利用淡水发光细菌检测铜污染土壤急性毒性的方法

摘要

本发明涉及一种环境监测技术领域的检测方法，具体是一种利用淡水发光细菌检测铜污染土壤急性毒性的方法，该方法克服了海水发光细菌在土壤样品急性毒性检测中应用的局限性。具体方法选用淡水发光细菌作为检测用细菌，包括以下步骤：第一步：用土壤背景溶液制备淡水发光细菌的菌悬液；第二步，采用双室离心法提取土壤孔隙水；第三步，检测土壤样品的毒性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种环境监测技术领域的检测方法，具体是一种利用淡水发光细菌检测铜污染土壤急性毒性的方法。

背景技术

发光细菌与有毒有害物质接触时，发光强度减弱，且发光强度减弱的程度与毒性物质的含量呈一定的相关性。利用发光细菌的这一特性，将其作为指示微生物，以发光强度的变化为指标，来检测环境中有毒有害物质的生物毒性，从而对环境中的污染物质进行监测和污染风险评价。发光细菌如海水发光细菌Vibrio fischer在水环境和土壤环境的样品毒性检测方面已有了一些研究和应用。

但由于在土壤样品中应用时，为了维持一定的渗透压环境，在样品中添加3.5％NaCl溶液，显著改变样品的背景条件，从而影响土壤的毒性检测结果。而且土壤样品的基质较为复杂，将发光细菌应用于土壤样品的毒性检测受到较多因素影响，因此将发光细菌应用于土壤等固相污染物的监测还存在很多问题和困难。利用淡水发光细菌对铜污染的土壤进行毒性检测，对于保障农产品安全生产，保证人类身体健康具有重要的意义。

“青海弧菌”是一种淡水型的发光菌，不需要NaCl就可以正常发光，而且对外界有毒有害物质反应很灵敏。该菌种是世界上唯一由中国学者命名的发光细菌新种。“青海弧菌冻干粉”是我国华东师范大学微生物学科研工作者，取得的从菌种发现、培养，一直到冻干粉的制备一整套技术成果，该技术成果于1999年获得技术专利证书，发明专利号：ZL97106203.X。

发明内容

为了克服现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种利用淡水发光细菌检测铜污染土壤急性毒性的方法，该方法克服了海水发光细菌在土壤样品急性毒性检测中应用的局限性。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：

一种利用淡水发光细菌检测铜污染土壤急性毒性的方法，所述方法选用淡水发光细菌作为检测用细菌，包括以下步骤：

第一步，制备淡水发光细菌的菌悬液，对4℃保存的淡水发光细菌的纯化菌株进行活化和液体培养，用土壤背景溶液制成菌悬液；所述土壤背景溶液为含2.5mMCaCl₂·2H₂O，1.5mM KNO₃，0.6mM Na₂SO₄，3.3mM NH₄NO₃，1.0mM MgSO₄·7H₂O的溶液；

第二步，提取土壤孔隙水，采用双室离心法提取土壤孔隙水，将玻璃纤维置于注射器底部，在注射器中加入待测土壤，向土壤中加入去离子水，当水与土壤充分混匀后，将注射器放入离心管，离心后收集土壤溶液过滤，得到土壤孔隙水；

第三步，检测土壤样品的毒性，将土壤孔隙水加入样品管，在每个样品管中加入所述菌悬液并混匀，15分钟后，用发光仪检测发光值。

所述淡水发光细菌为青海弧菌。

所述青海弧菌为青海弧菌Q67(Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67)。

所述第一步具体操作为：将4℃保存的青海弧菌Q67斜面菌种转接到新鲜斜面上，22℃培养24小时；将新鲜斜面的菌种接种到50ml液体培养基中，22℃振荡培养16～18小时；于4000rpm离心5min，弃去液体培养基，收集菌体；用10ml土壤背景溶液分别清洗菌体2次，每次于4000rpm离心5min，加入土壤背景溶液制成菌悬液，将发光值控制在10⁷RLU/s。

所述第二步具体操作为：将玻璃纤维置于20ml注射器的底部，使注射器底部的小孔被0.5cm厚的玻璃纤维盖住，在注射器中加入30g待测土壤，在注射器中加入去离子水，使土壤含水量达到50cm张力下的土壤含水量；在20℃培养箱中放置24小时，使水分移动到土壤底部。第二天，检查注射器的重量是否减少，如果减少再加入相应的去离子水；将一个用电线导管制成的PVC环放入50ml离心管，将注射器放入离心管中，使注射器的口和离心管的底部分开；在4000rpm离心45分钟，用10ml注射器将离心管中土壤溶液收集，0.45μm过滤于5ml塑料管。

