新疆雪莲上胚轴离体培养直接多芽发生再生植株的培养方法

摘要

本发明公开了一种新疆雪莲离体培养直接多芽发生再生植株的培养方法。本发明还公开了一种斩首的(decapitated)上胚轴外植体。本发明利用上胚轴外植体及斩首的上胚轴外植体，建立了直接诱导多芽发生、伸长和生根的不依赖基因型、简单、快速的新疆雪莲离体培养再生植株技术，通过培养基配方和碳源的优化筛选，使外植体的褐化程度降到最轻，一个外植体最大发生芽数≥3，再生芽生根率在90％以上，获得具有根茎叶完整的再生植株仅需3～4个月的时间，畸形苗率低，为生产上应用的新疆雪莲品种进行基因工程遗传改良奠定基础。

说明书

本发明申请是申请人于2006年11月13日申请的发明创造名称为“一种棉花上胚轴离体培养直接多芽发生再生植株的培养方法”的分案申请，原申请的申请日为2006年11月13日，申请号为200610149143.4，发明创造名称为“一种棉花上胚轴离体培养直接多芽发生再生植株的培养方法”。

发明领域

本发明涉及植物组织培养及生物技术领域。具体的说，本发明涉及一种棉花上胚轴离体培养直接多芽发生再生植株的培养方法。

背景技术

追溯在棉花上已经报道的离体培养再生植株的方法，主要是采用通过愈伤组织诱导分化出体细胞胚而再生植株的，这样极易造成高的畸形率和较长的培养周期，并且只适用于珂字棉或野生棉，对主要栽培的棉花品种无效。尽管基因修饰的棉花商业化获得了成功，但是棉花的遗传转化和再生与其它作物相比仍然受到挑战，这些问题主要是依赖基因型的再生、体细胞胚发生的效率和体细胞的变异。棉花生物技术的重要进展将是能够对生产上应用的品种进行遗传转化和离体培养直接再生植株。而且，离体培养再生植株的方法是获得转基因棉花的必要前提。为此，一些美国和印度的研究人员利用茎尖、子叶节、胚轴等开展了棉花不受基因型限制的直接芽发生再生植株的方法研究。

体细胞胚发生再生植株受基因型限制，适用于珂字棉栽培品种。(Trolinder，N.L and Chen，X.X..Genotype specificity of the somatic embryogenesis incotton.Plant Cell Reports，1989，8：133-136.)

以下胚轴、子叶、未成熟合子胚作为外植体，通过诱导愈伤组织分化产生体细胞胚再生植株。(Rangan et al.Regeneration of cotton，United StatesPatent，5244802.)

以下胚轴、子叶、未成熟合子胚、叶子、花粉、花瓣、胚珠、根、茎尖及其这些混和体作为外植体，通过诱导愈伤组织分化产生体细胞胚再生植株。(Wilkins，T.A.et al.Methods for the regeneration and transformation of cotton.United States Patent Application，20040009601.)

从茎尖(预先存在的分生组织)直接再生植株，每个只获得一株苗，克服基因型依赖，降低离体培养造成的遗传变异，简单，快速。茎尖培养基为MS(Murashige & Skoog medium，1962，下同)培养基的盐，另加肌醇100mg/l、维生素B₁1mg/l、葡萄糖或蔗糖20mg/l，不添加任何激素，但是生根依赖基因型。(Gould，J.，Banister，S.，Hasega wa，O.Fahima，M.and Smith，RH..Regeneration of Gossypium hirsitum and G.barbadense from Shoot apextissue for transformation.Plant Cell Reports，1991，10：12-16.)

用35天幼苗的子叶节及斩首的子叶节作为外植体直接诱导多芽发生再生植株，多芽诱导培养基为MS培养基添加6-BA(6-benzyladenine，下同)2.5mg/l和KT(kinetin，下同)2.5mg/l及蔗糖20mg/l，每个外植体最多产生4.7个芽，若在大容器中培养每个外植体最多产生8.3个芽，不加激素75％生根，添加NAA(α-naphthaleneacetic acid，下同)0.05mg/l、0.1mg/l生根率分别为81.33％、91.6％。但是，仅限一个基因型(Gossypium hirsutum L cv.Anjali-LRK 516)材料，并且外植体褐化严重。(Agrawal D.C.，Banerjee A.K.，Kolala R.R.，DhageA.B.，Kulkarni W.V.，Nalawade S.M.，Hazra S，Krishnamurthy KV.ln vitroinduction of multiple shoots and plant regeneration in cotton(Gossypiumhirsutum L.)，Plant Cell Reports，1997，16：647-652.)

