT TTC TTT AAA ATG AAC AGT CTG CAA GCT AAT GAG ACA GCC ATA TAT TAC TGT GCC AGAAAT AGG AGG GGG TAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCAGCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGCACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AACTCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TACTCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AACGTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAAACT AGT GGC CAG GCC GGC CAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT GGC GCA TAC CCG TAC GAC GTT CCGGAC TAC GCT TCT TAG

构建的重组质粒表达嵌合的L链及Fd段重组的嵌合Fab片段，两者之间前导肽序列pelB翻译的22个氨基酸连接，翻译的蛋白片段分泌至细菌周质腔时前导肽pelB被剪切，嵌合L链和Fd段通过链间二硫键连接。嵌合L链的氨基酸序列为：

Glu Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala

Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp

Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg

Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu ThrPhe

Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys ter Phe ter

嵌合Fd段的氨基酸序列为：

Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys

Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser His Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys

Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu

Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Arg Gly Tyr Tyr Ala Met Asp

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His

His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser ter

将含有正确重组质粒的菌液按1：100转入2ml SB溶液中，氨苄青霉素工作浓度为l00μg/ml，葡萄糖终浓度为4％，37℃摇菌过夜；过夜的细菌10000g离心15分钟，弃去上清液，而后用2ml SB溶液重悬，将重悬后的菌液按1：100转入2ml含100μg/ml氨苄青霉素的SB溶液中，37℃培养OD 600＝1.0左右，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，蔗糖终浓度至4％，23℃振荡培养20h。离心收集菌体，分别处理培养上清、菌体超声上清及超声沉淀，进行SDS-PAGE及western-blot检测，结果嵌合Fab片段在培养上清、菌体超声上清及超声沉淀中均有表达，其中可溶性蛋白主要是在菌体超声上清中，嵌合Fd段分子量约为29kDa，嵌合L链分子量约为24kDa，而对照菌TOP10F′中无目的蛋白条带(见图6)。

4)表达蛋白的纯化

细菌大量诱导表达后菌液10000g离心15分钟，弃培养上清，沉淀中加入原菌液1/10体积的20mM磷酸盐平衡缓冲液(含0.5M/L NaCl，10mM咪唑)，将细菌重悬；而后对菌液进行超声，超10秒，停10秒，共超90次，而后4℃ 12000rpm离心30分钟，弃沉淀，超声上清用0.22μm滤膜过滤，然后用5ml Histrap HP柱子进行纯化。先用用5倍柱体积的水以2.5ml/min的速度洗柱子，而后用至少10倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，然后以2ml/min的速度上样；用平衡缓冲液平衡镍柱至基线，分别用5倍柱体积的含50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM咪唑的缓冲液洗柱子，并收集相应浓度咪唑的洗脱液，进行12％SDS-PAGE电泳，观察蛋白纯化情况(见图7)。结果含400mM咪唑的洗脱液中见纯化的Fab蛋白，用10KD的millpore超滤柱子进行除盐浓缩，PBS洗3次。

实施例2  嵌合Fab抗体片段的活性鉴定：

I酶联免疫法：用含0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6的包被液稀释重组人VEGFR-2蛋白，该蛋白购自美国R&D公司，产品编号357-KD-050。重组人VEGFR-2蛋白以2μg/ml的浓度包被96孔ELISA板，每孔加入100μl，4℃过夜；PBST洗涤后，用5％脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭，37℃孵育2h；PBST洗涤5次后，每个孔中加入100μl抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段，以200μg/ml起始浓度，11个浓度梯度稀释，4℃过夜；以1：5000稀释的羊抗人Fab第二抗体100μl/孔加入到孔内，37℃孵育1h；过氧化物酶底物显色液100μl/孔，室温下15分钟后用2M硫酸中止反应，上机检测比色采用双波长450nm/630nm。结果嵌合Fab抗体片段能与重组人VEGFR-2蛋白起抗原抗体ELISA反应，见图8。

II免疫印迹法：高表达VEGFR-2的人脐内皮静脉细胞(HUVEC)、低或无表达VEGFR-2的小鼠成纤维(NIH3T3)细胞总蛋白为天然抗原。细胞分别培养至1×10⁷，4℃条件下去除培养基用PBS清洗，用500μlRIPA裂解液充分裂解细胞，10000g离心5分钟取上清及细胞总蛋白，测定各细胞总蛋白的浓度。将各细胞总蛋白浓度制成1mg/ml相等浓度后分装冻存-20℃备用。

