动态核极化(DNP)的方法及用于所述方法的化合物和组合物

摘要

本发明涉及羧酸的动态核极化(DNP)的改良方法及用于所述方法的化合物和组合物。

说明书

本发明涉及羧酸的动态核极化(DNP)的改良方法及用于所述方法的化合物和组合物。

磁共振(MR)显影(MRI)是一种显影技术，这种技术对医生有特别的吸引力，因为它允许以无损伤方式得到患者身体或其部分的图像，而不使患者和医疗人员暴露于潜在有害的辐射，如X-射线。由于高品质图像，MRI是软组织和器官的有利显影技术，并且允许区分正常组织和患病组织，如肿瘤和损伤。

进行MRI可利用或不利用MR造影剂。然而，增强造影的MRI通常使得能够检测非常小的组织变化，使其成为检测早期组织变化的有力工具，如小肿瘤或转移。

在MRI中已使用数种类型的造影剂。水溶顺磁性金属螯合物，例如钆螯合物，如Omniscan^TM(GE Healthcare)，广泛用作MR造影剂。由于其分子量低，如果将它们提供到维管结构，它们会快速分配到胞外空间(即血液和间质组织)。它们也相对快速地从身体清除。

另一方面，血池MR造影剂(例如超顺磁性氧化铁颗粒)，在维管结构内持久保留。已证明它们不仅极有用于增强肝内造影，而且用于检测毛细管渗透性异常，例如在肿瘤中的“漏”毛细管壁，例如由于血管生成。

尽管前述造影剂具有无可争辩地极佳性能，但其使用不是没有任何风险。虽然顺磁性金属螯合物络合物具有通常高稳定性常数，但可能在给药后在身体内释放毒性金属离子。另外，这些类型的造影剂显示不良的专一性。

另一类MR显影剂为超极化MR显影剂。WO-A-99/35508公开一种用超极化高T₁剂溶液作为MRI显影剂MR研究患者的方法。术语“超极化”意味使在高T₁剂中存在的NMR活性核(即，具有非零核自旋的核，优选¹³C-或¹⁵N-核)的核极化作用增强。在增强NMR活性核的核极化作用时，这些核的核自旋激发态和核自旋基态之间的总体差异显著增加，从而MR信号强度放大百倍和更多倍。在使用超极化¹³C-和/或¹⁵N-增浓的高T₁剂时，由于¹³C和/或¹⁵N的天然丰度可以忽略，基本没有来自背景信号的干扰，因此图像对比有利地高。普通MRI造影剂和这些超极化高T₁剂的主要差异是前者的对比变化是通过影响身体中水质子的松弛时间所致，而后一类剂可被认作为非放射性示踪剂，因为得到的信号只从所述剂产生。

用作MR显影剂的各种可能的高T₁剂公开于WO-A-99/35508，包括非内源和内源化合物，如乙酸盐、丙酮酸盐、草酸盐或葡糖酸盐、糖(如葡萄糖或果糖)、脲、酰胺、氨基酸(如谷氨酸盐、甘氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸盐)、核苷酸、维生素(如抗坏血酸)、青霉素衍生物和氨磺酰。另外据称，代谢循环(如柠檬酸循环)中的中间体(如富马酸和丙酮酸)为代谢活性的MR显影的优选显影剂。

在人和非人动物体内代谢过程中起作用的超极化MR显影剂最为有利，因为可用这些超极化显影剂在体内MR研究中得到组织代谢状态的信息，即，它们有用于代谢活性的体内显影。例如，可能用组织的代谢状态信息区别健康组织和患病组织。

丙酮酸盐是在柠檬酸循环中起作用的化合物，超极化的¹³C-丙酮酸盐转化成超极化的代谢物可用于体内MR研究人体中的代谢过程。例如，超极化的¹³C-丙酮酸盐可作为MR显影剂用于体内肿瘤显影，如WO-A-2006/011810和WO-A-2006/011809详述，也可用于通过MR显影评估心肌组织的生存力，如WO-A-2006/054903详述。

丙酮酸盐为人体耐受很好的内源性化合物，甚至在高浓度。作为柠檬酸循环中的前体，丙酮酸盐在人体中起重要的代谢作用。丙酮酸盐转化成不同的化合物：其转氨基作用通过氧化脱羧产生丙氨酸，丙酮酸盐转化成乙酰辅酶A和二氧化碳(进一步转化成碳酸氢盐)，丙酮酸盐还原产生乳酸盐，并导致在草酰乙酸盐中羧化。

另外，超极化的¹³C-丙酮酸盐代谢转化成其代谢物超极化¹³C-乳酸盐、超极化¹³C-碳酸氢盐(只在¹³C₁-丙酮酸盐、¹³C_1，2-丙酮酸盐或¹³C_1，2，3-丙酮酸盐的情况下)和超极化¹³C-丙氨酸可用于体内MR研究人体内的代谢过程。¹³C₁-丙酮酸盐在37℃人全血中具有约42s的T₁松弛，然而已发现，超极化的¹³C-丙酮酸盐转化成超极化¹³C-乳酸盐、超极化¹³C-碳酸氢盐和超极化¹³C-丙氨酸快得足以允许从¹³C-丙酮酸盐母体化合物及其代谢物检测信号。丙氨酸、碳酸氢盐和乳酸盐的量取决于研究下组织的代谢状态。超极化¹³C-乳酸盐、超极化¹³C-碳酸氢盐和超极化¹³C-丙氨酸的MR信号强度与这些化合物的量和在检测时间剩余的极化度相关，因此，通过监测超极化¹³C-丙酮酸盐转化为超极化¹³C-乳酸盐、超极化¹³C-碳酸氢盐和超极化¹³C-丙氨酸，可用无损伤MR显影或MR谱研究人或非人动物体内的体内代谢过程。

从不同丙酮酸盐代谢物产生的MR信号放大随组织类型变化。由丙氨酸、乳酸盐、碳酸氢盐和丙酮酸盐形成的独特代谢峰图案可在检查下用作组织代谢状态的指纹。

必须强调，超极化显影剂的信号由于松驰和在对患者体给药稀释而衰减。因此，显影剂在生物流体(例如，血液)中的T₁值必须足够长(高)，以使所述剂能够在高度超极化状态分布到患者身体中的靶部位。除具有高T₁值的显影剂外，达到高极化度极为有利。如果超极化显影剂具有高极化度，则由于松驰和稀释以相同速率发生衰减，然而通过具有更高“起始度”，在给定时间后超极化显影中保留的极化更高。显影剂中的极化度越高，能够从显影剂检测的MR信号越强。

得到超极化高T₁剂的数种方法公开于WO-A-99/35508，方法之一是动态核极化(DNP)技术，其中样品的极化受极化剂或所谓的DNP剂(包含不成对电子的化合物)影响。在DNP过程中提供通常为微波辐射形式的能量，这种能量将初始激发DNP剂。在衰减到基态时，有从DNP剂的不成对电子到样品NMR活性核的极化转移。通常，在DNP过程中使用中或高磁场和极低温度，例如通过在液态氦和约1T或高于1T的磁场中进行DNP过程。或者，可利用中等磁场和达到足够极化增强的任何温度。DNP技术例如描述于WO-A-98/58272和WO-A-01/96895，两者均通过引用包含在本文中。