来自培养1天幼苗的茎尖(预先存在的分生组织)，约2-3mm长，垂直放在由MS培养基盐和B₅(Gamborg medium，1968)培养基维生素组成基本培养基上，添加6-BA0.07mg/l和15g/l蔗糖培养基上直接诱导芽发生，偶尔可见多芽产生，芽在添加活性炭的培养基上培养后再移入含萘乙酸的营养钵中生根，生根率低，仅达30％。(Hemphill J.K.，Maier C.G.A.，Chapman K.D..Rapidin-vitro plant regeneration of cotton(Gossypium hirsutum L.)，Plant CellReports，1998，17：273-278.)

以胚轴作为外植体，胚轴是从吸水8小时的种子剥去种皮解剖出胚后切去子叶和胚根获得的。胚轴培养的基本培养由MS无机盐和B5维生素及20g/l葡萄糖组成，在添加3mg/l6-BA培养基上培养20天后，平均每个胚轴外植体可获得3.4个芽，用500ppmlBA(indole-3-butyric acid，下同)浸泡芽诱导生根，生根率高达95％以上。但是，仅限一个基因型(cy.Guazuncho II)材料。(Morre JorgeL Permingeat Hugo R.，Romagnoli Mar′ia V.，Heisterborg Cintia M.& VallejosRub′en H..Multiple shoot induction and plant regeneration from embryonlcaxes of cotton.Plant Cell，Tissue and Organ Culture 1998，54：131-136.)

胚轴来自在灭菌水中浸泡1小时，于潮湿灭菌滤纸上置黑暗处48小时的发芽种子，从种子上齐刀切下胚轴并弃去胚根，剩下的长约2mm胚轴作为外植体用来诱导直接多芽发生，基本培养基由MS培养基盐和B5培养基维生素组成，添加6-BA0.1mg/l、NAA0.02mg/l和蔗糖20g/l，培养3周后，切除伸出的顶芽和长长的下胚轴尾巴，将此转接于新鲜的多芽诱导培养基上，3周后转接到含有较多培养基的大容器中进行6周培养，此时一个外植体上再生芽数最高可达5.95个，再生芽在1/2MS+NAA0.1mg/l培养基诱导生根，生根率最高为85％。这种切法制备的胚轴外植体没有抑制住胚芽的生长，致使顶芽快速长出后再切去才能诱导发生多芽，延长了获得多芽的时间。(Banerjee A.K.In vitro regeneration andgenetic transformation studies in lndia cuitivars of cotton(Gossypium hirsutumL.).Ph.D.，The University of Pune，2001.)

消毒的种子在灭菌水中浸泡4小时，置潮湿灭菌滤纸上于黑暗处发芽24小时，以轻柔的挤压力将胚轴分离出来，并从正中纵向将其劈成两半，每对接种于MS培养基上，添加活性炭和在高温下培养对劈开的胚轴再生植株(只产生一个芽)有协同效应。(Hazar，S.et al.A rapid and simple method for in vitro plantregeneration from split embryo axes of six cultivars of cotton.BiologiaPlantarum，2002，45：317-319.)

我国棉花大规模的遗传转化多数采用花粉管通道方法，少数用农杆菌介导转化法也仅是针对黄河流域的棉花品种或材料，对长江流域和新疆棉区的品种材料用农杆菌介导法转化成功的报道较少。以棉花须根作为外植体，通过诱导愈伤组织分化产生体细胞胚再生植株进行遗传转化棉花。(焦改丽，刘建伟.用新外植体进行农杆菌介导的棉花转化，公开号CN 1338001A.)

