丝素蛋白/P(LLA－CL)复合纳米纤维组织修复支架的制备方法

摘要

本发明涉及一种丝素蛋白/P(LLA－CL)复合纳米纤维组织修复支架的制备方法，包括：(1)将去蛹蚕茧在0.5％Na2CO3水溶液中煮，洗净烘干，然后溶解于三元溶剂，恒温水解，透析70－72h，预冷冻，然后在－(45－58)℃冷冻干燥；(2)将丝素蛋白溶于六氟异丙醇，搅拌溶解；(3)将P(LLA－CL)溶于六氟异丙醇，搅拌溶解；(4)将丝素蛋白溶液和P(LLA－CL)溶液混合，搅拌均匀；(5)将共混静电纺丝液进行静电纺丝，得到丝素蛋白/P(LLA－CL)复合纳米纤维。该制备方法简单易行，原材料资源丰富，易实现工业化生产；制得的复合纳米纤维具有良好的生物相容性、良好的机械性能及较高的孔隙率。

说明书

技术领域

本发明属静电纺丝复合纳米纤维的制备领域，特别是涉及丝素蛋白/P(LLA-CL)复合纳米纤维组织修复支架的制备方法。

背景技术

组织工程与再生医学的发展为重建或修复人类病损组织与器官提供了有效的治疗手段。可降解支架为细胞生长和组织再生提供必要的空间与支撑，为信号传导提供有效渠道，是决定组织工程成败的关键因素之一。

支架材料的设计应该最大限度仿生人体细胞外基质(ECM)的结构与功能特点，才能有效解决材料的生物相容性问题，调控生物信号的传导，诱导细胞和组织生长，促进机体再生与修复。人体内细胞外基质本质上是由蛋白质和糖氨聚糖(GAGs)交联而成的纳米纤维凝胶网络，纤维直径通常为50-500nm[1]。细胞通过细胞膜上的受体系统与细胞外基质上的配体特异性结合并对外界信号做出反应，影响细胞行为。

丝素蛋白是由蚕茧脱胶而来，是一种天然的蛋白质，具有良好的生物相容性、生物可降解性、良好的透气、透湿性、无免疫原性等优异的性能。被广泛应用于皮肤、骨、软骨、肌腱、神经导管、血管等组织的修复和再生。Park等[2]以甲酸为溶剂静电纺制备的丝素蛋白纳米纤维膜能促进老鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)粘附、增殖、分化，能诱导骨钙素的产生，促进骨组织修复和再生，中国专利CN1844509A公开了“一种丝素蛋白多孔材料的制备方法”，是以水为溶剂静电纺制备了生物相容性好、孔隙高的纳米纤维，但是单一的丝素蛋白纳米纤维质脆、柔韧性差，降低了其实用价值。组织工程支架的最佳的设计是从结构，组成和功能上仿生细胞外基质，并提供给组织生长提供一定的力学支持。

P(LLA-CL)是聚乳酸和聚己内酯的共聚物，由于其具有良好的生物可降解性和良好的机械性能，近年来，被广泛应用于组织工程和药物释放领域[3，4]。但是P(LLA-CL)的最大缺点是不能为组织生长提供生物信号[5]，不利于细胞的黏附和生长。因此，将丝素蛋白和P(LLA-CL)共混可以结合二者的优点，既能为组织生长提供生物信号，促进细胞的粘附、增殖、分化，又具有较高的力学性能和可控的降解速率，满足替代组织功能的需要。

因此，将丝素蛋白和P(LLA-CL)共混制备的复合纳米纤维支架有望筛选出从结构和功能上仿生细胞外基质的理想的组织工程支架，特别适用于力学性能要求高的管状支架，如血管、神经导管等。并且将丝素蛋白和P(LLA-CL)共混制备的复合纳米纤维的方法至今未见报道。

参考文献：

[1]Piez KA.Molecular and aggregate structures of the collagens.In：Reddi AH，editor.Extracellular Matrix Biochemistry.New York：Elsevier，1984，1-35.