DNP剂在DNP过程中起决定性作用，因为它的选择对能够在要极化的样品中达到的极化度有主要影响。已知多种DNP剂，在WO-A-99/35508中称为“OMRI造影剂”。如WO-A-99/35508、WO-A-88/10419、WO-A-90/00904、WO-A-91/12024、WO-A-93/02711或WO-A-96/39367所述，使用基于氧、基于硫或基于碳的稳定三苯甲基自由基在多种不同样品中产生高极化度。

我们现在已意外地发现，将某些Gd-螯合物加入到一种组合物显著增加丙酮酸的极化度，所述组合物包含作为DNP剂的三苯甲基自由基和要由DNP方法极化的丙酮酸。这在一种临床情况尤其有利，其中在患者的MR检查步骤中用超极化丙酮酸盐作为MR显影剂，超极化丙酮酸盐由DNP获得的固体超极化丙酮酸溶于含碱的水性溶解介质得到。如果丙酮酸的极化度可例如增加x倍，则理论上在MR检查步骤中需要使用x分之一浓度的丙酮酸盐。因为能够避免由于高MR显影剂浓度和剂量的可能的不需要的副作用，因此不仅从经济的观点有利，而且从安全的观点也有利。

因此，本发明第一方面提供一种制备固体超极化羧酸的方法，所述方法包括制备一种组合物，所述组合物包含所述羧酸、三苯甲基自由基和式(1)的Gd-螯合物

其中

n为1至10；

x为0至3；

R相同或不同，并且表示氟、直链或支化C₁-C₆-烷基或包含5至10个碳原子的芳族或非芳族环状基团；并且

Q为H、直链或支化C₁-C₆-烷基或包含5至10个碳原子的芳族或非芳族环状基团或

其中n、x和R如上限定；

并且对组合物进行动态核极化作用。

术语“超极化”和“极化”在后文可互换使用，表示核极化度超过0.1％，更优选超过1％，最优选超过10％。

例如，可通过固态NMR测量冷冻的超极化羧酸中的NMR活性核来测定极化度。例如，如果超极化羧酸中的NMR活性核为¹³C，则获取所述超极化羧酸的固态¹³C-NMR。固态¹³C-NMR测量优选由利用低倾倒角的简单脉冲获取NMR序列组成。将NMR谱中超极化羧酸的信号强度与动态核极化过程之前获取的NMR谱中羧酸的信号强度比较。然后从DNP之前和之后信号强度的比率计算极化度。

以类似方式，可通过液态NMR测量液体超极化羧酸中的NMR活性核来测定溶解的超极化羧酸的极化度。同样，将溶解的超极化羧酸的信号强度与动态核极化过程之前的溶解的羧酸的信号强度比较。然后从DNP之前和之后信号强度的比率计算极化度。

术语“羧酸”表示包含至少一个羧基(即COOH-基团)的化学实体。

虽然以单数形式书写，但术语“羧酸”表示一种或多种化学实体，即某一种羧酸或数种不同羧酸，例如数种不同羧酸的混合物。例如，丙酮酸为确定的羧酸，并且可用本发明的方法制备超极化的丙酮酸。又比如，丙酮酸和乳酸为数种不同的羧酸，可用本发明的方法制备超极化的丙酮酸和超极化的乳酸的混合物。

本发明的方法在要被极化的羧酸中产生高极化度。

本发明上下文中的羧酸可以为单羧酸，例如甲酸、乙酸、乳酸、丙酮酸、烟酸或脂肪酸(如棕榈酸或油酸)。在另一个实施方案中，羧酸可以为二或多元羧酸，例如苹果酸、富马酸、琥珀酸、亚甲基丁二酸、丙二酸或柠檬酸或草酸。除包含至少一个羧基外，羧酸可包含其他官能团和/或杂原子。优选的官能团为氨基，包含氨基的羧酸的实例为氨基酸，如标准氨基酸，优选甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸盐、色氨酸和丝氨酸，也包括非标准氨基酸，优选GABA(γ-氨基丁酸)、高半胱氨酸、肌氨酸等。可在羧酸分子中存在的其他优选的官能团为酮基(此类化合物的优选实例为丙酮酸、草酰乙酸或α-酮基戊二酸)或羟基(此类化合物的优选实例为乳酸和水杨酸)。在另一个优选的实施方案中，羧酸包含一个或多个杂原子，例如在烟酸中的氮原子。

在本发明的方法中使用的优选羧酸为候选药物，更优选为小分子(例如小于2000Da)，或数种候选药物的混合物，可在NMR生物测定中用本发明的方法获得的超极化候选药物例如测定对某种受体的结合亲合力或用于酶测定。这些测定描述于WO-A-2003/089656或WO-A-2004/051300，它们优选基于使用液态NMR谱，这意味包含固体超极化候选药物的组合物必须在极化后液化，优选通过溶解或熔融。羧酸可经或可不经同位素增浓。

在另一个优选的实施方案中，在本发明的方法中使用的羧酸将用作MR显影剂。术语“MR显影剂”表示可在MR显影中用作MR显影剂或在MR谱中用作MR谱剂的化合物。在另一个优选的实施方案中，在本发明的方法中使用的羧酸为MR显影剂的前体。对于这两个实施方案，优选的羧酸为内源化合物或内源化合物的前体。后者的实例为诸如丙酮酸的羧酸(前体)，通过例如在DNP过程后使固体超极化丙酮酸溶于含碱的含水溶解介质并用如此得到的溶解的超极化丙酮酸盐作为MR显影剂，可使所述丙酮酸转化成内源化合物丙酮酸盐(衍生物，即羧酸的盐)。优选为内源羧酸或为内源化合物(即在人或非人动物体内代谢过程中起作用的羧酸的内源衍生物)的前体的羧酸。在用这种超极化内源羧酸或羧酸的内源衍生物作为MR显影剂时，可在体内MR研究中得到组织代谢状态的信息，即，这些剂用于代谢活性的体内MR显影和/或MR谱。例如，可能用组织的代谢状态信息区别健康(正常)组织和患病组织。

因此，要在本发明的方法中使用的优选羧酸为马来酸、乙酸、富马酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、草酰乙酸、乳酸和α-酮基戊二酸，这些酸为内源化合物苹果酸盐、乙酸盐、富马酸盐、丙酮酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、草酰乙酸盐、乳酸盐和α-酮基戊二酸盐的前体，这些内源化合物均在人或非人动物体内的代谢过程中起作用。在人或非人动物体内代谢过程中起作用的另一种优选的内源羧酸为烟酸。在人或非人动物体内代谢过程中起作用的其他优选的内源羧酸为氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸、肌氨酸、GABA或高半胱氨酸。最优选的羧酸为丙酮酸、草酰乙酸、α-酮基戊二酸、丙氨酸和甘氨酸。

如果在本发明的方法中使用在人或非人动物体内代谢过程中起作用的内源羧酸或为在人或非人动物体内代谢过程中起作用的羧酸的内源衍生物的前体的羧酸，则这些超极化内源羧酸或羧酸的超极化内源衍生物优选作为MR显影剂用于人或非人动物体内代谢活性的体内分子MR显影和/或化学位移显影和/或MR谱。在这些超极化内源羧酸或羧酸的超极化内源衍生物中，优选为包含显示慢纵向松弛的极化核，以便保持相当高极化足够时间长度，用于转移到人或非人动物体内，并且随后显影的那些化合物。优选的内源羧酸或羧酸的内源衍生物包含具有纵向松弛时间常数(T₁)的核，纵向松弛时间常数(T₁)在0.01至5T的磁场强度和20至40℃范围的温度大于10秒，优选大于30秒，甚至更优选大于60秒。此类如此称谓的“高T₁剂”例如描述于WO-A-99/35508。或者，可能的内源羧酸或羧酸的内源衍生物的T₁值可发现于文献中，或者可通过获取可能的化合物的NMR谱(例如¹³C-NMR谱)，以测定¹³C标记的可能的内源羧酸或羧酸的内源衍生物的T₁来测定。