总体上分析以上国内外该领域发展情况存在如下几方面问题：

1.目前主要采用通过诱导愈伤组织分化体细胞胚而再生植株的，其受基因型限制，并且畸形率高，培养周期长；

2.在利用外植体直接诱导芽发生而再生植株的诸多方法中，或受基因型限制，或芽发生效率不高，或外植体褐化严重，或生根效率低并且依赖基因型，或再生植株获得时间相对较长。

离体培养再生植株的方法是获得转基因棉花的必要前提，棉花生物技术的重要进展将是能够对生产上应用的品种进行遗传转化和离体培养直接再生植株。如何以我国三大棉花产区的新疆棉花(Gossypium hirsutum L. and G.barbadense L.)品种的上胚轴为材料建立了一种不依赖基因型的、简单、快速的直接诱导多芽发生再生植株的技术具有非常大的现实意义和作用。

发明内容

针对目前国内外有关本领域的研究现状，棉花离体培养再生植株严重受基因型限制，并且畸形率高，培养周期长，生根困难。本发明提供了一种利用上胚轴诱导棉花直接多芽发生、不依赖基因型的再生植株技术，以为生产上应用的棉花品种进行基因工程遗传改良奠定基础。

本发明提供一种诱导棉花离体培养直接多芽发生再生植株的上胚轴外植体及一种斩首的上胚轴外植体。

本发明还提供一种棉花离体培养直接多芽发生再生植株的培养步骤，其包括，

A：上胚轴外植体及斩首上胚轴外植体的制备步骤：将消毒的种子先在灭菌水中浸泡12～48hr，然后沥干水挤脱种皮置于种子发芽培养基中黑暗处培养1～5天，将无菌苗切下并去除子叶和去除距子叶节下4～10mm的下胚轴及胚根，保留部分获得上胚轴外植体，培养15～20天后，切去长出的芽，获得斩首的上胚轴外植体；

B：将获得的上胚轴外植体及斩首上胚轴外植体接种于多芽诱导培养基中，其多芽诱导培养基是由MS培养基的无机盐、B5培养基的维生素、0.8mg/l～2.5mg/l的6-BA、0.07mg/l～2.0mg/l的NAA和30g/l的葡萄糖组成，不受基因型限制，培养25～30天后见多芽发生；

C：在再生芽的伸长中，以不添加任何激素的多芽诱导培养基用作芽伸长培养基，多芽发生后立即转入芽伸长培养基；防止再生芽发生落叶的早衰症状；

D：将长1cm的再生芽单个分离，接种于生根培养基中培养15～20天有根发生，培养25～30天，生根率达到70～90％，不受基因型限制：其中，生根培养基是由MS培养基盐浓度的四分之一，添加IBA3～12mg/l和20g/l的蔗糖组成。

本发明所述的上胚轴外植体及斩首上胚轴外植体的制备步骤，是将消毒种子浸泡12～48hr后，置黑暗处培养1～5天的无菌苗切下并去除子叶和距子叶节下4～10mm的下胚轴及胚根，保留部分即是上胚轴外植体，并在其顶端正中纵切0.3～1.3mm豁口，不能劈开胚轴，将4～10mm下胚轴朝下插入多芽诱导培养基中。

本发明所述的斩首上胚轴外植体的制备步骤，具体操作是对上述处理的上胚轴外植体培养15～20天后，切去长出的芽，获得斩首上胚轴外植体(decapitated epicotyl explant，以下同)，然后继续培养，仍可获得多芽。本发明在多芽诱导培养基中添加葡萄糖，有效减轻外植体褐化发生。

本发明所述的诱导直接多芽发生的步骤，将上胚轴外植体及斩首上胚轴外植体接种于多芽诱导培养基中，培养25～30天后可见多芽发生，不受基因型限制。

本发明所述的促使再生芽伸长的步骤，将不添加任何激素的诱导直接多芽发生的培养基用作芽伸长培养基，多芽发生后立即转入该培养基，可以促进芽伸长，并能防止再生芽发生落叶等早衰症状。