将HUVEC、NIH3T3细胞总蛋白进行10％SDS-PAGE电泳并电转到硝酸纤维膜上，将此膜与50μg/ml的抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段和1：2000稀释的内参抗体β-actin同时37℃孵育2h，PBST洗涤间隔5分钟4次，羊抗人Fab二抗37℃孵育1h，DAB显色结果，HUVEC总蛋白泳道从上向下出现一粗亮条带、三暗条带，分别依次对应于VEGFR-2蛋白三条带230kDa、200kDa、150kDa及内参β-actin条带；NIH3T3细胞总蛋白泳道则仅出现43kDa的内参β-actin条带，见图9。

III流式细胞术：采用流式细胞仪分析抗VEGFR-2抗体人鼠嵌合Fab抗体片段与VEGFR-2天然抗原的结合活性。具体方法为，分别将2×10⁶个HUVEC和NIH3T3细胞用含0.1％多聚甲醛PBS固定细胞半小时后无菌预冷4℃的PBS冲洗三遍，分别用抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段，60μg/ml和120μg/ml两个不同浓度共孵育4℃过夜，PBS洗三遍后加入羊抗人Fab罗丹明荧光二抗，避光室温孵育2小时后PBS洗三遍，含0.1％多聚甲醛PBS400μl重悬，在流式细胞仪上进行免疫荧光分析并测定平均荧光强度，以只加二抗为本底，结果60μg/ml和120μg/ml两个不同浓度的抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段与HUVEC结合率分别为34.46％和35.16％；同样浓度的抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段与NIH3T3细胞结合率分别为14.06％和16.26％，见图10。

以上结果显示，抗VEGFR-2抗体人鼠嵌合Fab抗体片段能与VEGFR-2抗原结合，说明该嵌合Fab片段保留了原抗VEGFR-2抗体具备的抗体性质和特异性。

抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段核苷酸及蛋白序列表

<110>中国人民解放军南京军区军事医学研究所，南京医科大学

<120>抗VEGFR-2抗体嵌合Fab抗体片段及其制备方法、应用

<160>3

<210>1

<211>1483

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mis-feature

<222><1>…<12>

<223>连接嵌合Fab抗体片段基因和载体pComb3XSS的SfiI酶切位点

<220>

<221>mis-feature

<222><13>…<18>

<223>载体pComb3XSS上SacI酶切位点

<220>

<221>V__region

<222><19>…<354>

<223>鼠源性抗VEGFR-2抗体轻链可变区基因片段序列

<220>

<221>C__region

<222><355>…<675>

<223>人抗体IgG1轻链恒定区Cκ基因片段序列

<220>

<221>mis-feature

<222><676>…<678>

<223>轻链基因片段翻译的终止密码子

<220>

<221>mis-feature

<222><679>…<708>

<223>嵌合Fab片段轻链和Fd基因片段重叠延伸的核苷酸序列，含核糖体结合位点。

<220>

<221>mis-feature

<222><670>…<674>

<223>载体pComb3XSS上XbaI酶切位点

<220>

<221>mis-feature

<222><709>…<774>

<223>为使抗VEGFR-2抗体Fab中的Fd可溶性表达增加的pelB信号肽序列，将在蛋白分泌至周质腔时被剪切。

<220>

<221>mis-feature

<222><775>…<780>

<223>载体pComb3XSS上XhoI酶切位点

<220>

<221>V__region

<222><781>…<1131>

<223>鼠源性抗VEGFR-2抗体重链可变区基因片段序列

<220>

<221>C__region

<222><1132>…<1446>

<223>人抗体IgG1重链恒定区CH1基因片段序列

<220>

<221>mis-feature

<222><1447>…<1452>

<223>载体pComb3XSS上SpeI酶切位点

<220>

<221>mis-feature

<222><1453>…<1464>

<223>连接嵌合Fab抗体片段基因和载体pComb3XSS的SfiI酶切位点

<220>

<221>mis-feature

<222><1465>…<1521>

<223>载体pComb3XSS上序列，含His标签

<220>

<221>mis-feature

<222><1522>…<1524>

<223>载体pComb3XSS上的琥珀酸终止子

<400>1

GCC AGA GCG GCC GAG CTC GAC ATT GTG ATG ACA CAG TCT GCA TTC TCC AAT CCA GTC ACT  60

                Glu Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr

                  1               5                  10                 15

CTT GGA ACA TCA GCT TCC ATC TCC TGC AGG TCT AGT AAG AGT CTC CTA CAT AGT AAT GGC  120

Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly

             20                  25                  30                  35

ATC ACT TAT TTG TAT TGG TAT CTG CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCT CAG CTC CTG ATT TAT  180

Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr

             40                 45                  50                  55

CAG ATG TCC AAC CTT GCC TCA GGA GTC CCA GAC AGG TTC AGT AGC AGT GGG TCA GGA ACT  240

Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr

             60                 65                  70                  75

GAT TTC ACA CTG AGA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT GTG GGT GTT TAT TAC TGT GCT  300

Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala

             80                  85                  90                  95

CAA AAT CTA GAA CTT CCT CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGA ACT  360

Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr

            100                 105                 110                 115

GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT  420

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

            120                 125                 130                 135

GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG  480

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys

            140                 145                 150                 155

GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG  540

Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

            160                 165                 170                 175

GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC  600

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

            180                 185                 190                 195

AAA GTa TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TTG CCC GTC ACA AAG AGC TTC  660

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu Pro Val Thr Lys Ser Phe

            200                 205                 210                 215

AAC AGG GGA GAG TGT TAG TTC TAG ATA ATT AAT TAG GAG GAA TTT AAA ATG AAA TAC CTA  720

Asn Arg Gly Glu Cys ter Phe ter

            220             224

TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG  780

GTG AAG CTG GTG GAG TCA GGA CCT GGC CTA GTG CAG CCC TCA CAG AGC CTG TCC ATC ACC  840

Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu SerIle Thr

  1               5                  10                  15                 20

TGC ACA GTC TCT GGT TTC TCA TTA ACT AGC CAT GGT GTA CAC TGG GTT CGC CAG TCT CCA  900

Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser His Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro

                 25                  30                  35                 40

GGA AAG GGT CTG GAG TGG CTG GGA GTG ATA TGG AGT GGT GGA AGC ACA GAC TAT AAT GCA  960

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala

                 45                  50                  55                 60

GCT TTC ATA TCC AGA CTG AGC ATC AGC AAG GAC AAT TCC AAG AGC CAA GTT TTC TTT AAA  1020

Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys

                 65                  70                  75                  80

ATG AAC AGT CTG CAA GCT AAT GAC ACA GCC ATA TAT TAC TGT GCC AGA AAT AGG AGG GGG  1080

Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Arg Gly

                 85                  90                  95                 100

TAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC  1140

Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

                105                 110                 115                 120

AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG  1200

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

                125                 130                 135                 140

GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA  1260

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

                145                 150                 155                 160

GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC  1320

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

                165                 170                 175                 180

TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC  1380

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

                185                 190                 195               200

AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT  1440

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

                205                 210                 215                 220

GAC AAA ACT AGT GGC CAG GCC GGC CAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT GGC GCA TAC CCG TAC  1500

Asp Lys Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr

                225                 230                 235                 240

GAC GTT CCG GAC TAC GCT TCT TAG  1524

Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser ter

                245         248

<210>2

<211>224

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>抗VEGFR-2抗体的嵌合轻链(L段)，即抗VEGFR-2抗体的轻链可变区与人IgGl轻链恒定区Cκ重组后形成的融合蛋白，全长224个氨基酸。

<400>2

Glu Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Phe Ser Asn Pro Val

  1               5                  10                  15

Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser

                 20                  25                 30

Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln

                 35                  40                 45

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn

                 50                  55                  60

Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly

                 65                  70                  75

Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala GluAsp Val

                 80                  85                  90

Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe

                 95                 100                 105

Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

                110                 115                 120

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

                125                 130                 135

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

                140                 145                 150

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

                155                 160                 165

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

                170                 175                 180

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

                185                 190                 195

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu

                200                 205                 210

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys ter Phe ter

                215                 220             224

<210>3

<211>248

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>抗VEGFR-2抗体的嵌合重链(Fd段)，即抗VEGFR-2抗体的重链可变区与人IgG1重链恒定区CH1重组后形成的融合蛋白，全长248个氨基酸。

<400>3

Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

  1               5                  10                  15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser

                 20                  25                  30

His Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu

                 35                  40                  45

Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala

                 50                  55                  60

Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser

                 65                  70                  75

Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala

                 80                  85                  90

Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Arg Gly Tyr Tyr Ala Met Asp

                 95                 100                 105

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

                110                 115                 120

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

                125                 130                 135

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

                140                 145                 150

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

                155                 160                 165

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

                170                 175                 180

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

                185                 190                 195

GlnThr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

                200                 205                 210

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser Gly

                215                 220                 225

Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr

                230                 235                 240

Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser ter

                245         248