通常，旨在作为MR显影剂用于体内MR显影和/或化学位移显影和/或MR谱或为此剂的前体的羧酸优选为同位素增浓的化合物，同位素增浓更优选为非零自旋核(MR活性核)的同位素增浓，非零自旋核适合为¹⁵N(如果在化合物中存在)和/或¹³C，更优选为¹³C。同位素增浓可包括在化合物内一个或多个部位选择增浓或所有部位均匀增浓，并且一个部位的增浓优选在具有高T₁值的核。增浓可例如通过化学合成或生物标记达到，两种方法在本领域已知，可根据要被同位素增浓的具体化合物选择适合的方法。

旨在作为体内MR显影剂或为此剂的前体的羧酸的优选实施方案为在分子的仅一个位置同位素增浓的化合物，优选增浓至少10％，更适合至少25％，更优选至少75％，最优选至少90％。理想增浓为100％。

同位素增浓的最佳位置取决于MR活性核的松弛时间。优选在本发明的方法中使用的羧酸在具有长T₁松弛时间(高T₁值)的位置同位素增浓。在本发明的方法中使用的¹³C-增浓的羧酸优选在羧基-C-原子、羰基-C-原子或季C-原子增浓。如果它们在羧酸中存在，当然可只使后两个位置增浓，即如果除了羧基外(例如柠檬酸和氨基酸(除甘氨酸外))，羧酸还包含羰基(例如丙酮酸或α-酮基戊二酸)或季C-原子。

用作MR显影剂的前体的尤其优选的羧酸为¹³C-丙酮酸、¹³C-乙酸、¹³C-草酰乙酸和¹³C-α-酮基戊二酸。这些化合物为¹³C-丙酮酸盐、¹³C-乙酸盐、¹³C-草酰乙酸盐和¹³C-α-酮基戊二酸盐的前体。用作MR显影剂的尤其优选的羧酸还可以为¹³C-丙氨酸和¹³C-甘氨酸，更优选¹³C₁-丙氨酸和¹³C₁-甘氨酸。¹³C-丙酮酸为最优选的羧酸，并且可同位素富集于C1-位(¹³C₁-丙酮酸)、C2-位(¹³C₂-丙酮酸)、C3-位(¹³C₃-丙酮酸)、C1-和C2-位(¹³C_1，2-丙酮酸)、C1-和C3-位(¹³C_1，3-丙酮酸)、C2-和C3-位(¹³C_2，3-丙酮酸)或C1-、C2-和C3-位(¹³C_1，2，3-丙酮酸)。C1-位为丙酮酸13C同位素富集的优选位置。

在另一个优选的实施方案中，由本发明的方法获得的超极化羧酸用于固态NMR谱。在此，超极化固体羧酸可通过静态或幻角自旋固态NMR谱分析。在此实施方案中，可在本发明的方法中使用任何类型和分子大小的羧酸。

在本发明的方法中使用的三苯甲基自由基作为DNP剂，该剂在DNP方法中必不可少，因为DNP剂的大电子自旋极化通过接近电子拉莫尔频率的微波照射在羧酸中转化成核的核自旋极化。微波通过e-e和e-n跃迁激励电子和核自旋系统之间的传递。为了有效DNP，DNP剂必须稳定并且可溶于要被极化的化合物或其溶液，以达到所述化合物和DNP之间紧密接触。此紧密接触为电子和核自旋系统之间前述传递所必须。就此而论，稳定的三苯甲基自由基证明为非常有用的DNP剂。基于氧、基于硫或基于碳的稳定三苯甲基自由基例如描述于WO-A-99/35508、WO-A-88/10419、WO-A-90/00904、WO-A-91/12024、WO-A-93/02711或WO-A-96/39367。

三苯甲基自由基的最佳选择取决于多个方面。如上所述，为了在化合物中产生最佳极化度，三苯甲基自由基和要被极化的化合物必须在DNP过程中紧密接触。因此，在本发明的优选实施方案中，三苯甲基自由基可溶于羧酸或其溶液。如果要被极化的羧酸在室温为液体(例如丙酮酸)，或者使羧酸例如通过在升高的温度熔融转变成液态，则前者为适合的选择。为了制备羧酸的溶液，可使用溶剂或溶剂混合物。然而，如果被极化的羧酸用于体内应用，如作为MR显影剂用于体内MR显影或为此剂的前体，则优选保持溶剂量最低，或者如果可能，避免使用溶剂。为了用作体内MR显影剂，超极化的化合物通常需要以相对高浓度给药，即，包含羧酸、三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物的高浓组合物优选用于DNP过程，因此，优选保持溶剂量最低。在此上下文中，优选保持组合物的质量尽可能小也很重要。如果在DNP过程后用溶解使包含超极化羧酸的固体组合物液化，例如用作MR显影剂或用作前体并在那个溶解过程中转化成MR显影剂，则高质量对溶解过程的效率有负面影响。这是由于对在溶解过程中给定体积的溶解介质，在固体组合物的质量增加时，溶解介质与固体组合物质量之比减小。另外，使用某些溶剂可能需要在用作MR显影剂的超极化羧酸或其衍生物给予患者之前将其除去，因为这些溶剂可能在生理学上不能耐受。

如果在本发明的方法中使用的羧酸为相当亲油/亲水化合物，则三苯甲基自由基也应相当亲油/亲水。三苯甲基自由基的亲油性/亲水性可能受选择给予三苯甲基自由基分子亲油性/亲水性的适合残基影响。另外，三苯甲基自由基必须在羧酸存在下稳定。因此，如果在本发明的方法中使用的羧酸为相当强的酸，例如草酸或丙酮酸，则三苯甲基自由基应在强酸性条件下稳定。如果羧酸还包含反应基，则应使用对这些反应基相对惰性的三苯甲基自由基。从前述明显看出，选择三苯甲基自由基高度依赖在本发明的方法中使用的羧酸的化学性质。

在WO-A-2006/011811中公开的三苯甲基自由基为酸性有机化合物(即羧酸)DNP极化的尤其有用的DNP剂。优选在本发明的方法中使用这些三苯甲基自由基。

在本发明方法的优选实施方案中，羧酸为丙酮酸，更优选为¹³C-丙酮酸，最优选为¹³C₁-丙酮酸，并且三苯甲基自由基为式(2)的三苯甲基自由基

其中

M表示氢或1当量的阳离子；并且

R1相同或不同，表示直链或支化C₁-C₆-烷基或基团-(CH₂)_n-X-R2，

其中

n为1、2或3；

X为O或S；并且

R2为直链或支化C₁-C₄-烷基。

在一个优选的实施方案中，M表示氢或1当量生理学上可耐受的阳离子。术语“生理学上可耐受的阳离子”表示活的人或非人动物体耐受的阳离子。优选M表示氢或碱阳离子、铵离子或有机胺离子(例如葡甲胺)。最优选M表示氢或钠。