具体的，本发明所述的上胚轴外植体的制备步骤，将硫酸脱绒的种子先用70乙醇进行表面消毒30sec，接着用15％双氧水(H₂O₂)溶液消毒2hr，然后用用灭菌水冲洗5～6次并放在灭菌水中浸泡12～48hr，沥干水挤脱种皮将种仁接于1/2MS固体培养基上置黑暗处培养，从培养1～5天的无菌苗上切下并丢弃子叶和距子叶节下4～10mm的下胚轴及胚根，剩下部分即是上胚轴外植体。并在其顶端正中纵切0.3～1.3mm豁口，切忌劈开胚轴，然后以其连接着的4～10mm下胚轴朝下插入多芽诱导培养基中。

多芽诱导培养基是由MS培养基的无机盐、B5培养基的维生素、6-BA(0.8～2.5mg/l)和NAA(0.07～2.0mg/l)、30g/l葡萄糖组成。

本发明所述的诱导再生芽生根的步骤，将长约1cm的再生芽单个分离，接种于生根培养基，培养25～30天，生根可达到70～90％，不受基因型限制。

生根培养基是MS培养基盐浓度的四分之一，添加IBA3mg/l和20g/l蔗糖。

本发明还具体提供一种棉花离体培养直接多芽发生再生植株，其利用制备的上胚轴外植体及斩首上胚轴外植体，通过如上所述的培养步骤而获得。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。

1.本发明是首次利用带有完整胚芽结构的上胚轴外植体，对外植体的处理仅是对其上的胚芽作切一小豁口处理而不是劈开胚轴，直接诱导多芽发生再生植株，而不经过诱导愈伤组织脱分化阶段。因此，畸形率低，再生芽健壮。

2.本发明利用棉花上胚轴外植体及斩首上胚轴外植体直接诱导多芽发生再生植株，不依赖基因型，打破了用农杆菌介导法遗传转化棉花的技术瓶颈，是棉花生物技术的重要进展。

3.本发明芽的生根率高，最高可达到90％，不受基因型限制，根系发达、健壮，移栽易成活，从而解决了常常需要采取嫁接方式获得和扩繁转基因棉花植株的生根难问题。

4.简单、快速，仅需3～4个月时间就可以获得根、茎、叶完整的再生植株。

5.在添加6-BA诱导直接多芽发生时，以葡萄糖作碳源可以降低、减缓外植体褐化的程度。

附图说明

图1为棉花离体培养直接多芽发生再生植株的技术路线。

图2显示为上胚轴外植体及斩首上胚轴外植体的制备过程(A～F)。

图中A消毒种子(×1.8)；B，C浸泡后开裂的种子及挤脱种皮获得的种仁(×1.6)；D在发芽培养基上萌发的无菌苗(×0.8)；E在胚芽上切一小豁口的上胚轴外植体，(×1.1)；F斩首外植体(×2.4)。

图3显示为直接多芽产生(G～I)。

图中G从切一小豁口的上胚轴外植体上诱导出5个芽(×1.6)；H从切一小豁口的上胚轴外植体上诱导出3个芽(×1.3)；I从斩首上胚轴外植体上诱导出3个芽(×1.7)。

图4显示为再生芽的生根(J)。

图中J为诱导再生芽生根，根系健壮、发达(×1.5)。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指重量百分比。

实施例1：海岛棉上胚轴离体培养直接多芽发生再生植株的方法及斩首的上胚轴外植体

海岛棉品种新海19号种子经硫酸脱绒处理后获得光籽。种子先用70％乙醇进行表面消毒30sec，接着用15％双氧水(H₂O₂)水溶液消毒2hr.，然后用灭菌水冲洗6次并浸泡在灭菌水中，12～36hr.后沥干水挤脱种皮，将种仁接种于1/2MS固体培养基上置黑暗处培养1～3d，切下并丢弃子叶和距子叶节下4～6mm的下胚轴及胚根，保留的部分即是上胚轴外植体。在上胚轴外植体顶端正中纵切0.3～0.7mm豁口，切忌劈开胚轴，然后以其连接着的4～6mm下胚轴朝下插入多芽诱导培养基(MS盐+B₅有机+6-BA0.0～0.8mg/l+NAA0～0.06mg/l+葡萄糖30g/l)中，培养25天后可见有多芽发生。而对未产生多芽的上胚轴外植体培养15天后，剁去长出的芽，即为斩首的上胚轴外植体，转接于新鲜的多芽诱导培养基上，继续培养也可见有多芽发生。等再生芽长至1cm长时，从外植体切下置于生根培养基上(1/4MS+IBA8～12mg/l+蔗糖20g/l)，培养15天可见有根发生，25～30天后生根率可达到90％。

