特异性双链RNA结合蛋白嵌合体及其在病毒感染性疾病中的应用

摘要

本发明涉及双链RNA结合蛋白嵌合体在治疗或预防病毒感染性疾病中的应用，特别是涉及四种由双链RNA感受器序列NF90、PACT、ADAR1利PKR组成的蛋白嵌合体在治疗和预防病毒感染性疾病中的一种或多种应用，特异性双链RNA结合蛋白嵌合体，其特征在于将蛋白转导信号，双链RNA感受器和细胞凋亡信号通过DNA重组的方法按以上顺序连接起来，组成特异性双链RNA结合蛋白嵌合体，并分别在原核和真核细胞中表达。特异性双链RNA蛋白嵌合体可用于在病毒感染性疾病中的治疗和预防，在哺乳动物细胞水平上作为蛋白药物治疗工具。

说明书

技术领域

本发明涉及双链RNA结合蛋白嵌合体在治疗或预防病毒感染性疾病中的应用，特别是涉及四种由双链RNA感受器序列NF90、PACT、ADAR1和PKR组成的蛋白嵌合体在治疗和预防病毒感染性疾病中的一种或多种应用。

背景技术

病毒感染是威胁人类生命健康的常见疾病。随着分子病毒学的发展，虽然对病毒感染的机制有了深入的认识，但在临床上由于病毒种类繁多和诊断技术的限制，只有少部分病毒感染能得到确诊和有针对性的治疗。一些严重的病毒感染，如艾滋、SARS、禽流感与Prion病毒感染(海绵样脑病)等，目前缺乏特异性的治疗手段。因此，如能开发研究一种广谱的抗病毒药物，对拯救这部分病人的生命，甚至如艾滋病等会很有价值。

双链RNA(dsRNA)是所有病毒复制过程的一个显著特征。一般来说，双链RNA在哺乳动物细胞复制中不表达，只有在细胞感染病毒后才表达。所以，双链RNA是病毒感染哺乳细胞的分子标记，它代表着病毒感染的一种早期危险信号。研究证实，人类和所有脊椎动物都存在针对双链RNA的先天免疫系统。一般来说，超过30个碱基对的双链RNA就能有效的与其受体(双链RNA结合蛋白，DRBP)作用，引起细胞的抗病毒反应。首先，双链RNA与分布在被激活的双链RNA蛋白激酶(PKR)上的免疫反应性干扰素(IFN)效应蛋白作用，激活IFN介导的抗病毒通路，该通路与PACT/RAX、TRBP、2′，5′寡腺苷酸合成酶、双链RNA特异的腺苷脱氨酶(ADAR)和核因子90(NF90)等DRBP的作用有关。通过这个机制双链RNA能诱导快速抗病毒反应，导致蛋白翻译抑制或凋亡。其次，细胞内双链RNA可与RNA解旋酶RIG-I和MDA-5结合，激活转录蛋白如干扰素调节因子3(IRF3)和NF-κB等，这种激活作用对于RNA病毒诱导的干扰素的产生非常关键。第三，细胞内和细胞外的双链RNA可与Toll样受体3(TLR3)结合，通过IRF3和NF-κB激活IFN转录。总之，宿主细胞可通过一系列的DRBP在病毒感染早期侦测到细胞内外双链RNA的存在，并通过不同的机制引起先天免疫应答。

虽然在进化过程中人类已形成了对细胞内、外双链RNA应答的先天免疫系统，但病毒也进化出了一种回避双链RNA诱导的抗病毒反应的途径。为了存活病毒必须在被感染的宿主中成功复制。研究证实，病毒已经进化形成了多种通路，用来抑制IFN的合成、结合并使分泌的IFN分子失活、阻断IFN活化信号和破坏IFN诱导的抗病毒蛋白的作用。因为双链RNA是IFN反应的一个早期信号，很多病毒已经进化能够编码其自身的DRBP以竞争宿主中的双链RNA受体，如流感病毒的NS1、呼吸道肠道病毒的RS3和痘苗病毒的E3L能有效的竞争PKR或其它双链RNA受体，阻断双链RNA诱导的IFN产生的抗病毒反应；腺病毒和EB病毒都可产生抑制性RNA分子，结合PKR并使其失活。因此，无论宿主或病毒都可通过各种途径对双链RNA产生应答，揭示了双链RNA介导的信号传导作用在病毒感染期间的重要性。由此推测双链RNA介导的信号应该是成功预防和治疗病毒感染的首要目标。

发明内容

本发明的目的是提供一种将蛋白转导信号，双链RNA感受器和细胞凋亡信号通过DNA重组的方法按以上顺序连接起来，组成特异性双链RNA结合蛋白嵌合体，并分别在原核和真核细胞中表达的方法。

提供一种涉及四种不同双链RNA感受器的特异性双链RNA结合蛋白嵌合体。其中双链RNA感受器可以分别是NF90，PACT，ADAR1或PKR中的任一种，可以是其部分或全部双链RNA结合区域。

本发明的另一个目的是所述蛋白嵌合体用于制备抗病毒的药物。

本发明的再一个目的是特异性双链RNA蛋白嵌合体在治疗和预防病毒感染性疾病中的应用。

本发明的目的是这样实现的，特异性双链RNA结合蛋白嵌合体，其特征在于将蛋白转导信号，双链RNA感受器和细胞凋亡信号通过DNA重组的方法按以上顺序连接起来，组成特异性双链RNA结合蛋白嵌合体，并分别在原核和真核细胞中表达。

所述涉及四种不同双链RNA感受器的特异性双链RNA结合蛋白嵌合体，其中双链RNA感受器可以分别是NF90，PACT，ADAR1或PKR中的任一种，可以是其部分或全部双链RNA结合区域。