在进一步优选的实施方案中，R1相同，更优选为直链或支化C₁-C₄-烷基，最优选为甲基、乙基或异丙基。

在进一步优选的实施方案中，R1相同或不同，优选相同，并且表示-CH₂-OCH₃、-CH₂-OC₂H₅、-CH₂-CH₂-OCH₃、-CH₂-SCH₃、-CH₂-SC₂H₅或-CH₂-CH₂-SCH₃，最优选为-CH₂-CH₂-OCH₃。

在更优选的实施方案中，M表示氢或钠，R1相同并且表示-CH₂-CH₂-OCH₃。

在本发明的方法中使用的三苯甲基自由基可如WO-A-88/10419、WO-A-90/00904、WO-A-91/12024、WO-A-93/02711、WO-A-96/39367和WO-A-2006/011811详述合成。

如上所述，在本发明的方法中使用的Gd-螯合物为式(1)的Gd-螯合物：

其中

n为1至10；

x为0至10；

R相同或不同，并且表示氟、直链或支化C₁-C₆-烷基或包含5至10个碳原子的芳族或非芳族环状基团；并且

Q为H、直链或支化C₁-C₆-烷基或包含5至10个碳原子的芳族或非芳族环状基团或

其中n、x和R如上限定。

在优选的实施方案中，Q为H、直链或支化C₁-C₆-烷基，优选为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基，或者Q与以下基团相同

在以上实施方案的优选实施方案中，n为1至5，更优选1至3。

如果R为直链或支化C₁-C₆-烷基，则R优选为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基。

如果R为包含5至10个碳原子的芳族或非芳族环状基团，则R优选为环戊基、环己基、甲基环戊基、甲基环己基、苄基、苯基或甲苯基。

在一个实施方案中，x为3，并且相同或不同的三个R基团优选在邻位和在对位连接。此实施方案的实例为下列部分：

其中以上部分相当于以下所示式(1)的Gd-螯合物的加框部分：

在另一个实施方案中，x为2，并且相同或不同(优选相同)的两个R基团优选在间位连接。此实施方案的优选实例为以下部分，其中所述部分相当于以上所示式(1)的Gd-螯合物的加框部分：

在一个优选的实施方案中，x为1，并且R基团优选在对位连接。在此实施方案中，R优选选自氟、甲基、异丙基、异丁基和叔丁基，最优选选自甲基和叔丁基。

在另一个优选的实施方案中，x为0，并且n为1至5，优选1至3。

式(1)的Gd-螯合物适合用具有受保护的羧基的DO3A衍生物作原料作为螯合剂来合成。适合的DO3A衍生物为例如1，4，7-三(叔丁氧基羰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷或1，4，7-三(苄基氧基羰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷。这些DO3A衍生物可通过已知方法制备，如美国专利4,885,363或WO-A-96/28433所述，所述专利通过引用结合到本文中。

DO3A衍生物可在溶剂中并且在碱存在下与式(3)的化合物反应

其中L为离去基团，如卤素，优选为氯，并且Q、n、x和R如上限定。

通过在溶剂中并且在碱存在下Rx-取代的胺或胺(在x为0的情况下)与2-卤素乙酰氯(优选2-氯乙酰氯)反应，可得到式(3)的化合物。合成Rx-取代的胺和胺的方法在本领域已知，多种此类Rx-取代的胺和胺可以购得。

在已除去存在的保护基后，例如在具有叔丁氧基保护的羧基的DO3A衍生物情况下通过与三氟乙酸反应，使式(1a)的螯合剂

与适合的Gd³⁺-化合物(如Gd₂O₃)或Gd³⁺-盐(如GdCl₃)在适合的溶剂(例如水)中反应，以得到式(1)的Gd-螯合物，其中Q、n、x和R如上限定。合成式(1a)的螯合剂和式(3)的化合物的其他适合方法描述于美国专利5,737,752，其内容通过引用结合到本文中。

式(1)的Gd-螯合物尤其用于羧酸的DNP极化，因为这些Gd-螯合物在此类酸存在下稳定。这是一个重要的特性，因为Gd-螯合物的络合物离解(解螯)产生游离的Gd³⁺离子，并且对极化具有有害后果。在游离顺磁性金属离子(如Gd³⁺离子)存在下极化衰减快得多，这显著地缩短旨在用作MR显影剂的超极化化合物的“寿命”。

如果要被极化的羧酸为液体或溶于溶剂，则优选使用可溶于液体羧酸或其溶液的式(1)的Gd-螯合物。如果要被极化的羧酸相当亲油，则式(1)的Gd-螯合物也应相当亲油。亲油性可受R基团的适合类型和数目选择的影响。

任选在本发明的方法中使用的包含所述羧酸、三苯甲基自由基和式(1)的Gd-螯合物的组合物进一步包含螯合剂和/或Ca-螯合物。

术语“螯合剂”表示结合(络合)金属离子(例如Gd³⁺)以形成螯合物的化学实体。

可将螯合剂加入到组合物，以避免在DNP过程后在已溶解或熔融包含超极化羧酸或其衍生物的固体组合物后液体组合物中的任何游离Gd³⁺离子。如前所述，游离的Gd³⁺离子对极化具有有害后果，因为在游离顺磁性金属离子(如Gd³⁺离子)存在下极化衰减快得多。这又显著地缩短作为MR显影剂的超极化羧酸或其衍生物的“寿命”。组合物中存在的另外的螯合剂与游离的Gd³⁺离子反应生成Gd螯合物，因此游离的Gd³⁺离子一旦液化(即溶解或熔融)，就被从组合物“清除”。适合的螯合剂为容易并且快速与Gd³⁺离子形成络合物的那些螯合剂，优选为EDTA、DOTA-BOM或DTPA-BMA。这些螯合剂及其合成在本领域已知。在另一个优选的实施方案中，使用式(1a)的螯合剂。

可不用螯合剂，而将包含上述螯合剂的Ca-螯合物加到组合物。效果与加螯合剂类似，因为Ca-螯合物为弱络合物。在游离的Gd³⁺离子存在下，由于上述螯合剂与Gd³⁺比与Ca²⁺形成更强的络合物，在Ca²⁺离子和Gd³⁺离子之间发生交换。然而，由于它们不是顺磁性离子，游离的Ca²⁺离子没有如上所述对极化的有害后果。因此，优选的Ca-螯合物为Ca-EDTA、Ca-DOTA-BOM和Ca-DTPA-BMA。在另一个优选的实施方案中使用式(1b)的Ca-螯合物：

其中Q、n、x和R如上限定。

或者，在本发明的方法中使用的组合物可包含螯合剂和Ca-螯合物两者。所述螯合剂可与Ca-螯合物的螯合剂相同或不同，例如，螯合剂可以为EDTA，且Ca-螯合物可以为Ca-EDTA。在另一个实施方案中，螯合剂可以为EDTA，而Ca-螯合物可以为Ca-DTPA-BMA。在一个优选的实施方案中，螯合剂为式(1a)的螯合剂，而Ca-螯合物为式(1b)的Ca-螯合物。

为了实施本发明的方法，制备包含羧酸、三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物的组合物。

如果在本发明的方法中使用的羧酸在室温为液体(例如丙酮酸)，则使所述液体羧酸与选择的三苯甲基自由基和选择的式(1)的Gd-螯合物并任选与螯合剂和/或Ca-螯合物混合，以形成其中组合物的所有组分紧密接触的组合物。优选选择的三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物可溶于液体羧酸。供选但较不优选，可在适合溶剂(例如水)中制备选择的三苯甲基自由基的溶液和/或选择的式(1)的Gd-螯合物的溶液和/或任选的螯合剂和/或Ca-螯合物的溶液，然后将溶液加入到液体羧酸。

