单细胞连续流毛细管电泳双波长检测细胞活性的方法

摘要

本发明涉及单细胞连续流毛细管电泳双波长检测细胞活性的方法，属于细胞生物学领域。该方法是将待测细胞经染色后固定，将固定化的细胞用毛细管电泳仪进行双波长检测，在紫外和可见波长分别检测每个细胞的光吸收值，以紫外/可见双波长吸收值比值表示该细胞的活性。本发明具有快速、简便，低成本和定量检测细胞活性的优点，可用于细胞生物学、细胞毒理学及药物筛选及研制等相关的细胞活性检测。

说明书

技术领域

本发明为单细胞连续流毛细管电泳双波长检测细胞活性的方法，属于细胞生物学领域。

背景技术

细胞活性检测和细胞浓度测定在细胞生物学、细胞毒理学，药物筛选及研制等领域是应用非常广泛的重要的技术和手段，具有重要的应用价值。

常规细胞活性检测主要有染色法和MTT法。染色法是根据染料进入细胞内的量来表征细胞膜通透性进而反应细胞的活性强弱。染色法通常是采用台盼蓝或PI等染料对细胞染色后通过显微镜肉眼观察和人工统计一定体积细胞溶液中细胞的数目和细胞染色程度从而给出细胞活性的定性和半定量结论，这种肉眼观察染色深浅所致的人为误差很大，且不能提供每个细胞的染色程度的量值。而且人工统计细胞数目的方法也存在较大的人为误差。MTT法是根据活细胞内的琥珀酸脱氢酶可将MTT(四甲基偶氮唑盐)试剂由黄色还原为紫色结晶并沉积在细胞中的原理，通过比色法检测群体细胞产生紫色结晶的量来反映细胞溶液中所有细胞的平均活性。特别强调的是，MTT法仅能检测整个细胞群体的平均活性，而无法判断个体细胞的活性。

细胞计数是细胞生物学，微生物学，分子生物学以及毒理学等研究领域极其重要的和必不可少的细胞“量”的统计和表征方法。常规的细胞计数方法是使用细胞计数器和显微镜。其基本方法是：制备细胞悬液，滴在计数板(特制厚玻片，其上有计数池，池底有直线条将计数池分成许多小方格)上，盖上盖玻片，然后在显微镜下用肉眼直接计数若干小方格(已知体积)内的一种或多种细胞，这样就可估算单位体积细胞悬液内这些细胞的数量或数量比。为了估算准确，需计数不少于100个细胞为止。计算计数板四大格内的细胞总数，在对格内细胞压线进行统计处理，如压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝(4×大格细胞总数/4)×10000。这种计数方法需要繁琐的计数前准备工作和小心翼翼的手工计数，人为误差很大，工作效率低。目前的商品化的自动细胞计数器主要是用于血液分析的血细胞计数装置，其原理是将细胞溶液悬浮于含电解质的溶液中。在电压作用下，悬浮细胞颗粒在电场中会随机通过溶液池内特定小孔，并引起小孔检测处的电阻或光散射变化。通过测量小孔处的电阻或光散射变化，进行溶液池内的细胞计数。该方法不适合细胞浓度较低时的计数，且商用仪器价格较贵。

现代的细胞定量分析检测手段有70年代出现的流式细胞仪。它集电子、计算机、激光、流体技术为一体，是当今功能最强，最先进的细胞定量分析仪。全球约有6家仪器生产厂商。流式细胞仪可高速分析上万个细胞，并具有强大的分析功能，可同时从一个细胞中测得多个参数，目前已有约20～30种应用功能的报道，其中也包括细胞活性和细胞计数的检测。但是由于流式细胞仪价格昂贵，实验成本高，操作技术要求高。其仪器购买和使用非一般从事生物学研究的科研和医疗单位所能够负担。因此，针对细胞的常规检测指标—细胞活性分析、细胞计数和浓度计算，需要提供一种简单、廉价、准确和实用的分析方法。

毛细管电泳是现代微量分析技术。其具有高效，快速，仪器成本和实验费用低等明显优势，本发明建立了细胞活性检测和细胞浓度计算的毛细管电泳分析方法。所建立的双波长细胞活性分析方法使其在细胞活性准确判断方面优于常规染色法，通过对细胞逐个进行活性检测则优于MTT法的群体细胞活性分析。毛细管电泳细胞浓度测定使细胞计数准备，可量值化，并减少了人为误差。所建立的毛细管电泳细胞活性检测和细胞浓度计算方法在仪器成本，实验成本和操作技术要求方面更优于流式细胞仪。此外，由于细胞的活性变化，常规细胞分析受制于细胞保存时间和分析时间限制，而本发明中细胞样品经固定化处理后，性质稳定，不受样品保存时间和分析时间的影响，因此大大方便了细胞活性分析，为大批量样品分析提供了可靠的方法。

近年来已有报道将毛细管电泳应用于细胞凋亡状态的检测。例如：1)直接对完整细胞进行毛细管区带电泳。由于正常细胞和凋亡细胞具有不同的荷质比，因而在电泳过程中能相互分离，出现两个细胞峰就能判断细胞凋亡现象，通过两个峰的面积比可以判断细胞的凋亡程度；2)通过提取细胞内的DNA后，再采用毛细管电泳对DNA片段进行电泳分析，借此判断细胞是否发生凋亡；3)通过检测细胞内的caspase-3蛋白的活性来表示细胞凋亡的程度。以上方法1是以微量细胞溶液作为样品，根据不同状态细胞出峰位置不同，进行细胞凋亡与否的鉴定。方法2和3则都是根据不同细胞状态时，细胞内的大分子如核酸或特定蛋白质的性质变化进行细胞凋亡与否的鉴定。