所述包含蛋白转导信号、细胞凋亡信号和不同双链RNA感受器序列，特异性双链RNA结合蛋白所组成的嵌合体，其cDNA和氨基酸序列如下：

No.1dsCARE(PKR)

cDNA序列：

ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGATGGCTGGTGAT

CTTTCAGCAGGTTTCTTCATGGAGGAACTTAATACATACCGTCAGAAGCAGGGAGTAGTA

CTTAAATATCAAGAACTGCCTAATTCAGGACCTCCACATGATAGGAGGTTTACATTTCAAG

TTATAATAGATGGAAGAGAATTTCCAGAAGGTGAAGGTAGATCAAAGAAGGAAGCAAAA

AATGCCGCAGCCAAATTAGCTGTTGAGATACTTAATAAGGAAAAGAAGGCAGTTAGTCCT

TTATTATTGACAACAACGAATTCTTCAGAAGGATTATCCATGGGGAATTACATAGGCCTTAT

CAATAGAATTGCCCAGAAGAAAAGACTAACTGTAAATTATGAACAGTGTGCATCGGGGGT

GCATGGGCCAGAAGGATTTCATTATAAATGCAAAATGGGACAGAAAGAATATAGTATTGGT

ACAGGTTCTACTAAACAGGAAGCAAAACAATTGGCCGCTAAACTTGCATATCTTCAGATAT

TATCAGAAGAAACCTCAGTGAAATCTGACTACCTGTCCTCTGGTTCCGGTACCATGGATGC

AAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATAGAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACAT

CCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGATTTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGT

AAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCTATGCTGATTAAAATGATACTTAAAAA

AGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACTACATGAAGGATATAAAGATCTTG

CTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA

蛋白序列：

MYARAAARQARASGLEMAGDLSAGFFMEELNTYRQKQGVVLKYQELPNSGPPHDRRFTFQVIID

GREFPEGEGRSKKEAKNAAAKLAVEILNKEKKAVSPLLLTTTNSSEGLSMGNYIGLINRIAQKKRL

TVNYEQCASGVHGPEGFHYKCKMGQKEYSIGTGSTKQEAKQLAAKLAYLQILSEETSVKSDYLS

SGSGTMDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMI

LKKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVV

No2.dsCARE(ADAR1)

cDNA序列：

ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGAAGAACCCCATCAG

CGGGCTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAG

TGGACCACCCCATGAACCTCGATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCCGAGAGTTTCCCCC

AGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAGGATGCAGCTATGAAAGCCATGACAATTC

TGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCACTATTCCACA

GAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTT

TTCTGGGAAGAGCCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCG

AATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGCCCTGCCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAG

TGGGAGCCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAAAGTGGCAAAGCAGATGGCC

GCAGAGGAAGCCATGAAGGCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACCA

GCCTGAAGGTATGATCTCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAG

GAAGATTGGCGAGCTCGTGAGATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACG

CCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTTGGTCGACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGC

CCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGTTCCCAGCCGTCTGCGCACACAGC

AAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCTCTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACG

GTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATAGAGAAGCTCTGGAAAAGGACA

TCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGATTTTTAACAATATCAGAAGAGGA

AAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCTATGCTGATTAAAATGATACTTAA

AAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACTACATGAAGGATATAAAGATCTTG

CTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA

蛋白序列：

MYARAAARQARASGLEKNPISGLLEYAQFASQTCEFNMIEQSGPPHEPRFKFQVVINGREFPPAEA

GSKKVAKQDAAMKAMTILLEEAKAKDSGKSEESSHYSTEKESEKTAESQTPTPSATSFFSGKSPVT

TLLECMHKLGNSCEFRLLSKEGPAHEPKFQYCVAVGAQTFPSVSAPSKKVAKQMAAEEAMKALH

GEATNSMASDNQPEGMISESLDNLESMMPNKVRKIGELVRYLNTNPVGGLLEYARSHGFAAEFKL

VDQSGPPHEPKFVYQAKVGGRWFPAVCAHSKKQGKQEAADAALRVLIGENGTMDAKARNCLLQ

HREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMILKKDNDSYVSFYNALL

HEGYKDLAALLHDGIPVV

No3.dsCARE(PACT)

cDNA序列：

ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGAGCGATTACGACATC

CCCACTACTGAGAATCTTTATTTTCAGGGATCCTCCCAGAGCAGGCACCGCGCCGAGGCCCCG

CCGCTGGAGCGCGAGGACAGTGGGACCTTCAGTTTGGGGAAGATGATAACAGCTAAGCCAGG

GAAAACACCGATTCAGGTATTACACGAATACGGCATGAAGACCAAGAACATCCCAGTTTATGA

ATGTGAAAGATCTGATGTGCAAATACACGTGCCCACTTTCACCTTCAGAGTAACCGTTGGTGA

CATAACCTGCACAGGTGAAGGTACAAGTAAGAAGCTGGCGAAACATAGAGCTGCAGAGGCTG

CCATAAACATTTTGAAAGCCAATGCAAGTATTTGCTTTGCAGTTCCTGACCCCTTAATGCCTGA

CCCTTCCAAGCAACCAAAGAACCAGCTTAATCCTATTGGTTCATTACAGGAATTGGCTATTCAT

CATGGCTGGAGACTTCCTGAATATACCCTTTCCCAGGAGGGAGGACCTGCTCATAAGAGAGAA

TATACTACAATTTGCAGGCTAGAGTCATTTATGGAAACTGGAAAGGGGGCATCAAAAAAGCAA

GCCAAAAGGAATGCTGCTGAGAAATTTCTTGCCAAATTTAGTAATATTTCTCCAGAGAACCAC

ATTTCTTTAACAAATGTAGTAGGACATTCTTTAGGATGTACTTGGCATTCCTTGAGGAATTCTCC

TGGTGAAAAGATCAACTTACTGAAAAGAAGCCTCCTCAGTATTCCAAATACAGATTACATCCA

GCTGCTTAGTGAAATTGCCAAGGAACAAGGTTTTAATATAACATATTTGGATATAGATGAACTG

AGCGCCAATGGACAATATCAATGTCTTGCTGAACTGTCCACCAGCCCCATCACAGTCTGTCAT

GGCTCCGGTATCTCCTGTGGCAATGCACAAAGTGATGCAGCTCACAATGCTTTGCAGTATTTAA

AGATAATAGCAGAAAGAAAGGGTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATA

GAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGAT

TTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCT

ATGCTGATTAAAATGATACTTAAAAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACT

ACATGAAGGATATAAAGATCTTGCTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA

蛋白序列：

MYARAAARQARASGLESDYDIPTTENLYFQGSSQSRHRAEAPPLEREDSGTFSLGKMITAKPGKT

PIQVLHEYGMKTKNIPVYECERSDVQIHVPTFTFRVTVGDITCTGEGTSKKLAKHRAAEAAINILK

ANASICFAVPDPLMPDPSKQPKNQLNPIGSLQELAIHHGWRLPEYTLSQEGGPAHKREYTTICRLES

FMETGKGASKKQAKRNAAEKFLAKFSNISPENHISLTNVVGHSLGCTWHSLRNSPGEKINLLKRS

LLSIPNTDYIQLLSEIAKEQGFNITYLDIDELSANGQYQCLAELSTSPITVCHGSGISCGNAQSDAAH

NALQYLKIIAERKGTMDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQ

QRAAMLIKMILKKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVV

No4.dsCARE(NF90)

cDNA序列：

ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGATGAATGCCCTGATG

CGGTTGAACCAGCTGAAGCCAGGGCTGCAGTACAAGCTGGTGTCCCAGACTGGGCCCGTCCA

TGCCCCCATCTTTACCATGTCTGTGGAGGTTGATGGCAATTCATTCGAGGCCTCTGGGCCCTCC

AAAAAGACGGCCAAGCTGCACGTGGCCGTTAAGGTGTTACAGGACATGGGCTTGCCGACGGG

TGCTGAAGGCAGGGACTCGAGCAAGGGGGAGGACTCGGCTGAGGAGACCGAGGCGAAGCC

AGCAGTGGTGGCCCCTGCCCCAGTGGTAGAAGCTGTCTCCACCCCTAGTGCGGCCTTTCCCTC

AGATGCCACTGCCGAGAACGTAAAACAGCAGGGGCCGATCCTGACAAAGCACGGCAAGAAC

CCAGTCATGGAGCTGAACGAGAAGAGGCGTGGGCTCAAGTACGAGCTCATCTCCGAGACCGG

GGGCAGCCACGACAAGCGCTTCGTCATGGAGGTCGAAGTGGATGGACAGAAGTTCCAAGGT

GCTGGTTCCAACAAAAAGGTGGGTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACAT

AGAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGA

TTTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGC

TATGCTGATTAAAATGATACTTAAAAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACT

ACATGAAGGATATAAAGATCTTGCTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA

蛋白序列：

MYARAAARQARASGLEMNALMRLNQLKPGLQYKLVSQTGPVHAPIFTMSVEVDGNSFEASGPS

KKTAKLHVAVKVLQDMGLPTGAEGRDSSKGEDSAEETEAKPAVVAPAPVVEAVSTPSAAFPSDAT

AENVKQQGPILTKHGKNPVMELNEKRRGLKYELISETGGSHDKRFVMEVEVDGQKFQGAGSNK

KVGTMDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMIL

KKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVV

本发明的目的可以按照如下的方法实现，所述蛋白嵌合体的制备方法，将蛋白转导信号，双链RNA感受器和细胞凋亡信号通过DNA重组的方法按以上顺序连接起来，组成特异性双链RNA结合蛋白嵌合体的重组DNA，克隆在合适的真核或原核表达载体上，例如，pRSET B表达载体，克隆步骤为：先把pRSET B和结合蛋白嵌合体的重组DNA用相同的内切酶酶切，再用T4 DNA连接酶把它们按照不同的比例进行连接，最后用酶切和PCR的方法进行鉴定。

上述表达载体为本领域技术人员所熟知，合适的载体实例，见例如Donnelly et al，Ann.Rev.Immunol.(1997)15：617所述，包括但非限于pcDNA3和pcCMV。

所述双链RNA结合蛋白嵌合体，NF90，PACT，ADAR1和PKR的序列可以得自任何哺乳动物和脊椎动物。

所述将特异性双链RNA结合蛋白嵌合体的重组DNA转化各种原核和真核细胞表达体系进行表达，并将所表达蛋白通过本领域公知的方法制备成针剂、片剂、口服剂、胶囊或喷剂等的抗病毒的药物。

所述特异性双链RNA蛋白嵌合体用于在病毒感染性疾病中的治疗和预防，在哺乳动物细胞水平上作为蛋白药物治疗工具。

本发明的双链RNA结合蛋白嵌合体及其药物可用于增加人或动物免疫系统对抗病毒的能力。特别的，其可用于给予人或动物对象。所述双链RNA结合蛋白嵌合体及其药物优选非肠道给予，例如通过静脉内、肌肉内、动脉内或损害内(intralesional)途径注射或灌注、或喷洒或软膏制剂外用。所述药物可以通过本领域已知的常规技术与药物可接受的介质或者输送载体组合。制备可非肠道给予的组合物的方法为本领域熟知，并在各个资料中有更详细的描述，包括例如Remington‘sPharmaceutical Sciences，Ed.AR Gennaro，20^th edition，2000，Williams & Wilkins，PA，USA.。所述药物优选以治疗有效量给予，即增加人或动物免疫系统对抗病毒的能力的剂量。

双链RNA结合蛋白嵌合体的重组DNA可以是适于蛋白质表达的任何DNA，例如cDNA或dsDNA，但非基因组DNA或ssDNA。

本发明所产生的蛋白嵌合体具有抗病毒感染性疾病作用。本发明的优点是其使得可以制备广谱抗病毒药物。而我们选择的实例是病毒性脑炎。目前该疾病主要通过药物来控制的，但效果非常差，死亡率高达95％。

本发明还可以治疗肠道病毒、呼吸道病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒感染等和不太常见的麻疹、艾滋、SARS、禽流感与Prion等病毒导致的病毒感染性疾病。在本发明的一个实施方案中，包含一种蛋白嵌合体组成的单独药物，也包含两到四种蛋白嵌合体相互搭配的组合药物。

另一方面，本发明提供了通过治疗性药物的功能而预防病毒感染的方法。在感染和疾病之间有一定的时间段。在这种情况中，所述药物作为药理学免疫产物起作用，其通过在宿主中激发抵御所述感染的病理学作用的免疫应答治疗疾病。治疗性药物和预防性药物的不同之处在于治疗性药物在已经感染或患病的患者体内产生保护作用。