还可通过本领域已知的几种方式促进均匀混合，如搅拌、涡旋或声处理。

如果在本发明的方法中使用的羧酸在室温为固体，则可使羧酸熔融(其条件为不发生羧酸降解)，并使熔融的羧酸与选择的三苯甲基自由基、选择的式(1)的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物混合，如前面段落所述。

在另一个实施方案中，可制备固体羧酸的溶液，例如通过使羧酸溶于适合的溶剂或溶剂混合物，优选溶于为优良玻璃形成剂的溶剂，以防止在冷却/冷冻时组合物结晶。适合的玻璃形成剂为例如甘油、丙二醇或乙二醇。随后使溶解的羧酸与选择的三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物(优选全部作为干燥组分)混合。供选但较不优选，可在适合溶剂(例如水)中制备选择的三苯甲基自由基的溶液和/或选择的式(1)的Gd-螯合物的溶液和/或任选的螯合剂和/或Ca-螯合物的溶液，然后将溶液加入到溶解的羧酸。也可将玻璃形成剂加入到溶于非玻璃形成溶剂的羧酸，以防止在冷却/冷冻时组合物结晶。然而，如前所述，加入溶剂和/或玻璃形成剂应保持必需的最低量。因此，优选的方式是选择可溶于或溶混于羧酸的三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物，其条件为羧酸在室温为液体或者可在不降解下熔融。

三苯甲基自由基的浓度适合在组合物中5至25mM，优选10至20mM。关于式(1)的Gd-螯合物的浓度，适合在组合物中0.1至8mM，0.1至6mM和0.5至4mM的浓度分别为优选和更优选浓度。如果螯合剂和/或Ca-螯合物存在于在本发明的方法中使用的组合物，则所述螯合剂和/或Ca-螯合物在所述组合物中的浓度适合为0.1至10mM，优选0.5至8mM，更优选1.5至7mM。

优选以禁止结晶的方式冷却和/或冷冻组合物。冷却和/或冷冻可通过在本领域已知的方法达到，例如在冷冻机或在液氮中冷冻组合物，或者通过简单地放入DNP极化器，在此液氦将使其冷冻。

在一个实施方案中，使组合物在冷却/冷冻前脱气。脱气可通过氦气鼓泡通过组合物(例如2-15分钟时间)实现，但也可通过其他已知的普通方法实现。

根据本发明的方法，组合物经过动态核极化(DNP)。DNP技术例如描述于WO-A-98/58272和WO-A-01/96895，两者均通过引用包含在本文中。通常，在DNP过程中使用中或高磁场和极低温度，例如通过在液态氦和约1T或高于1T的磁场中进行DNP过程。或者，可利用中磁场和达到足够极化增强的任何温度。在一个优选的实施方案中，DNP过程在液态氦和约1T或高于1T的磁场中进行。适合的极化装置(＝极化器)例如描述于WO-A-02/37132。在一个优选的实施方案中，极化装置包括低温恒温器和极化装置，例如，通过导波器连接到由磁场产生装置(如超导磁体)围绕的中孔中的微波源的微波室。孔向下垂直延伸到接近超导磁体的至少区域“P”的平面，其中磁场强度高得足以使样品核发生极化，例如在1和25T之间。用于探针(即要被极化的组合物)的孔优选可密封，并且可抽空到低压，例如1mbar或更小的压力。探针引入装置，如可移动的输送管，可包含于孔内，并且可将此管从孔的顶部向下插到区域P中微波室内侧的位置。区域P通过液氦冷却到低得足以发生极化的温度，优选0.1至100K级的温度，更优选0.5至10K，最优选1至5K。探针引入装置优选可在其上端以任何适合方式密封，以保持孔内部分真空。探针保持容器，如探针保持杯，可移除地装配到探针引入装置的下端内部。探针保持容器优选由具有低比热容和优良低温性能的轻质材料制成，例如KelF(聚三氟氯乙烯)或PEEK(聚醚醚酮)，并且可以能够容纳多于一个探针的方式设计。

可将探针插入探针保持容器，浸入液氦并用微波照射，优选在200mW以约94GHz的频率。极化度可如本申请第6页上公开监测。

在一个优选的实施方案中，由本发明的方法制备的固体超极化羧酸在随后步骤中液化。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法为制备包含超极化羧酸或其衍生物的液体组合物的方法，所述方法包括制备包含所述羧酸、三苯甲基自由基和式(1)的Gd-螯合物的组合物；对组合物进行动态核极化；并使所述组合物液化。

任选以上组合物包含螯合剂和/或Ca-螯合物。

在本发明上下文中，术语“超极化羧酸”表示已用于制备上述组合物并且在已进行上述方法后超极化的羧酸。术语“超极化羧酸的衍生物”表示超极化化学实体，该超极化化学实体通过在溶解介质中溶解超极化羧酸使组合物液化，使其转化成不同的超极化化学实体而从超极化羧酸衍生。一个实例为在碱中溶解超极化羧酸，并因此使羧基转化成羧酸盐基团，例如使超极化丙酮酸转化成超极化丙酮酸盐或使超极化乙酸转化成超极化乙酸盐。

通过在DNP过程后使固体组合物溶于适合溶剂或溶剂混合物(例如含水载体，如缓冲剂溶液)，或使其熔融，任选利用在适合溶剂或溶剂混合物中的随后溶解步骤或稀释步骤，可进行液化。用于溶解超极化固体组合物的适合方法和装置例如描述于WO-A-02/37132。用于熔融超极化固体组合物的适合方法和装置例如描述于WO-A-02/36005。如果超极化羧酸或其衍生物旨在用作MR显影剂，则优选在含水载体或适合溶剂中溶解包含超极化羧酸的固体组合物，以得到生理学上可耐受的溶液。

如前解释，用于溶解包含超极化羧酸的固体组合物的溶解介质也可为此性质，以使超极化的羧酸转化成不同的超极化化学实体(衍生物)。在此情况下，将超极化的羧酸称为前体。如果例如用包含碱的溶解介质溶解包含超极化羧酸的固体组合物，则将所述超极化的羧酸中和，并转化成超极化的羧酸盐。因此，液体组合物中的超极化化合物为羧酸的盐，而不再是羧酸本身。

在随后的任选步骤从液化组合物除去三苯甲基自由基和/或式(1)的Gd-螯合物和/或任选存在的螯合剂和/或Ca-螯合物和/或Gd-螯合物(即，为螯合剂或Ca-螯合物与游离Gd³⁺离子的反应产物的Gd-螯合物)。如果超极化的羧酸或其衍生物旨在活的人或动物中用作MR显影剂，则优选从液化组合物除去三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物和任选存在的螯合剂和/或Ca-螯合物和/或其Gd-螯合物(后文也称为“前述化合物”)。

用于除去三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物、螯合剂和/或Ca-螯合物和/或Gd-螯合物的方法在本领域已知。通常，可应用的方法取决于已用于制备本发明方法所用组合物的前述化合物的确切性质和化学特性。在溶解或熔融包含超极化羧酸的固体组合物时，三苯甲基自由基和/或式(1)的Gd-螯合物和/或螯合剂和/或Ca-螯合物和/或Gd-螯合物可能沉淀，因此可很容易地通过过滤从液体组合物分离。是否发生沉淀当然取决于溶剂和前述化合物的性质。