[2]Kim KH，Jeong L，Park WH，et al.Biological efficacy of silk fibroin nanofiber membranesfor guided bone regeneration，J Biotechnol，2005，120：327-339.

[3]Kwon IK，Kidoaki S，Matsuda T.Electrospun nano-to microfiber fabrics made ofbiodegradable copolyesters：structural characteristics，mechanical properties and cell adhesionpotential，Biomaterials，2005，26：3929-3939.

[4]Mo XM，Xu CY，Kotaki M，Ramakrishna S.Electrospun P(LLA-CL)nanofiber：abiomimetic extracellular matrix for smooth muscle cell and endothelial cell proliferation，Biomaterials，2004，25：1883-1890.

[5]Kim BS，Mooney DJ.Development of biocompatible synthetic extracellular matrices fortissue engineering.Trends Biotechnol.1998，16：224-228

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种丝素蛋白/P(LLA-CL)复合纳米纤维组织修复支架的制备方法，该制备方法简单易行，原材料资源丰富，易实现工业化生产；制得的丝素蛋白/P(LLA-CL)复合纳米纤维具有良好的生物相容性、良好的机械性能及较高的孔隙率，并且可以通过不同比例的共混，得到不同性能的复合纳米纤维，满足不同的组织工程支架的需要，用作皮肤、软骨、血管、神经导管等组织修复支架。

本发明的一种丝素蛋白/P(LLA-CL)复合纳米纤维组织修复支架的制备方法，包括：

(1)将去蛹蚕茧在100℃的质量百分比为0.5％Na₂CO₃水溶液中煮3-5次，每次30min-50min，用蒸馏水充分洗净，于45℃-48℃烘干，将烘干后的蚕丝纤维以浴比1∶10-15溶解于摩尔比为1:2:8的CaCl₂、C₂H₅OH和H₂O的三元溶剂，于60℃-70℃恒温水解1-2h，然后用蒸馏水透析70-72h，再放入—(70-80)℃预冷冻12-18h，然后在—(45-58)℃冷冻干燥，得到疏松的多孔状固体丝素蛋白；

(2)将步骤(1)丝素蛋白溶于六氟异丙醇，常温下搅拌至完全溶解，得到浓度为4-10％g/ml的丝素蛋白溶液；

(3)将P(LLA-CL)溶于六氟异丙醇，常温下搅拌至完全溶解，得到浓度为4-10％g/ml的P(LLA-CL)溶液；

(4)将丝素蛋白溶液和步骤(3)P(LLA-CL)溶液混合，其中丝素蛋白占溶质总质量的10％-90％，P(LLA-CL)占溶质总质量的90％-10％，总溶质占溶剂的质量体积百分比为4-10％，搅拌均匀，得到共混静电纺丝液；

(5)将步骤(4)共混静电纺丝液进行静电纺丝，调整静电纺丝工艺参数，控制电压为8-15千伏，电场距离为60-200毫米，纺丝速率为0.5-1.5毫升/小时，得到丝素蛋白/P(LLA-CL)复合纳米纤维。

所述步骤(3)中的P(LLA-CL)是摩尔比为50:50的聚乳酸和聚己内酯的无规共聚物。

所述步骤(4)溶质为丝素蛋白和P(LLA-CL)。

所述步骤(5)丝素蛋白/P(LLA-CL)复合纳米纤维的直径随纺丝溶液浓度增大逐渐增大，随丝素蛋白含量的增加逐渐减小。

所述的丝素蛋白/P(LLA-CL)复合纳米纤维应用于生物医学领域组织工程的研究。

有益效果

(1)该制备方法简单易行，原材料资源丰富，易实现工业化生产；

(2)本发明制得的丝素蛋白/P(LLA-CL)复合纳米纤维具有良好的生物相容性、良好的机械性能及较高的孔隙率，并且可以通过不同比例的共混，得到不同性能的复合纳米纤维，满足不同的组织工程支架的需要，用作皮肤、软骨、血管、神经导管等组织修复支架；