附图说明

图1是由双链RNA、ADAR1、PKR和NF90形成的蛋白嵌合体。

图2是证明四种不同蛋白嵌合体具有很好的活性和纯度。

(a)：四种不同蛋白嵌合体的结构。

(b)：四种不同蛋白嵌合体的纯度。用蛋白电泳的试验方法证实这四种不同蛋白嵌合体具有很好的纯度。

(c)：四种不同蛋白嵌合体的活性。用实例3的试验方法证实这四种不同蛋白嵌合体具有很好的活性。

图3是在用不同剂量的纯化的包含序列PKR蛋白嵌合体dsCARE(PKR)治疗腺病毒感染的293T细胞的抗病毒作用示意图。

(a)、(b)、(c)：分别将0，0.2，0.4，1.0，2.0，4.0，或8ug/ml的提纯蛋白和10^-4MOI的GFP⁺阳性的腺病毒同时处理细胞，在第7天，对照组与各治疗组的抗病毒结果显著不同(P＜0.001)。

(d)、(e)：分别将2ug/ml的dsCARE或100ug/ml的BSA加入293T细胞中培养7天后，再加入10^-4MOI的GFP⁺阳性的腺病毒，在第10天，对照组和治疗组的预防性抗病毒结果显著不同(P＜0.001)。

具体实施方式

实施例1：双链RNA-ADAR1-PKR-NF90复合物的抗病毒作用的研究

(一)ADAR1与双链RNA-PKR信号结合时的作用

1、ADAR1编辑双链RNA与双链RNA-PKR信号调节之间的关系

1)ADAR1+/+、ADAR1+/-和ADAR1-/-神经元细胞的培养：孕11-12d ADAR1+/+、ADAR1+/-和ADAR1-/-小鼠，常规麻醉，无菌状态下取出胎鼠。小心剥离小脑皮层，去除脑膜及血管组织，切成1mm大小的组织块后加入0.125％胰蛋白酶37℃消化30min。加入含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化10min，用移液管吹打成细胞悬液，接种至多聚赖氨酸包被的细胞培养板。离体培养7d后进行如下实验。

2)构建pENTR/U6(MS2-双链RNA)表达载体：先PCR扩增出小鼠Alu样基因，克隆到pCRIITA克隆载体中，从两个方向鉴定带有插入片段的克隆，从而使正义链和反义链RNA都进行对照；再用EcoRI酶切这个插入片断进行鉴定，然后片段和载体比为10∶1再次把它连接到相同的载体中，从而产生一个反复制基因；接着用限制性内切酶鉴定反复制基因，通过测序证实；最后用T7和SP6引物扩增正义链、反义链和反复制基因，再克隆到pENTR/U6载体中。同时把MS2RNA序列增加到SP6引物的后面，因此每个插入片段的结尾都带有MS2的结合位点。把T7和SP6序列分别放在5’和3’末端将有利于转录物的检测。在细胞核中的插入片段将受到U6RNA启动因子的控制，同时也被RNA多聚酶III转录。载体构建完成后，转染ADAR1+/+和ADAR1-/-神经元。

3)转染神经元细胞：用Lipofectamine 2000将6μg的pENTR/U6(MS2-双链RNA)载体导入准备好的ADAR1+/+、ADAR1+/-和ADAR1-/-神经元细胞中。

4)Western blotting检测PKR和eIF2a磷酸化：转染48小时后裂解细胞，将裂解上清液加入样品缓冲液，95℃加热3min，电泳，将蛋白质转移到膜上，用特异性抗体检测，定量分析。

5)RT-PCR检测RNA编辑的发生：转染48小时后，提取培养细胞总RNA，反转录生成cDNA，再进行序列测定，最后观察cDNA中A到G的突变。

2、应激诱导的双链RNA产生与ADAR1和结合它的PKR抑制作用相关

1)建立神经元应激模型：把ADAR1-/-和ADAR1+/+神经元细胞种植到6-cm的培养皿中用10％FCS的普通培养基培养7天；然后用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗细胞，最后用无血清培养基0、1、2、4、8和12小时进行培养。

2)细胞质和细胞核的双链RNA定量：第一步，模型细胞先用PBS洗两次，再用BufferA(10mM HEPES pH 7.9，10mM NaCl，1.5mM MgCl2，0.5mM DTT，5mM β-硫氢基乙醇)洗一次；接着用2倍体积含有1％NP-40的2x体积的BufferA溶解细胞，同时用玻璃杵进行敲击；冰浴20分钟；离心后浮在上层的就是细胞质部分，收集上清，用Trizol法提取细胞质RNA。下层的细胞核用Buffer C(20mM HEPES pH7.9，10mM NaC，1.5mM MgCl2，0.2mM EDTA，25％甘油，0.5mMDTT，5mM β-硫氢基乙醇，1mM PMSF，1％NP-40)洗一次，再用Trizol法提取细胞核RNA。第二步，将上步得到的总RNA取大约50ug，放到400ul含有0.1单位RNaseI和DnaseI/ul的消化buffer中，37℃孵化2小时。被消化的RNA混合液通过琼脂糖G-50除去盐分，再通过核苷酸去除剂去除小的寡核糖核苷酸(＜20bps)。最后用UV光谱测定法对Rnase耐受的RNA定量。

3)免疫共沉淀检测ADAR1-PKR-NF90复合物与双链RNA的作用：在上步得到的细胞质部分中加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1h；加入0.9ml的蛋白质A-Sepharose悬液，4℃摇动免疫沉淀物30min；接着用含900mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，重复洗5次，最后一次用NETN洗，吸出混合物的液体部分；然后加入800μl的1xSDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min，将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜；再通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带，从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml50％乙腈洗两次，每次3min；最后用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱，通过窄孔高效液相色谱分离肽，将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