如果不发生沉淀，则可通过层析分离技术除去三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物、螯合剂、Ca-螯合物和Gd-螯合物，例如液相层析(如反相层析)、(固相)萃取或在本领域已知的其他层析分离方法。由于在液体组合物中超极化羧酸或其衍生物中的极化由于T₁松弛衰减，因此一般优选使用能够在一个步骤除去所有前述化合物的方法。前述化合物从液体组合物除去得越快，极化度保持越高。因此，不仅是从待极化羧酸、三苯甲基自由基和式(1)的Gd-螯合物之间有紧密接触的观点，而且是从快而有效除去的观点，有益选择具有类似化学性质的三苯甲基自由基和式(1)的Gd-螯合物。这当然也适用于选择螯合物和/或Ca-螯合物，若是那些化合物用于本发明方法所用的组合物。如果例如使用相当亲油的三苯甲基自由基和相当亲油的式(1)的Gd-螯合物，并且任选使用相当亲油的螯合剂和/或Ca-螯合物，则可全部在一个步骤在单一层析柱上通过反相液体层析除去。

在除去前述化合物后，可检验液体组合物的残余三苯甲基自由基和/或式(1)的Gd-螯合物以及任选存在的螯合剂、Ca-螯合物和Gd-螯合物的残余量。

由于三苯甲基自由基具有特征UV/可见吸收光谱，因此，可用UV/可见吸收测量作为一种方法检验其在除去后在液体组合物中的存在。为了得到定量结果，即在液体组合物中存在的三苯甲基自由基的浓度，可校准光学分光计，使得在特定波长从液体组合物等分试样的吸收得到在液体组合物中相应的三苯甲基自由基浓度。

由于在式(1)的Gd-螯合物中存在芳族基团，也可用UV/可见吸收测量作为一种方法检验式(1)的Gd-螯合物的存在。通过如前面段落所述校准分光计，也可得到定量结果。如果式(1b)的螯合剂和/或式(1b)的Ca-螯合物已用于在本发明的方法中使用的组合物，则由于它们均包含芳族基团，也可用相同的UV/可见吸收测量作为一种方法检验这些化合物的存在。

在优选的实施方案中，本发明的方法用于制备液体MR显影剂，并且在本发明的方法中使用的组合物通过溶解液化，优选在生理学上可耐受的含水载体(如缓冲溶液)中溶解。

在本发明方法的另一个优选的实施方案中，所述组合物包含¹³C-丙酮酸(优选¹³C₁-丙酮酸)、式(2)的三苯甲基自由基和式(1)的Gd-螯合物。由于¹³C₁-丙酮酸为相当亲油的化合物，因此优选选择相当亲油的式(2)的三苯甲基自由基和相当亲油的式(1)的Gd-螯合物。

在更优选的实施方案中使用式(2)的三苯甲基自由基，其中M表示氢或钠，R1相同并且表示-CH₂-CH₂-OCH₃，并使用式(1)的Gd-螯合物，其中Q为H，n为1至3，x为0或1，并且R基团(如果存在)在对位连接。在很优选的实施方案中，Q为H，n为1至3，x为1，并且在对位连接的R为甲基、异丙基、异丁基和叔丁基，最优选甲基和叔丁基。由于在丙酮酸存在下稳定，式(1)的这些Gd-螯合物不仅尤其用于丙酮酸的DNP极化，而且可在单一步骤与式(2)的三苯甲基自由基一起除去。任选将式(1a)的螯合剂和/或式(1b)的Ca-螯合物加入到组合物。

在此优选的实施方案中，通过在¹³C-丙酮酸中溶解前述三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物和任选的螯合剂(1a)和/或Ca-螯合物(1b)制备所述组合物。使组合物的组分彻底混合，并使组合物冷却和/或冷冻。在动态核极化后，将包含超极化¹³C-丙酮酸的固体组合物溶解或熔融，然后转化成超极化的¹³C-丙酮酸盐，或者同时溶解和转化。

在一个实施方案中，使包含超极化¹³C-丙酮酸的固体组合物与液体碱反应，以使其同时溶解并转化成¹³C-丙酮酸盐，随后加入缓冲溶液(优选生理学上可耐受的缓冲溶液)，以完成溶解，并任选使残余的¹³C-丙酮酸转化成¹³C-丙酮酸盐。在一个优选的实施方案中，碱为NaOH、Na₂CO₃或NaHCO₃的水溶液，更优选NaOH的水溶液。缓冲溶液适合为包含缓冲剂的生理学上可耐受的缓冲溶液，缓冲剂缓冲于约pH7至8，例如磷酸盐缓冲剂(KH₂PO₄/Na₂HPO₄)、ACES、PIPES、咪唑/HCl、BES、MOPS、HEPES、TES、TRIS、HEPPS或TRICIN。优选使用TRIS缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液。缓冲溶液可进一步包含诸如EDTA、DTPA-BMA或DOTA-BOM一类的螯合剂，以络合可能存在的任何游离Gd³⁺离子。在另一个优选的实施方案中，将缓冲溶液和碱混合成一种碱性溶液，并将此溶液加入到包含超极化¹³C-丙酮酸的固体组合物，并使¹³C-丙酮酸同时溶解并转化成¹³C-丙酮酸盐。

优选除去上述式(1)的Gd-螯合物、式(2)的三苯甲基自由基和任选的式(1a)的螯合剂和/或式(1b)的Ca-螯合物，适合通过使用反相液体层析除去，因为这允许同时除去所有上述化合物。

任选检验包含超极化¹³C-丙酮酸盐的液体组合物的前述残余化合物，例如使用前面在本申请中所述的方法。

为了用作体内MR显影剂，包含由本发明的方法获得的超极化羧酸或其衍生物的液体组合物作为一种组合物提供，即，适合给予活的人或非人动物体的显影介质。显影介质优选包含生理学上可耐受的含水载体，如上述缓冲溶液、水或盐水。显影介质可进一步包含普通的药学上可接受的载体、赋形剂和制剂助剂。因此，显影介质可例如包含稳定剂、重量克分子渗透浓度调节剂、增溶剂等。

优选胃肠外给予所述体(优选静脉内)包括用于体内MR显影(即在活的人或非人动物体中)的液体组合物的显影介质，所述液体组合物包含由本发明的方法获得的超极化羧酸或其衍生物。

一般在检查下的活人或非人动物体位于MR磁体中。专用的MR-RF-线圈布置成覆盖感兴趣的区域。显影介质的剂量和浓度将依赖多种因素，如毒性和给药途径。在给药后小于400s，优选小于120s，更优选在给药后小于60s，尤其优选20至50s，施加MR显影序列来编码所感兴趣的体积。

为了用作用于体外NMR测定或用于离体组织或分离器官的MR显影或MR谱的剂，由本发明的方法获得的包含超极化羧酸或其衍生物的液体组合物作为一种组合物提供，即，适用于加入到例如分离蛋白(如受体、酶)、细胞培养、从人或非人体得到的样品(例如血液、尿或唾液)、离体组织(如生检组织或分离器官)的显影介质。对本领域的技术人员显而易见，药学上可接受的载体、赋形剂和制剂助剂可存在于显影介质，但不需要为此目的存在，因此，显影介质优选包含含水载体，如上述缓冲溶液或缓冲溶液的混合物，并且可包含一种或多种非水溶剂，如DMSO或甲醇(尤其用于体外NMR)。

