牛血清白蛋白传感器检测、吸附水中重金属离子的方法

摘要

一种牛血清白蛋白传感器检测、吸附水中重金属离子的方法，属于生物－无机杂化技术领域。将牛血清白蛋白与水滑石纳米片自组装制备牛血清白蛋白传感器，牛血清白蛋白分子含有丰富的荧光发射基团如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，重金属离子导致牛血清白蛋白的荧光发生猝灭，牛血清白蛋白的荧光强度变化与固定的重金属离子的量成线性关系；随着水体中重金属离子浓度的增加，牛血清白蛋白分子的荧光发生有规律的猝灭，牛血清白蛋白荧光强度的变化与水体中重金属离子的初始浓度呈现良好的线性关系。在1－100ppm的重金属离子浓度范围内，牛血清白蛋白传感器能对水体中的重金属离子实现实时在线检测及吸附。

说明书

技术领域

本发明属于生物-无机杂化技术领域，特别是涉及一种牛血清白蛋白传感器检测、吸附水中重金属离子的方法。

背景技术

基于活性生物分子与无机纳米材料组装得到的生物-无机纳米杂化材料同时具有二者的独特性质，已成为生命科学、材料科学及纳米科学等领域的研究热点。以无机材料为出发点，无机—生物杂化材料主要体现在以下三个方面：(1)基于零维的纳米粒子形成的无机—生物杂化材料。半导体纳米粒子如(CdS，CdSe，ZnS，TiO₂等)或金属纳米粒子(如Au)可与酶、抗原、抗体或核酸如DNA等蛋白质偶联实现功能化，也可在生物活性分子诱导下组装成某种排列结构，功能化的纳米粒子可控制生物分子的活性、反应性或识别能力，无机纳米颗粒与生物分子在溶液或基质表面形成的二维或三维组装体可望作为生物传感器、生物电子器件等得到应用；(2)基于一维的碳纳米管和三维的介孔材料形成的无机—生物杂化材料。单壁碳纳米管(SWNT)作为纳米材料的重要单元在电子、光学、热量传输和生物传感等领域具有广阔的应用前景；(3)基于纳米颗粒和—维的碳纳米管以及三维的介孔材料组装得到的杂化材料具有一定的局限性，尤其是活性生物分子为酶分子时，酶分子不能充分地与反应物分子接触，导致活性和利用率下降。针对上述局限性，近年来二维纳米材料即层状材料(如d-磷酸锆、层状钛酸盐、水滑石)与生物分子的组装受到越来越多的关注。与上述提到的半导体或金属纳米颗粒不同，层状材料与生物分子的组装可通过主客体之间的离子键、氢键、憎水作用等形式实现，因而避免了共价作用形式所需要的苛刻反应条件，更有利于保持生物分子特有的结构和生物活性。

蛋白质是由20多种氨基酸共价连接而成、具有特定三维结构、高分子量的多肽。所以把多肽作为认识蛋白质的起点是合适的。一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽(peptide)。组成肽链的氨基酸单元称为氨基酸残基。蛋白质分子中氨基酸残基的排列方式和连接顺序就是蛋白质的化学结构(一级结构)。肽分子中含有两个氨基酸残基时称为二肽，肽分子中含有多个氨基酸残基时则称为多肽。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。蛋白质有一个引人注目的特征，就是它们都具有确定的三维结构。虽然蛋白质分子是由氨基酸首尾相连的多肽链组成，但一个伸展开来或随机排布的多肽链并无生物活性。蛋白质的功能来自其特定的构象，即原子在一个结构中的三维排列方式。蛋白质由氨基酸结合而成，结合方式是通过肽键结合而成肽链，再由一个或多个肽链按各自特殊的方式结合成为蛋白质分子。