4)TLC检测RNA编辑：先用乙醇沉淀10μg的细胞核或细胞质RNA；接着用含有5个单位RNaseT2的10μl RNase T2 buffer重悬后37℃孵化6小时；再通过加入3μl的gama-32P-ATP(3000Ci/mmol)、1.5μl的T4酶buffer和1μl的T4多核苷酸激酶来标记3’NTP；然后加入2μl的细胞核P1 buffer(25mM醋酸钠，pH 5.3，含有5个单位的细胞核P1)混合后37℃消化2小时；再通过TLC在纤维素PEI培养板上分析标记有32p的5’-IMP和5’-AMP。这个显影剂由饱和的(NH4)SO4、100mM醋酸钠(pH 6.0)和丙醇(79∶19∶2)组成。放射自显影后，可以鉴别出5’-IMP，用20μl水重悬纤维素；再用TLC分析5μl的上清液；再次放射自显影后，利用液体闪烁计数器通过被切断TLC点的放射性强度的测定来定量每一个点的强度。

3、ADAR1与PKR的结合在双链RNA诱导激活方面的相互作用

1)ADAR1+/+、ADAR1+/-和ADAR1-/-神经元细胞的培养：方法同前。

2)转染神经元细胞：用pENTR/U6(MS2-双链RNA)载体转染准备好的ADAR1+/+、ADAR1+/-和ADAR1-/-神经元细胞中。

3)免疫共沉淀检测PKR或NF90：方法同前。

4)构建MS2蛋白的表达载体：通过RT-PCR扩增细菌MS2外壳蛋白的cDNA，在CMV启动因子的控制下把这个cDNA克隆到pLenti6/V5载体中，从而构建出MS2蛋白的表达载体。

5)pENTR/U6(MS2-双链RNA)和plenty/V5(MS2蛋白)共转染神经元细胞：方法同前。

6)免疫共沉淀的方法检测MS2：方法同前。

7)Western blotting检测ADAR1、PKR、NF90和pPKR的表达：对2)和5)的细胞收集蛋白进行免疫印迹检测。

(二)研究NF90在结合ADAR1调节的PKR激活中的作用

1、NF90在PKR介导的细胞信号中的作用

1)NF90+/+、NF90+/-和NF90-/-神经元细胞的培养：从孕11-12d NF90+/+、NF90+/-和NF90-/-小鼠中取原代神经元细胞，具体同前。

2)Western blotting检测PKR、eIF2a、MAPK p38和JNK：方法同前。

2、NF90与ADAR1结合介导PKR抑制

1)RT-PCR检测MS2-双链RNA编辑的发生：方法同前。

2)TLC检测双链RNA编辑：方法同前。

3)pENTR/U6(MS2-双链RNA)转染神经元细胞：方法同前。

4)免疫共沉淀检测PKR和ADAR1：方法同前。

5)Western blotting检测PKR、ADAR1和磷酸化PKR：方法同前。

3、NF90促进双链RNA输出和它在ADAR1结合双链RNA-PKR信号中的作用

1)构建GFP-MS2的表达载体：先从pEGFP载体中扩增GFP的cDNA，在CMV启动因子的控制下把MS2和GFP的cDNA连接到pLenti6/V5载体中。

2)转染神经元细胞：用MS2-双链RNA和MS2-GFP的表达载体共同转染准备好的NF90-/-、NF90+/+、ADAR1-/-或ADAR1+/+神经元细胞。

3)实时成像：转染4小时后，在荧光显微镜下使GFP的分布型式显影，每小时一次，直到12小时；然后每4小时一次，直到48天。

(三)细胞的双链RNA介导ADAR1调节PKR激活

1、内源性双链RNA与ADAR1-PKR-NF90复合物(见图1所示)有关。

1)ADAR1p 150或ADAR1 p80表达载体转染神经元细胞：带双标的ADAR1p 150或ADAR1p80表达载体转染准备好的神经元细胞。

2)ADAR1复合物免疫共沉淀：方法同前。

3)提纯双链RNA：把上一部得到的合成物在蛋白酶K混合物(5ug/ml，500mM NaCl，10mMTrisHCl pH 7，0.2％SDS)中重悬并在55℃消化2小时，从而去除蛋白部分。再次离心柱子，用石碳酸提取上层悬液，双链RNA部分用2.5体积的乙醇沉淀。得到得沉淀物包含有相关双链RNA。

4)双链RNA的微点阵筛选：用Cy3荧光染料标记来自于被ADAR1 p150转染细胞的实验RNA；用Cy5荧光染料标记来自于被ADAR1p80转染细胞的对照RNA。用随机引物通过反转录来完成标记。观察特殊的双链RNA标记：用随机引物与双链RNA部分混合，在94℃加热2分钟后快速放到冰上，从而使变性RNA在一个较短的随机引物时有一个较好得退火。通过CHROMASPIN-200column纯化标记的cDNA，68℃变性10分钟，再用中和液68℃中和20分钟。在YaleKeck Microarray Facilities中使标记的cDNA杂交，然后扫描并获得阳性基因的强度数据。来自神经元细胞的探针将与人的15K cDNA微阵点进行杂交。用Blast和RT-PCR分析阳性基因。通过RT-PCR进一步鉴定不同基因的表达特征。

5)双链RNA的直接克隆：用T4多核苷酸激酶标记双链RNA部分，用8-15％PAGE监测数量。使用T4RNA把由T7启动因子序列的反义链和一个poly(dA)尾p-T7-(A)17-NH2组成的寡聚核苷酸与双链RNA连接。在连接时，3′末端有NH2的将不会与寡聚核苷酸连接。用PCR克隆片段纯化试剂盒去除游离的寡聚核苷酸。用oligo poly(dT)18引物与cDNA结合。纯化的cDNA加到含有50mM Tris-HClpH 7.5、100mM NaCl、10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中加热到80℃退火5分钟。再在65℃孵化16小时，最后30℃冷却超过3小时。PCR扩增前用Klenow是两端线性化。为了扩增不同大小的cDNA可以使用T7引物。再把cDNA克隆到pENTR/U6载体中，并在测序后与Genbank数据库中的序列进行比对。