可用包括含超极化羧酸或其衍生物的液体组合物的显影介质作为“普通的”MR显影介质，即为解剖学显影提供对比增强。如果超极化羧酸或其衍生物为在人或非人动物体内的代谢途径中起作用的化合物，则可将所述显影介质用于体内代谢MR显影，因此在检查下提供组织代谢状态的信息。

如上所述，丙酮酸盐是柠檬酸循环中的化合物，因此，可用超极化的13C-丙酮酸盐作为肿瘤显影的显影剂，如WO-A-2006/011810所详述。

另外，用超极化的¹³C-丙酮酸盐作为显影剂评价心肌组织的生存力已详述于WO-A-2006/054903。

本发明的另一方面为包含羧酸、三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物的组合物。优选所述组合物用于动态核极化。所述组合物的优选实施方案，即优选的羧酸、三苯甲基自由基和式(1)的Gd-螯合物，已在本申请前面描述。

本发明的另一方面为包含超极化羧酸或其衍生物(优选羧酸的盐)、三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物的组合物，其中所述组合物通过动态核极化获得。在更优选的实施方案中，所述组合物为通过动态核极化，随后溶解或熔融由动态核极化获得的固体组合物得到的液体组合物。

本发明的另一方面为包含三苯甲基自由基和式(1)的Gd-螯合物的极化剂。优选所述极化剂用于由动态核极化使羧酸极化。

本发明的另一个方面为式(1)的新的Gd-螯合物：

其中

n为1至10；

x为0至3；

R相同或不同，并且表示氟、直链或支化C₁-C₆-烷基或包含5至10个碳原子的芳族或非芳族环状基团；并且

Q为H、直链或支化C₁-C₆-烷基或包含5至10个碳原子的芳族或非芳族环状基团或

其中n、x和R如上限定。

式(1)的Gd-螯合物的优选实施方案在本申请前面描述。

本发明的新Gd-螯合物可用于羧酸的动态核极化，如本申请所述。然而，它们也可用作MR活性化合物，即在MR显影所用造影介质中的显影剂。

本发明的另一个方面为式(1a)的新螯合剂

其中

n为1至10；

x为0至3；

R相同或不同，并且表示氟、直链或支化的C₁-C₆-烷基或包含5至10个碳原子的芳族或非芳族环状基团，其条件为如果Q为H并且x为0，则n为2至10，优选2至5，更优选2至3；并且

Q为H、直链或支化的C₁-C₆-烷基或包含5至10个碳原子的芳族或非芳族环状基团或

其中n、x和R如上限定。

式(1a)的螯合剂的优选实施方案与式(1)的Gd-螯合物的优选实施方案相同，并且在本申请前面描述。

本发明的另一方面为通过在溶剂中并且在碱存在下使具有受保护的羧基的DO3A衍生物(优选1，4，7-三(叔丁氧基羰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷)与式(3)的化合物反应制备上述式(1a)的螯合剂的方法

其中L为离去基团，如卤素，优选为氯，并且Q、n、x和R如以前对式(1a)所限定，随后除去保护基。

本发明的另一个方面为制备式(1)的Gd-螯合物的方法，所述方法包括

a)在溶剂中并且在碱存在下使具有受保护的羧基的DO3A衍生物(优选1，4，7-三(叔丁氧基羰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷)与式(3)的化合物反应

其中L为离去基团，如卤素，优选为氯，并且Q、n、x和R如以前对式(1)所限定

b)除去保护基；和

c)使步骤b)的反应产物与Gd³⁺-化合物(优选GdCl₃)在溶剂(优选水)中反应。

本发明的另一方面为一种试剂盒，所述试剂盒包括使用说明书和包含用于动态核极化的组合物的一个或多个小瓶，所述组合物包含羧酸、三苯甲基自由基和式(1)的Gd-螯合物，并且进一步任选包含螯合剂和/或Ca-螯合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括包含组合物的单个小瓶，所述组合物包含羧酸、三苯甲基自由基和式(1)的Gd-螯合物及任选的螯合剂和/或Ca-螯合物。在另一个实施方案中，所述试剂盒包含第一小瓶和第二小瓶，第一小瓶包含含有羧酸和三苯甲基自由基的组合物，第二小瓶包含式(1)的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物。第一小瓶和第二小瓶的内容物在动态核极化之前混合。小瓶中的组合物可以为干燥物质的组合物，即所有化合物均可为固体。或者，组合物可以为液体组合物，即，可将化合物溶于溶剂，或者如果化合物之一为液体，可将各化合物溶于所述液体化合物。

在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒包括使用说明书和包含用于动态核极化的组合物的小瓶，所述组合物包含¹³C-丙酮酸(优选¹³C₁-丙酮酸)、式(2)的三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物。

实施例

实施例1a合成三苯甲基自由基三(8-羧基-2，2，6，6-(四(甲氧基乙基)苯并-[1，2-4，5′]双-(1，3)二硫杂环戊二烯-4-基)甲基钠盐，式(2)的三苯甲基自由基

在氩气气氛下，使根据WO-A1-98/39277的实施例7合成的10g(70mmol)三(8-羧基-2，2，6，6-(四(羟基乙基)苯并-[1，2-4，5′]-双-(1，3)-二硫杂环戊二烯-4-基)甲基钠盐悬浮于280ml二甲基乙酰胺。加入氢化钠(2.75g)，随后加入甲基碘(5.2ml)，并使轻微放热的反应在34℃水浴中进行1小时。加入氢化钠和甲基碘重复两次，各化合物量相同，并且在最后加入后，在室温搅拌混合物68小时，然后倒入500ml水中。用40ml1M NaOH(含水)将pH调节到pH>13，并将混合物在环境温度搅拌15小时，以使生成的甲酯水解。然后用50ml 2M HCl(含水)将混合物酸化至pH约2，并用乙酸乙酯萃取3次(500ml和2x200ml)。合并的有机相经Na₂SO₄干燥，然后蒸发至干。粗产物(24g)用乙腈/水作为洗脱液通过制备HPLC纯化。使收集的部分蒸发，以除去乙腈。剩余的水相用乙酸乙酯萃取，有机相经Na₂SO₄干燥，然后蒸发至干。将水(200ml)加入到残余物，用0.1M NaOH(含水)将pH小心调节至7，在此过程中残余物缓慢溶解。中和后，将水溶液冷冻干燥。

实施例2合成1，4，7-三(羰基甲基)-10-((4-叔丁基)-苄基氨基羰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷，式(1a)的螯合剂

所有化学药品购自Sigma-Aldrich或Fluka。如WO-A-96/28433所述制备1，4，7-三(叔丁氧基羰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷。

2a制备2-氯-N-(4-叔丁基苯基甲基)-乙酰胺

在室温向市售的二氯甲烷(100ml)中4-叔丁基苄基胺(8.16g，50mmol)和碳酸钾(7.95g，57.5mmol)的悬浮体滴加二氯甲烷(25ml)中2-氯乙酰氯(6.21g，55mmol)的溶液。在室温搅拌反应混合物30分钟后，使反应混合物回流4小时。使反应混合物冷却并加入水(100ml)。使相分离，有机相经MgSO₄干燥，并在真空中蒸发。标题化合物作为白色结晶物质得到，所述物质无需进一步纯化即可用于下一步骤。