实施例2：陆地棉上胚轴离体培养直接多芽发生再生植株的方法及斩首的上胚轴外植体

早熟陆地棉品种新陆早17号种子经硫酸脱绒处理后获得光籽。种子先用70％乙醇进行表面消毒30sec，接着用15％双氧水(H₂O₂)水溶液消毒2hr.，然后用灭菌水冲洗5次并浸泡在灭菌水中，36～48hr.后沥干水挤脱种皮，将种仁接种于1/2MS固体培养基上置黑暗处培养2～5d，切下并丢弃子叶和距子叶节下6～10mm的下胚轴及胚根，保留的部分既是上胚轴外植体。在上胚轴外植体顶端正中纵切0.7～1.3mm豁口，切忌劈开胚轴，然后以其连接着的6～10mm下胚轴朝下插入多芽诱导培养基(MS盐+B₅有机+6-BA0.8～1.3mg/l+NAA

0.07～1.0mg/l+葡萄糖30g/l)中，培养25天后可见有多芽发生。而对未产生多芽的上胚轴外植体培养20天后，剁去长出的芽，即为斩首的上胚轴外植体，转接于新鲜的多芽诱导培养基上，继续培养也可见有多芽发生。等再生芽长至1cm长时，从外植体切下置于生根培养基上(1/4MS+IBA3～10mg/l+蔗糖20g/l)，培养15天可见有根发生，25～30天后生根率可达到80％。

实施例3：新甜饲1号上胚轴离体培养直接多芽发生再生植株的方法及斩首的上胚轴外植体

新甜饲1号种子用力轻轻敲碎种皮拨出种仁，先用70％乙醇进行表面消毒30sec，接着用0.1％升汞水溶液消毒10min.，然后用灭菌水冲洗6次，将种仁接种于1/2MS固体培养基上置光照处培养，从培养5～7天无菌苗上切下并丢弃子叶和距子叶节下6～10mm的下胚轴及胚根，保留的部分既是上胚轴外植体，对其上胚芽作切一小豁口的处理，转接于诱导多芽发生培养基(MS盐+B₅有机+6-BA0.1～0.5mg/l+NAA0.5～1.5mg/l+葡萄糖30g/l)中，培养20天后可见有多芽发生。而对未产生多芽的上胚轴外植体培养15天后，剁去长出的芽，即为斩首的上胚轴外植体，转接于新鲜的多芽诱导培养基上，继续培养也可见有多芽发生。等再生芽长至1cm长时，从外植体切下置于生根培养基上(1/4MS+IBA2～5mg/l+蔗糖20g/l)，培养15天可见有根发生，25～30天后生根率可达到90％。

实施例4：新疆雪莲上胚轴离体培养直接多芽发生再生植株的方法及斩首的上胚轴外植体

新疆雪莲种子经流动自来水冲洗2～4hr后，先用70％乙醇进行表面消毒30sec，接着用0.1％升汞水溶液消毒8min.，然后用灭菌水冲洗6次，将消毒种子接种于1/2MS固体培养基上置光照处培养，从培养7～15天无菌苗上切下并丢弃子叶和距子叶节下5～7mm的下胚轴及胚根，保留的部分既是上胚轴外植体，对其上胚芽作切一小豁口的处理，转接于诱导多芽发生培养基(MS盐+B₅有机+6-BA1.5～2.5mg/l+NAA0.8～1.5mg/l+葡萄糖30g/l)中，培养20～25天后可见有多芽发生。而对未产生多芽的上胚轴外植体培养15天后，剁去长出的芽，即为斩首的上胚轴外植体，转接于新鲜的多芽诱导培养基上，继续培养也可见有多芽发生。等再生芽长至1cm长时，从外植体切下置于生根培养基上(1/4MS+IBA1～4mg/l+蔗糖20g/l)，培养生根。