牛血清白蛋白是血液的主要成分(38g/100ml)，由于具有纯度高，价格便宜，商业易得等特点，常常作为标准蛋白质研究。牛血清白蛋白由三个氨基酸区域组成，每个氨基酸区域包含两个亚域，一个BSA分子由583个氨基酸组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基，分子量68kD，等电点4.8，含氮量16％，含糖量0.08％，仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2％。游离的BSA分子结构以a-helix为主，三维尺寸为4*4*14nm，分子量为66KD，等电点是4.9，是一种酸性蛋白质。与所有蛋白质一样，牛血清白蛋白分子的大小以及表面的电荷分布随蛋白质溶液pH值的变化而变化，因此可以调节缓冲溶液的pH值，将牛血清白蛋白阴离子化或者是阳离子化。在中性(pH＝7.4)蛋白质溶液中，牛血清白蛋白呈扁形椭圆体，表面电荷以负电荷为主，主要分布在氨基一区和氨基二区。牛血清白蛋白的单肽链中的134和213位色氨酸残基(w)；30，84，137，139，147，149，155，156，160，262，318，331，333，340，352，369，400，410，451，496位的20个酪氨酸残基(Y)；11，19，27，36，49，70，102，126，133，148，164，205，222，227，308，325，329，373，394，487，501，506，508，550，553，56726个苯丙氨酸残基。

无机—生物杂化材料很好的结合了无机纳米材料和活性生物分子两者的特性和优点，要想充分发挥活性生物分子的生物活性，选择合适的无机主体成为了制备性能优异无机—生物杂化材料的关键问题。水滑石(LDH)是一种阴离子粘土，其基本构造单元是八而体，八面体中心是金属离子，六个顶角是氢氧根离子，相邻八面体之间靠共用边相互联结成二维延续的配位八面体结构层，单元层以面一面堆叠形成晶体颗粒构成层状结构，决定了它多以片状形态存在。水滑石结构中类水滑石层板由共边的M(OH)₆八面体构成，部分二价金属离子被三价金属离子取代产生多余的正电荷，使得LDH带正电荷，晶体结构中多余的正电荷由层间阴离子平衡以维持整个分子的电中性，层间通道中的阴离子是可交换的水滑石由于主体层板的化学组成、电荷密度、晶粒形态和尺寸均可以在一定范围内调控等特性恰好可以解决上述存在的问题，为LDHs-生物杂化材料的设计提供了较大的设计空间。另外，水滑石作为一类阴离子型层状材料，可以在水中剥离从而得到单层层板，这样分子尺寸较大的生物活性分子就能够与LDHs组装得到LDHs-生物杂化材料，实现生物分子的应用。

重金属指比重大于4或5的金属，约有45种，如铜、铅、锌、铁、钴、镍、钒、铌、钽、钛、锰、镉、汞、钨、钼、金、银等。尽管锰、铜、锌等重金属是生命活动所需要的微量元素，但是大部分重金属如汞、铅、镉等并非生命活动所必须，而且所有重金属超过一定浓度都对人体有毒。从环境污染方面，重金属是指汞、镉、铅、铬及“类金属”-----砷等生物毒性显著的重金属。对人体毒害最大的有5种：铅、汞、铬、砷、镉。这些重金属在水中不能被分解，人饮用后毒性放大，与水中的其他毒素结合生成毒性更大的有机物。重金属一般以天然浓度广泛存在于自然界中，但由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属如铅、汞、镉、钴等进入大气、水、土壤中，引起严重的环境污染。以各种化学状态或化学形态存在的重金属，在进入环境或生态系统后就会存留、积累和迁移，造成危害。如随废水排出的重金属，即使浓度小，也可在藻类和底泥中积累，被鱼和贝类的体表吸附，产生食物链浓缩，从而造成公害。如日本的水俣病，就是因为烧碱制造工业排放的废水中含有汞，在经生物作用变成有机汞后造成的；又如痛病，是由炼锌工业和镉电镀工业所排放的镉所致。汽车尾气排放的铅经大气扩散等过程进入环境中，造成目前地表铅的浓度已有显著提高，致使近代人体内铅的吸收量比原始人增加了约100倍，损害了人体健康。重金属污染的特点表现在以下几方面：

(1)水体中的某些重金属可在微生物作用下转化为毒性更强的金属化合物，如汞的甲基化作用就是其中典型例子；

(2)生物从环境中摄取重金属可以经过食物链的生物放大作用，在较高级生物体内成千万倍地富集起来，然后通过食物进入人体，在人体的某些器官中积蓄起来造成慢性中毒，危害人体健康；