所述第三步包括以下具体操步骤：

1、用加液枪取900μl土壤孔隙水加入发光仪样品管中；

2、在样品管中加入100μl Q67细胞悬液，用加液枪混匀；

3、让样品反应15分钟，在22℃下用发光仪检测发光值。

与现有技术相比，本发明的有益效果表现为：

1、选用淡水发光细菌，具体选用了青海弧菌Q67(Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67)，克服了使用海水细菌的限制；

2、青海弧菌从我国青海湖的青海裸鲤(Gymnocypris przewalskii)体表分离出的一种淡水型发光菌，该细菌具有天然的发光特性，且没有致病性，使用安全；

3、本发明采用的用土壤背景溶液制备菌悬液的方法新颖、操作简单，同时，土壤孔隙水的提取，方法简便；

附图说明

图1为采用“双室离心法”提取土壤孔隙水示意图；

图2为利用青海弧菌Q67测定的Cu的剂量—效应曲线。

具体实施方式

下面结合本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

青海弧菌Q67(Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67)是从我国青海湖的青海裸鲤(Gymnocypris przewalskii)体表分离出的一种淡水型发光菌，该细菌具有天然的发光特性，且没有致病性。因此，将青海弧菌Q67应用于铜污染土壤样品急性毒性检测较海水发光细菌具有较大优势。

本发明是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤：

第一步，发光细菌菌悬液的制备：

发光细菌青海弧菌Q67(Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67)由中国科学院生态环境研究中心提供。对4℃保存的Q67纯化菌株进行活化和液体培养，用土壤背景溶液制成菌悬液。

青海弧菌Q67菌悬液制备：

将4℃保存的Q67斜面菌种转接到新鲜斜面上，22℃培养24小时；将新鲜斜面的菌种接种到50ml液体培养基中，22℃振荡培养16～18小时；于4000rpm离心5

min，弃去液体培养基，收集菌体；用10ml土壤背景溶液分别清洗菌体2次，每次于4000rpm离心5min，加入土壤背景溶液制成菌悬液，将发光值控制在10⁷RLU/s。

第二步，土壤孔隙水的提取：

如图1所示，采用“双室离心法”提取土壤孔隙水6。将玻璃纤维置于注射器1底部，在注射器中加入待测土壤3，在土壤中加入相应的水，当水分充分混匀，将注射器放入离心管2，离心后收集土壤溶液过滤。

土壤孔隙水的提取：

将玻璃纤维4置于20ml注射器的底部，使注射器底部的小孔被0.5cm厚的玻璃纤维盖住，在注射器中加入30g待测土壤，在注射器中加入去离子水，使土壤含水量达到50cm张力下的土壤含水量；在20℃培养箱中放置24小时，使水分移动到土壤底部。第二天，检查注射器的重量是否正确，如果不足再加入相应的去离子水；将一个PVC环5(用电线导管制成)放入50ml离心管，将注射器放入离心管中，使注射器的口和离心管的底部分开(防止撞坏)；在4000rpm离心45分钟(注意离心平衡)，用10ml注射器将离心管中土壤溶液收集，0.45μm过滤于5ml塑料管。

第三步，土壤样品的毒性检测：

将土壤孔隙水加入样品管，在每个样品管中加入青海弧菌菌悬液并混匀，15分钟后用发光仪(BertholdSirius，Berthold公司，德国)检测发光值。

土壤样品的毒性检测：

用加液枪取900μl土壤孔隙水加入发光仪样品管中，每个处理重复3次；

以15秒钟为间隔(用时钟或秒表)，在每个样品管中加入100μl Q67细胞悬液，用加液枪混匀(以适合你的方法建立标准，如吸液和放液10次)；

让样品反应15分钟，用发光仪(Berthold sirius，德国Berthold公司)检测发光值。所有的样品检测都要保证检测样品的时间间隔为15秒，发光值检测在22℃进行。

在完成发光检测后，立即检测样品溶液的pH，并记录结果。

第四步，质量控制：

使用Cu标准系列(0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0，2.0，4.0mg/L，pH6.0)得到质量控制的剂量—效应曲线(见附图2)。

每次检测时使用Cu标准曲线来检查方法的可靠性，即使每次试验细菌的绝对数量和最大发光值不同也要保持相同的EC50(EC50：半数抑制浓度，50％ effectiveconcentration)。

pH的记录：

发光反应在pH 5.0-9.0之间是比较稳定的，待测样品的pH如果超出该范围，pH对细菌的发光会有较大影响。