6)RT-PCR和测序来确定序列中A到I的突变。

2、被鉴定转录物在双链RNA-PKR信号中的特征

1)MFOLD软件分析被鉴定转录物的二级结构。

2)被鉴定转录物的pENTR/U6载体转染神经元细胞：方法同前。

3)Northern blotting检测被鉴定转录物：用Trizol提取总RNA。为了分析双链RNA部分，取50μg的RNA与乙醇沉淀，然后用400μl含有0.1单位/μl RNase I和DNase I(Sigma)的消化buffer重悬，37℃2小时；再用琼脂糖G-50除去盐分，用核苷酸去除试剂盒去除小的寡核糖核苷酸。

4)RNase V1消化：用含有0.4单位/μl RNase V1的RNase V1buffer重悬Rnase耐受的RNA，37℃、25分钟，在通过离心使其快速破裂。

5)荧光显微镜观察荧光体PKR：在2)转染后的细胞中通过荧光显微镜观察荧光体PKR。

3、被鉴定转录物补充形成ADAR1-PKR-NF90复合物

1)被鉴定转录物的pENTR/U6载体转染神经元细胞：方法同前。

2)PKR免疫共沉淀：得到的ADAR1-PKR-NF90复合物重悬在200ul包含10ug/ml蛋白酶K的蛋白酶K缓冲液中50℃，1小时；收集上清液石炭酸抽提后与乙醇沉淀。

3)RT-PCR检测被鉴定转录物：对上步得到的沉淀物进行被鉴定转录物的RT-PCR。

4、被鉴定转录物在应激诱导双链RNA-PKR信号中的作用

1)神经元应激模型的建立：方法同前。

2)Northern blotting检测被鉴定转录物：方法同前。

3)Western blotting检测荧光体PKR和荧光体eIF2a：方法同前。

以上试验结果证实了双链RNA-ADAR1-PKR-NF90复合物具有明显的抗病毒作用。

实施例2：构建包含有不同双链RNA感受器序列、细胞调亡信号和蛋白转导域的蛋白嵌合体的表达载体并抽提蛋白

1、四种不同蛋白嵌合体的构建：四种不同蛋白嵌合体的双链RNA感受器序列分别为NF90、PACT、ADAR1和PKR(见图2所示)。具体连接方法如下：先通过RT-PCR的方法从人类cDNA基因库中扩增出NF90、PACT、ADAR1和PKR的cDNA，再经过PCR在这四种不同的双链RNA感受器序列上增加XhoI和KpnI的酶切位点；同时在细胞调亡信号上也加入XhoI和KpnI的酶切位点；两种寡核苷酸agcttggatcctacgcccgtgccgccgcccgtcaggcccgtgccagtggt和ccatctcgagaccactggcacgggcctg通过PCR扩增后用BamHI和XhoI进行双酶切得到蛋白转导域的cDNA编码序列；用atatggatcccatggtctagccagcttgggtctccct和aatcaagcttcgaacaaaaactcatctcagaa为引物对pcDNA3载体(Invitrogen，CA)进行扩增得到一个BamHI-HindIII序列；在pcDNA3的CMV启动子的作用下通过BamHI-XhoI-KpnI-HindIII连接上面得到的cDNA；最后通过酶切和测序进行鉴定。

2、真核表达方法：按以上方法将四种不同蛋白嵌合体的基因分别连接到表达载体pcDNA3.1中。通过转染HEK 293T细胞(ATCC，USA)、考马斯亮蓝染色和Western blotting的方法检测四种不同蛋白嵌合体的表达。

3、原核表达：按以上方法将四种不同蛋白嵌合体的基因分别与pRSET(Invitrogen，CA)载体连接，16℃连接过夜后，转化TOP10感受态细胞，并挑克隆摇菌，提质粒；PCR及测序鉴定。在表达蛋白嵌合体之前，将质粒转化BL21感受态细胞；37C摇菌过夜后，按Qiagen(Qiagen，USA)提供的Ni-NTA蛋白纯化技术从细菌裂解业中抽提蛋白。蛋白的纯度见图2所示。

实施例3：四种不同蛋白嵌合体对腺病毒感染HEK293细胞的抑制作用

1、腺病毒感染：HEK293或293T细胞在六孔板上生长8小时后，用带有荧光标记的重组腺病毒进行感染30-60min，用温的PBS洗脱两遍后继续用含有10％FBS的DMEM培养液培养12h。荧光显微镜观察病毒感染后的细胞，通过病毒梯度稀释的方法观察感染病毒的293T的滴度，感染24h后荧光显微镜下数GFP阳性细胞(见图3所示)。

2、体外抗病毒分析：上述四种不同的蛋白嵌合体纯化出的抗病毒蛋白分别在病毒感染前，感染时或感染后加入到培养液中，分别于感染2天、一周和10天后在荧光显微镜下跟踪观察病毒的感染情况。结果发现治疗组的细胞在病毒感染10天后仍是正常的(见图3所示)。

实施例4：蛋白嵌合体对腺病毒感染神经元细胞的抑制作用

1、胎鼠脑皮层神经元体外培养：孕11-12d小鼠，常规麻醉，无菌状态下取出胎鼠。小心剥离小脑皮层，去除脑膜及血管组织，切成1mm大小的组织块后加入0.125％胰蛋白酶37℃消化30min。加入含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化10min，用移液管吹打成细胞悬液，接种至多聚赖氨酸包被的细胞培养板。离体培养7d后进行如下实验。

2、表达载体转染神经元细胞：利用Lipofectamine 2000将6μg的质粒转染到1准备好的细胞中。

3、腺病毒感染这些细胞：用PBS把密度为1×10⁹的腺病毒液取10μl分别稀释到密度为1×10⁴，1×10⁵，1×10⁶的液体，取1ml加入转染后的神经元中，再取1ml的PBS作为阴性对照，把病毒液加入到未转染的神经元中做阳性对照。

4、荧光显微镜观察感染情况，流式细胞仪检测分析。

结果表明，与未转染双链RNA复合体质粒的神经元相比，在所有情况中给予每种双链RNA复合体质粒的神经元，在不同浓度腺病毒感染后，神经元存活率增强、平均存活时间增长、细胞流式仪检测分析死亡细胞减少，凋亡细胞增多(见图3所示)。表现出明显的抗病毒作用，特别的包含PKR序列表达载体的质粒抗病毒作用最明显。