目前，将毛细管电泳用于细胞的活性定量检测和细胞浓度计算均尚未见报道。本发明利用毛细管电泳技术，结合细胞台盼蓝染色方法，以单细胞连续进样的方式，使溶液中细胞在电渗流驱动下通过毛细管并在紫外/可见双波长下逐个检测细胞的吸光值，通过双波长比值实现正常细胞，死亡细胞和药物处理后细胞的活性定量分析，建立了细胞死亡率的计算方法。本发明利用毛细管电泳技术，以单细胞连续进样的方式，使溶液中细胞在电渗流驱动下通过毛细管并在紫外波长下逐个检测细胞，以检测到的细胞峰数表示细胞数，建立了细胞浓度的定量计算方法，

发明内容

本发明的目的是为了提供一种单细胞连续流毛细管电泳双波长检测细胞活性的方法，解决常规测量细胞活性的方法中存在人为误差、以及不能进行单细胞定量检测和细胞活性定量分析以及流式细胞仪成本高等问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1)将待测细胞染色，离心，移去上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞。重复离心，清洗细胞3次以上，将细胞外的残留的染料洗去。在清洗后的细胞沉淀中加入细胞固定液，进行细胞固定化，固定时间1小时以上；细胞固定化后，再用PBS清洗细胞两次以上，除去剩余的固定液，得到固定化的细胞。通过对固定化后的细胞进行超声处理5秒～10秒，可破坏细胞聚集现象。

其中：染色剂为细胞活性检测用的染色剂；细胞固定液可为质量百分比在10％以上的甲醛溶液或质量百分比在4％以上的多聚甲醛溶液；细胞沉淀体积与固定液的体积比为1：10～1：20。

2)将固定化的细胞用20～100mM电解质缓冲液配置为10³～10⁴个/ml浓度范围的细胞溶液，置于配备了二极管阵列检测器的毛细管电泳仪正极端进行电泳；同时在紫外和可见双波长下分别检测每个细胞的光吸收值。因不同状态细胞均在紫外光下存在吸收，而经过台盼蓝染色后的细胞还在可见光下存在较强吸收，故以紫外/可见双波长吸收值比值表示该细胞的活性。

其中：缓冲液为硼砂，磷酸盐，醋酸铵中的任意一种；毛细管电泳仪采用的毛细管长度为30～60cm，内径10～100um；电泳电压为10～20kV，检测时采用的紫外光波长范围为200～300nm，可见光波长范围为570～590nm，每次检测的细胞数范围100～200个。

有益效果

1)将细胞染色后人工判断活性的传统细胞生物学方法与现代微量分析技术毛细管电泳结合，使传统的细胞活性人工观察判断获得量值标准，实现了细胞活性的定量分析。

2)通过测定每个细胞活性的信息，可获得群体细胞的活性信息。克服了MTT法测定群体细胞活性信息时，不考虑个体细胞活性信息的不足。

3)建立了细胞计数即细胞浓度测定的毛细管电泳方法。

4)针对细胞常规检测分析，毛细管电泳仪与流式细胞仪相比，在仪器成本，实验成本，操作技术要求和实验过程简单等方面具有极其显著的优势。

5)细胞样品因固定化处理后，样品性质稳定，不受样品保存时间和分析时间的影响，因此大大方便了细胞活性分析，并有利于大批细胞样品的活性检测。由于细胞的台盼蓝染色和其它染色法能适用于各类细胞，因此细胞活性分析方法具有很好的通用性。细胞计数方法也对于各种细胞分析具有通用性。

附图说明

图1为毛细管电泳用于细胞活性检测示意图，其中：1-电极处的电泳缓冲液，2-正负电极，3-毛细管，4-二极管阵列检测器，5-通过毛细管的细胞，EOF为毛细管电泳中产生的电渗流；

图2为正常细胞单细胞连续毛细管电泳214nm和570nm双波长检测的结果；

具体实施方式

实施例1

培养8瓶Hela细胞作为样品(约10⁶个/瓶Hela细胞)。一瓶用作正常细胞、一瓶用于56℃处理15分钟处理的，得到死亡细胞、其余6瓶细胞分别用药物浓度为40，50，60，70，80和90μg/ml的姜黄素进行处理，得到药物处理的待测细胞。对正常细胞，死亡细胞和药物处理待测细胞，分别用质量百分比为0.4％台盼蓝染色3min后用磷酸盐缓冲液清洗细胞，将细胞外的残留的台盼蓝染料洗去。具体方法是对细胞溶液经过离心机1000转/min离心，移去上清液，保留细胞。再加磷酸盐缓冲液，离心，重复3次清洗。在清洗后的细胞溶液中加入200μl的质量百分比为10％甲醛溶液，进行细胞固定化，固定时间12小时。细胞固定化后，再离心、用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞两次以上，除去剩余的甲醛。将细胞以10³～10⁴个/ml的浓度配制在50mM硼砂溶液中，置于正极处电泳。电泳条件是：50mM硼砂为电解质溶液，12kV电压，毛细管长30cm。电泳时，细胞在电渗流的作用下以单细胞的状态向负极迁移，并在毛细管末端经过二极管阵列检测器。记录100个细胞的214nm和570nm波长的吸收值。首先求出正常细胞的570nm/214nm吸收值平均值(m_n)为0.02，其次求出经56℃处理15分钟处理所得的死亡细胞样品(m_d)的570nm/214nm吸收值平均值为0.21，再对40，50，60，70，80和90μg/ml药物处理的待测细胞样品求出570nm/214nm吸收值平均值(mt)，其值分别为0.029，0.034，0.034，0.072，0.132，0.191。