2b制备1，4，7-三(叔丁氧基羰基甲基)-10-((4-叔丁基)-苄基氨基羰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷

将乙腈(100ml)中1，4，7-三(叔丁氧基羰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷(7.57g，12.7mmol)、从实施例2a得到的2-氯-N-(4-叔丁基苯基甲基)-乙酰胺(3.60g，15mmol)和碳酸钾(5.53g，40mmol)的反应混合物加热到75℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却到室温并且过滤。使滤液在真空中蒸发，残余物经过快速层析(二氧化硅，MeOH/CHCl₃)。将包含产物的部分合并，并在真空中蒸发，得到标题化合物，为一种在储存时结晶的黄色油。

2c1，4，7-三(羰基甲基)-10-((4-叔丁基)苄基氨基羰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷

将来自实施例2b的1，4，7-三(叔丁氧基羰基甲基)-10-((4-叔丁基)-苄基氨基羰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷(3.59g，5mmol)在氮气气氛下溶于三氟乙酸(25ml)。在室温搅拌反应过夜，然后在真空中蒸发。将残余物溶于水(10ml)，并在真空中蒸发。使残余物重新溶于水(10ml)，加入交联的聚4-乙烯基吡啶(Reillex^TM425，5.2g)，并在过滤前搅拌混合物20分钟。使滤液经过冷冻干燥，得到标题化合物，为一种白色吸湿物质。

以类似方式，从以下胺和Rx-取代的胺开始制备式(1a)的其他螯合剂：

·4-甲基苄基胺，得到式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为1，并且R为甲基；

·4-乙基苄基胺，得到式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为1，并且R为乙基；

·4-异丙基苄基胺，得到式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为1，并且R为异丙基；

·2，4，6-三甲基苄基胺，得到式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为3，并且所有的R均为在邻位和对位连接的甲基；

·3，5-二甲基苄基胺，得到式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为2，并且所有的R均为在间位的甲基

·4-苯基苄基胺，得到式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为1，并且R为苯基

·4-氟苄基胺，得到式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为1，并且R为F

·苯基丙基胺，得到式(1a)的螯合剂，其中n为3，并且x为0

·苄基胺，得到式(1a)的螯合剂，其中n为1，并且x为0

实施例3制备1，4，7-三(羰基甲基)-10-((4-叔丁基)苄基氨基羰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷合钆，式(1)的Gd-螯合物

在室温水(10ml)中溶解1，4，7-三(羰基甲基)-10-((4-叔丁基)-苄基氨基羰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷(1.10g，2mmol)和GdCl₃六水合物(0.74g，2mmol)。将反应混合物加热到90℃并搅拌2小时，通过加入1M含水NaOH将pH连续调节至7。然后将反应混合物冷却到室温，并将pH调节至9(含水NaOH，1M)。过滤得到的不透明混合物，并通过加入含水HCl(1M)将pH调节至7。使混合物经过冷冻干燥，得到标题化合物，为一种白色结晶物质。

以类似方式，从以下式(1a)的螯合物开始制备式(1)的其他Gd-螯合物

·式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为1，并且R为甲基；

·式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为1，并且R为乙基；

·式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为1，并且R为异丙基；

·式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为3，并且所有的R均为在邻位和对位连接的甲基；

·式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为2，并且所有的R均为在间位的甲基

·式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为1，并且R为苯基

·式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为1，并且R为F

·式(1a)的螯合剂，其中n为3，并且x为0

·式(1a)的螯合剂，其中n为1，并且x为0

实施例4在没有式(1)的Gd-螯合物存在下制备超极化¹³C₁-丙酮酸盐的溶液(比较实施例)

通过在¹³C₁-丙酮酸(164μl)中溶解三苯甲基自由基制备一种组合物，所述组合物具有15mM实施例1的三苯甲基自由基。将组合物混合至均匀，放入探针保持容器，并插入DNP极化器中。

在用微波(93.950GHz)照射下，使组合物在1.2K在3.35T磁场中DNP条件下极化。通过¹³C-NMR监测固态极化，并且继续极化，直到达到22％最大极化，即在显示NMR信号-时间的曲线图中得到饱和曲线。

使用WO-A-02/37132的溶解装置，将包含超极化¹³C₁-丙酮酸的固体组合物溶于氢氧化钠、三(羟基甲基)氨基甲烷(TRIS)和ETDA(0.3mM)的水溶液，以得到超极化¹³C₁-丙酮酸钠的中性溶液。将层析柱与溶解装置串联。柱由包含Varian提供的疏水填充材料(Bondesil-C18，40UM Part #：12213012)的柱体(D＝38mm；h＝10mm)组成。迫使溶液通过选择性吸附三苯甲基自由基的柱。过滤后的溶液用UV分光光度计在469nm分析，并将残余的三苯甲基自由基浓度测定到低于0.1μM检出限。

实施例5在式(1)的Gd-螯合物存在下制备超极化¹³C₁-丙酮酸盐的溶液

具有15mM实施例1的三苯甲基自由基、1.5mM式(1)的Gd-螯合物和3mM相应的式(1a)的螯合剂的组合物通过在¹³C₁-丙酮酸(164μl)中溶解前述化合物制备。将组合物混合至均匀，放入探针保持容器，并插入DNP极化器中。

用以下化合物作为式(1)的Gd-螯合物：

Gd-螯合物A：式(1)的Gd-螯合物，其中n为1，x为1，并且R为甲基；

Gd-螯合物B：式(1)的Gd-螯合物，其中n为1，x为1，并且R为叔丁基；

Gd-螯合物C：式(1)的Gd-螯合物，其中n为3，并且x为0；和

Gd-螯合物D：式(1)的Gd-螯合物，其中n为1，并且x为0

式(1a)的相应螯合剂为：

螯合剂A：式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为1，并且R为甲基；

螯合剂B：式(1a)的螯合剂，其中n为1，x为1，并且R为叔丁基；

螯合剂C：式(1a)的螯合剂，其中n为3，并且x为0；和

螯合剂D：式(1a)的螯合剂，其中n为1，并且x为0

如实施例4中所述进行DNP极化和固态极化的检测。

经检测，对包含以下组分的组合物得到的最大固态极化如下

Gd-螯合物A：31％极化

Gd-螯合物B：29％极化

Gd-螯合物C：34％极化

Gd-螯合物D：34％极化

因此，与实施例4中得到的极化比较，通过将式(1)的Gd-螯合物加入到要被极化的组合物，可提高极化约31-55％。

使用WO-A-02/37132的溶解装置，将包含超极化¹³C₁-丙酮酸的固体组合物溶于氢氧化钠和三(羟基甲基)氨基甲烷(TRIS)及DTPAB-MA(1.5mM)的水溶液，以得到超极化¹³C₁-丙酮酸钠的中性溶液。将层析柱与溶解装置串联。柱由包含Varian提供的疏水填充材料(Bondesil-C18，40UM Part #：12213012)的柱体(D＝38mm；h＝10mm)组成。迫使溶液通过选择性吸附三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物和相应螯合剂的柱。在过滤后，溶液用UV分光光度计在469nm分析，并测定残余的三苯甲基自由基、式(1)的Gd-螯合物和相应螯合剂的浓度。发现三苯甲基自由基的浓度低于0.1μM检出限，式(1)的Gd-螯合物和相应螯合剂的浓度低于10μM检出限。