(3)在天然水体中只要有微量重金属即可产生毒性效应，一般重金属产生毒性的范围大约在1—l0mg/L之间，毒性较强的金属如汞、镉等产生毒性的质量浓度范围在0.01—0.001mg/L之间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛血清白蛋白传感器检测、吸附水中重金属离子的方法。用牛血清白蛋白传感器能对水体中的重金属离子实现实时检测及吸附，解决了重金属污染一直是困扰人类的一个难题；因为重金属可以通过呼吸、食物链、皮肤接触等方式进入人体，由于重金属不能生物降解，人体中的重金属不断富集，对人体的健康乃至生命安全构成严重威胁。

牛血清白蛋白分子含有丰富的荧光发射基团如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，重金属离子导致牛血清白蛋白的荧光发生猝灭，牛血清白蛋白的荧光强度变化与固定的重金属离子的量成线性关系；随着水体中重金属离子浓度的增加，牛血清白蛋白分子的荧光发生有规律的猝灭，牛血清白蛋白荧光强度的变化与水体中重金属离子的初始浓度呈现良好的线性关系。依据上述线性关系实现对水体中重金属离子的检测与吸附。所述水滑石为乳酸根插层镁铝水滑石，蛋白质为牛血清白蛋白(第五组分)。

本发明是将牛血清白蛋白与水滑石纳米片自组装制备牛血清白蛋白传感器，用牛血清白蛋白传感器检测、吸附水中的重金属离子。工艺步骤为：

(1)水滑石纳米片的制备：将3.7513g的Al(NO₃)₃·9H₂O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO₃)₂·6H₂O)溶于60mL去离子水中，配制成Mg/Al为2/1的盐溶液。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中，调节体系的pH值6-11；加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值6-11，加热至回流并晶化7-12小时，得到白色浆液，离心分离，洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石白色浆液洗涤至中性后，在一定体积水中分散，加热回流至剥离。所制备的乳酸根插层镁铝水滑石具有高度结晶的晶体结构，在水中分散剥离得到水滑石纳米片。

(2)牛血清白蛋白传感器的制备

a、缓冲溶液的配制：配制0.2mol/L的磷酸氢二钠和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，以此配制pH5.0-9.0的缓冲溶液，用于溶解牛血清白蛋白；

b、调节牛血清白蛋白溶液的pH5.0-9.0，配制浓度为0.5-3mg/ml的蛋白质溶液，组装前牛血清白蛋白溶解30-120分钟；

c、将牛血清白蛋白溶液与水滑石纳米片混合，15-40℃的条件下自组装30-120分钟后，将处理过的基底浸渍在组装体系中15-40分钟，清洗干燥；在低至40ppb的浓度范围内，牛血清白蛋白传感器能对重金属离子实现定性检测，在1-100ppm以上的浓度范围内，牛血清白蛋白传感器能对水体中的重金属离子实现实时检测及吸附；

d、将处理过的基底交替浸渍到水滑石纳米片和牛血清白蛋白溶液中各15-30分钟，中间取出水洗并干燥，制得的牛血清白蛋白传感器在水体中稳定。

(3)牛血清白蛋白传感器与重金属离子反应

a、配制浓度为0.01-100ppm的重金属离子溶液，将牛血清白蛋白传感器与重金属离子溶液反应30-120分钟；

b、计算牛血清白蛋白传感器对重金属离子的吸附量，关联荧光强度变化与重金属离子的量；

c、表征反应后的牛血清白蛋白的荧光光谱强度，关联荧光强度变化与重金属离子的初始浓度；所制备的牛血清白蛋白传感器能对水体中痕量的重金属离子实现在线检测及吸附。

本发明的牛血清白蛋白传感器对水体中40ppb的重金属离子能够实现定性检测，在1-100ppm重金属离子浓度范围内，牛血清白蛋白传感器对水体中的重金属离子能够实现在线实时检测及吸附，具有潜在的应用价值。

本发明的优点在于，用的牛血清白蛋白传感器能够对水体中的重金属离子实现实时检测及吸附，同时制备工艺简单，不需要复杂的设备，成本低廉，具有实际应用的价值。

附图说明

图1为牛血清白蛋白的荧光光谱强度随水体中重金属离子浓度的增加有规律的猝灭。

具体实施方式

实施例1

a、将3.7513g的Al(NO₃)₃·9H₂O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO₃)₂·6H₂O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中，调节体系的pH值6-11；加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值6-11，加热至回流并晶化7-12小时，得到白色浆液，离心分离，洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后，在一定体积水中分散，加热回流至剥离；

b、在pH6.0的条件下，配制浓度为2mg/ml牛血清白蛋白溶液30ml，加入10ml水滑石纳米片，组装1h；

c、将处理过的基底浸渍到上述反应体系中30分钟，取出水洗并干燥，得到牛血清白蛋白传感器；

d、将牛血清白蛋白传感器与系列浓度的重金属溶液反应，表征反应前后杂化膜的光谱特征及对重金属离子的吸附能力。

实施例2

a、将3.7513g的Al(NO₃)₃·9H₂O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO₃)₂·6H₂O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中，调节体系的pH值6-11；加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值6-11，加热至回流并晶化7-12小时，得到白色浆液，离心分离，洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后，在一定体积水中分散，加热回流至剥离；

b、在pH7.0的条件下，配制浓度为1.5mg/ml牛血清白蛋白溶液30ml，加入10ml水滑石纳米片，组装1h；

c、将处理过的基底浸渍到上述反应体系中30分钟，取出水洗并干燥，得到牛血清白蛋白传感器；

d、将牛血清白蛋白传感器与系列浓度的重金属溶液反应，表征反应前后杂化膜的光谱特征及对重金属离子的吸附能力。

实施例3

a、将3.7513g的Al(NO₃)₃·9H₂O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO₃)₂·6H₂O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中，调节体系的pH值6-11；加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值6-11，加热至回流并晶化7-12小时，得到白色浆液，离心分离，洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后，在一定体积水中分散，加热回流至剥离；

b、在pH5.0的条件下，配制浓度为3mg/ml的牛血清白蛋白溶液；

c、将处理过的基底浸渍到50ml水滑石纳米片中30分钟，取出水洗并干燥；

d、将上述预铺了一层水滑石薄膜的基片浸渍到2mg/ml的牛血清白蛋白溶液中30分钟，取出水洗并干燥；

e、重复c和d步骤，制备牛血清白蛋白传感器

f、将牛血清白蛋白传感器与系列浓度的重金属溶液反应，表征反应前后杂化膜的光谱特征及对重金属离子的吸附能力。

实施例4

a、将3.7513g的Al(NO₃)₃·9H₂O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO3)₂·6H₂O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中，调节体系的pH值6-11；加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值6-11，加热至回流并晶化7-12小时，得到白色浆液，离心分离，洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后，在一定体积水中分散，加热回流至剥离；

b、在pH7.0的条件下，配制浓度为1.5mg/ml的牛血清白蛋白溶液；

c、将处理过的基底浸渍到50ml水滑石纳米片中30分钟，取出水洗并干燥；

d、将上述预铺了一层水滑石薄膜的基片浸渍到3mg/ml的牛血清白蛋白溶液中30分钟，取出水洗并干燥；

e、重复c和d步骤，制备牛血清白蛋白传感器；

f、将牛血清白蛋白传感器与系列浓度的重金属溶液反应，表征反应前后杂化膜的光谱特征及对重金属离子的吸附能力。

实施例5

a、将3.7513g的Al(NO₃)₃·9H₂O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO₃)₂·6H₂O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中，调节体系的pH值6-11；加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值6-11，加热至回流并晶化7-12小时，得到白色浆液，离心分离，洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后，在一定体积水中分散，加热回流至剥离；

b、在pH8.0的条件下，配制浓度为3mg/ml的牛血清白蛋白溶液；

c、将处理过的基底浸渍到50ml水滑石纳米片中20分钟，取出水洗并干燥；

d、将上述预铺了一层水滑石薄膜的基片浸渍到3mg/ml的牛血清白蛋白溶液中30分钟，取出水洗并干燥；

e、重复c和d步骤，制备牛血清白蛋白传感器；

f、将牛血清白蛋白传感器与系列浓度的重金属溶液反应，表征反应前后杂化膜的光谱特征及对重金属离子的吸附能力。