(3)制得的复合纤维能够很好的仿生天然细胞外基质的结构、组成和功能，是理想的组织工程支架。

附图说明

图1总质量体积比为8％，其中丝素蛋白/P(LLA-CL)为50:50的复合静电纺纳米纤维的扫描电镜照片

图2总质量体积比为8％，其中丝素蛋白/P(LLA-CL)为25:75的复合静电纺纳米纤维的扫描电镜照片

图3总质量体积比为8％，其中丝素蛋白/P(LLA-CL)为50:50的复合静电纺纳米纤维膜的扫描电镜照片

图4总质量体积比为8％，其中丝素蛋白/P(LLA-CL)为50:50的复合静电纺纳米纤维管的扫描电镜照片

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

先将100克蚕茧加入到1升0.5％Na₂CO₃水溶液中，煮沸30min，重复处理三次，用蒸馏水充分洗净，洗净后放入45℃的干燥箱中烘干，得到脱胶后的蚕丝纤维。以CaCl₂:C₂H₅OH:H₂O＝1:2:8的摩尔比配制三元溶剂，将蚕丝纤维以1:10的浴比，置于70℃的水浴锅内恒温水解1h，得到完全溶解的棕黄色的蚕丝纤维水解溶液。水解液装入透析袋中，用蒸馏水透析72h，将透析好的蚕丝纤维水解溶液放入—80℃预冻12h，然后在-58℃冷冻干燥至干，得到白色，无味，疏松的多孔状固体丝素蛋白。

将0.8克丝素蛋白溶于10毫升六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到浓度为8％(克/毫升)的丝素蛋白溶液；将0.8克P(LLA-CL)溶于10毫升六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到浓度为8％(克/毫升)的P(LLA-CL)溶液；将两种溶液以体积比25:75，溶质的质量比25:75混合，得到总浓度为8％的混合溶液。将混合溶液进行静电纺丝，纺丝条件：电压，12千伏；电场距离，130毫米；纺丝速率，1.2毫升/小时，得到平均纤维直径为237纳米的复合纳米纤维膜。

实施例二

称取按照实施例一中制备的丝素蛋白0.8克，溶于10毫升六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到浓度为8％(克/毫升)的丝素蛋白溶液；将0.8克P(LLA-CL)溶于10毫升六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到浓度为8％(克/毫升)的P(LLA-CL)溶液；将两种溶液以体积比50:50，溶质的质量比50:50混合，得到总浓度为8％的混合溶液。将混合溶液进行静电纺丝，纺丝条件：电压，12千伏；电场距离，130毫米；纺丝速率，1.2毫升/小时，得到平均纤维直径为212纳米的复合纳米纤维膜。

实施例三

称取按照实施例一中制备的丝素蛋白0.8克，溶于10毫升六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到浓度为8％(克/毫升)的丝素蛋白溶液；将0.8克P(LLA-CL)溶于10毫升六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到浓度为8％(克/毫升)的P(LLA-CL)溶液；将两种溶液以体积比50:50，溶质的质量比50:50混合，得到总浓度为8％的混合溶液。将混合溶液进行静电纺丝，纺丝条件：电压，12千伏；电场距离，130毫米；纺丝速率，1.2毫升/小时，用接地的滚轴在针头的正下方20cm处，一定时间后取下内经3mm，壁厚0.2mm，长度5.5cm的丝素蛋白/P(LLA-CL)复合纳米管状支架。

实施例四

称取按照实施例一中制备的丝素蛋白1.0克，溶于10毫升六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(克/毫升)的丝素蛋白溶液；将1.0克P(LLA-CL)溶10毫升六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(克/毫升)的P(LLA-CL)溶液；将两种溶液以体积比50:50，溶质的质量比50:50混合，得到总浓度为10％的混合溶液。将混合溶液进行静电纺丝，纺丝条件：电压，12千伏；电场距离，130毫米；纺丝速率，1.2毫升/小时，得到平均纤维直径为233纳米的复合纳米纤维膜。