实施例5：观察这些蛋白对病毒性感染动物模型的治疗效果

1、这些蛋白皮下注射的毒性试验：不同剂量蛋白皮下注射观察皮下结节，小鼠饮食及体重变化情况。

2、腺病毒接种鼠脑的半数致死量的测定：用Hanks缓冲液将病毒悬液(TCID50＝105)稀释为10-5-10-1五个稀释度；取3周龄小鼠40只，随机分成5组，每稀释度一组，每组8只；用1ml注射器于右侧鼠脑接种0.05ml/只，左侧不接种；观察10d，每天观察记录小鼠的发病与死亡情况。

3、这些蛋白对抗腺病毒脑炎小鼠半数有效量的测定：取3周龄小鼠250只，随机分成25组，每组10只，以103 TCID50病毒悬液接种0.05ml/只；从第2天开始，以6种不同浓度的各种蛋白皮下注射治疗，生理盐水：0.1/(kg·d)；各种蛋白：0.88、1.67、3.3、4.9、6.6、13.2g/(kg·d)。观察10d，每日记录小鼠发病与死亡情况。

4、通过局部接种的方法把腺病毒注入到小鼠脑内建立病毒性感染的动物模型：1ml注射器每只小鼠分别注射0.1ml病毒悬液注射到右侧脑室，观察记录10天小鼠的死亡和发病情况。

5、通过蛛网膜下腔注射、静脉注射和鼻内给药三种途径把这些蛋白注入到小鼠体内观察蛋白的治疗效果：小鼠随机分为假手术组、蛛网膜下腔注射组、静脉注射组、鼻内给药组和空白对照组；各蛋白治疗1、3、5、7、14天后分别于治疗后1、3、5、7、14天，每组处死6只，于无菌条件下取出脑组织，每次所取的标本一部分放入10％福尔马林溶液中，留做病理组织切片用；一部分用来体外培养神经元，荧光显微镜观察和流式细胞仪检测分析；其余放入-70℃超低温冰箱保存备用；各实验组留20只观察存活率和平均存活时间。空斑法测病毒滴度：将标本置入匀浆器中反复研磨，低速离心后，将上清液用Hanks缓冲液连续作10倍稀释，接种长成单层的24孔板，加入琼脂培养基，2天后，加入含中性红的琼脂，记数空斑。

结果如下，存活率和平均存活时间上：治疗组明显比假手术组和空白对照组增强(P＜0.01)，而蛛网膜下腔注射组与静脉注射组和鼻内给药组相比较作用更明显(P＜0.05)；细胞流式仪检测、免疫组化半定量、病毒滴度检测等都提示四种不同的蛋白嵌合体有明显的抗病毒作用，其中包含PKR序列表达载体的质粒抗病毒作用最明显。

需要说明的是，本发明提供的附图是在显微镜或荧光显微镜下采集的细胞图片，为医学研究最清晰的图片，也不能应用计算机修改为黑白对比图片，因为只有根据不同的显色，才能判断实验的结果。

以上实施例中未作详细叙述部分属于本行业或相关行业的公知技术，采用的设备是行业惯例设备。

序列表

1.dsCARE(PKR)

cDNA序列：

ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGATGGCTGGTGAT

CTTTCAGCAGGTTTCTTCATGGAGGAACTTAATACATACCGTCAGAAGCAGGGAGTAGTA

CTTAAATATCAAGAACTGCCTAATTCAGGACCTCCACATGATAGGAGGTTTACATTTCAAG

TTATAATAGATGGAAGAGAATTTCCAGAAGGTGAAGGTAGATCAAAGAAGGAAGCAAAA

AATGCCGCAGCCAAATTAGCTGTTGAGATACTTAATAAGGAAAAGAAGGCAGTTAGTCCT

TTATTATTGACAACAACGAATTCTTCAGAAGGATTATCCATGGGGAATTACATAGGCCTTAT

CAATAGAATTGCCCAGAAGAAAAGACTAACTGTAAATTATGAACAGTGTGCATCGGGGGT

GCATGGGCCAGAAGGATTTCATTATAAATGCAAAATGGGACAGAAAGAATATAGTATTGGT

ACAGGTTCTACTAAACAGGAAGCAAAACAATTGGCCGCTAAACTTGCATATCTTCAGATAT

TATCAGAAGAAACCTCAGTGAAATCTGACTACCTGTCCTCTGGTTCCGGTACCATGGATGC

AAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATAGAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACAT

CCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGATTTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGT

AAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCTATGCTGATAAAATGATACTTAAAAA

AGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACTACATGAAGGATATAAAGATCTTG

CTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA

蛋白序列：

MYARAAARQARASGLEMAGDLSAGFFMEELNTYRQKQGVVLKYQELPNSGPPHDRRFTFQVIID

GREFPEGEGRSKKEAKNAAAKLAVEILNKEKKAVSPLLLTTTNSSEGLSMGNYIGLINRIAQKKRL

TVNYEQCASGVHGPEGFHYKCKMGQKEYSIGTGSTKQEAKQLAAKLAYLQILSEETSVKSDYLS

SGSGTMDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMI

LKKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALHDGIPVV

2.dsCARE(ADAR1)

cDNA序列：

ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGAAGAACCCCATCAG

CGGGCTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAG

TGGACCACCCCATGAACCTCGATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCCGAGAGTTTCCCCC

AGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAGGATGCAGCTATGAAAGCCATGACAATTC

TGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCACTATTCCACA

GAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTT

TTCTGGGAAGAGCCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCG

AATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGCCCTGCCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAG

TGGGAGCCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAAAGTGGCAAAGCAGATGGCC

GCAGAGGAAGCCATGAAGGCCCTGCATGGCGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACCA

GCCTGAAGGTATGATCTCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAG

GAAGATTGGCGAGCTCGTGAGATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACG

CCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTTGGTCGACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGC

CCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGTTCCCAGCCGTCTGCGCACACAGC

AAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCTCTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACG

GTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATAGAGAAGCTCTGGAAAAGGACA

TCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGATTTTTAACAATATCAGAAGAGGA

AAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCTATGCTGATTAAAATGATACTTAA

AAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACTACATGAAGGATATAAAGATCTTG

CTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA

蛋白序列：

MYARAAARQARASGLEKNPISGLLEYAQFASQTCEFNMIEQSGPPHEPRFKFQVVINGREFPPAEA

GSKKVAKQDAAMKAMTILLEEAKAKDSGKSEESSHYSTEKESEKTAESQTPTPSATSFFSGKSPVT

TLLECMHKLGNSCEFRLLSKEGPAHEPKFQYCVAVGAQTFPSVSAPSKKVAKQMAAEEAMKALH

GEATNSMASDNQPEGMISESLDNLESMMPNKVRKIGELVRYLNTNPVGGLLEYARSHGEAAEFKL

VDQSGPPHEPKFVYQAKVGGRWFPAVCAHSKKQGKQEAADAALRVLIGENGTMDAKARNCLLQ

HREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMILKKDNDSYVSFYNALL

HEGYKDLAALLHDGIPVV

3.dsCARE(PACT)

cDNA序列：

ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGAGCGATTACGACATC

CCCACTACTGAGAATCTTTATTTTCAGGGATCCTCCCAGAGCAGGCACCGCGCCGAGGCCCCG

CCGCTGGAGCCCGAGGACAGTGGGACCTTCAGTTTGGGGAAGATGATAACAGCTAAGCCAGG

GAAAACACCGATTCAGGTATTACACGAATACGGCATGAAGACCAAGAACATCCCAGTTTATGA

ATGTGAAAGATCTGATGTGCAAATACACGTGCCCACTTTCACCTTCAGAGTAACCGTTGGTGA

CATAACCTGCACAGGTGAAGGTACAAGTAAGAAGCTGGCGAAACATAGAGCTGCAGAGGCTG

CCATAAACATTTTGAAAGCCAATGCAAGTATTTGCTTTGCAGTTCCTGACCCCTTAATGCCTGA

CCCTTCCAAGCAACCAAAGAACCAGCTTAATCCTATTGGTTCATTACAGGAATTGGCTATCAT

CATGGCTGGAGACTTCCTGAATATACCCTTTCCCAGGAGGGAGGACCTGCTCATAAGAGAGAA

TATACTACAATTGCAGGCTAGAGTCATTTATGGAAACTGGAAAGGGGGCATCAAAAAAGCAA

GCCAAAAGGAATGCTGCTGAGAAATTTCTTGCCAAATTTAGTAATATTTCTCCAGAGAACCAC

ATTTCTTTAACAAATGTAGTAGGACATTCTTTAGGATGTACTTGGCATTCCTTGAGGAATTCTCC

TGGTGAAAAGATCAACTTACTGAAAAGAAGCCTCCTCAGTATTCCAAATACAGATTACATCCA

GCTGCTTAGTGAAATTGCCAAGGAACAAGGTTTTAATATAACATATTTGGATATAGATGAACTG

AGCGCCAATGGACAATATCAATGTCTTGCTGAACTGTCCACCAGCCCCATCACAGTCTGTCAT

GGCTCCGGTATCTCCTGTGGCAATGCACAAAGTGATGCAGCTCACAATGCTTTGCAGTATTTAA

AGATAATAGCAGAAAGAAAGGGTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATA

GAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGAT

TTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCT

ATGCTGATTAAAATGATACTTAAAAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACT

ACATGAAGGATATAAAGATCTTGCTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA

蛋白序列：

MYARAAARQARASGLESDYDIPTTENLYFQGSSQSRHRAEAPPLEREDSGTFSLGKMITAKPGKT

PIQVLHEYGMKTKNIPVYECERSDVQIHVPTFTRVTVGDITCTGEGTSKKLAKHRAAEAAINILK

ANASICFAVPDPLMPDPSKQPKNQLNPIGSLQELAIHHGWRLPEYTLSQEGGPAHKREYTTICRLES

FMETGKGASKKQAKRNAAEKFLAKFSNISPENHISLTNVVGHSLGCTWHSLRNSPGEKINLLKRS

LLSIPNTDYIQLLSELAKEQGFNITYLDIDELSANGQYQCLAELSTSPITVCHGSGISCGNAQSDAAH

NALQYLKIIAERKGTMDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQ

QRAAMLIKMILKKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVV

4.dsCARE(NF90)

cDNA序列：

ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGATGAATGCCCTGATG

CGGTTGAACCAGCTGAAGCCAGGGCTGCAGTACAAGCTGGTGTCCCAGACTGGGCCCGTCCA

TGCCCCCATCTTTACCATGTCTGTGGAGGTTGATGGCAATTCATTCGAGGCCTCTGGGCCCTCC

AAAAAGACGGCCAAGCTGCACGTGGCCGTTAAGGTGTTACAGGACATGGGCTTGCCGACGGG

TGCTGAAGGCAGGGACTCGAGCAAGGGGGAGGACTCGGCTGAGGAGACCGAGGCGAAGCC

AGCAGTGGTGGCCCCTGCCCCAGTGGTAGAAGCTGTCTCCACCCCTAGTGCGGCCTTTCCCTC

AGATGCCACTGCCGAGAACGTAAAACAGCAGGGGCCGATCCTGACAAAGCACGGCAAGAAC

CCAGTCATGGAGCTGAACGAGAAGAGGCGTGGGCTCAAGTACGAGCTCATCTCCGAGACCGG

GGGCAGCCACGACAAGCGCTTCGTCATGGAGGTCGAAGTGGATGGACAGAAGTTCCAAGGT

GCTGGTTCCAACAAAAAGGTGGGTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACAT

AGAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGA

TTTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGC

TATGCTGATTAAAATGATACTTAAAAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACT

ACATGAAGGATATAAAGATCTTGCTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA

蛋白序列：

MYARAAARQARASGLEMNALMRLNQLKPGLQYKLVSQTGPVHAPIFTMSVEVDGNSFEASGPS

KKTAKLHVAVKVLQDMGLPTGAEGRDSSKGEDSAEETEAKPAVVAPAPVVEAVSTPSAAFPSDAT

AENVKQQGPILTKHGKNPVMELNEKRRGLKYELISETGGSHDKRFVMEVEVDGQKFQGAGSNK

KVGTMDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMIL

KKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVV